ప్రస్తుత చిరునామా: కొలోన్ 50931, జర్మనీ, వృద్ధాప్య సంబంధిత వ్యాధులలో సెల్యులార్ ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనపై కొలోన్ ఎక్సలెన్స్ క్లస్టర్ పరిశోధన (CECAD).
మైటోకాన్డ్రియల్ వ్యాధుల యొక్క న్యూరోడీజనరేషన్‌ను తిరిగి పొందలేనిదిగా పరిగణిస్తారు ఎందుకంటే న్యూరాన్‌ల జీవక్రియ ప్లాస్టిసిటీ పరిమితం, కానీ శరీరంలోని న్యూరోనల్ జీవక్రియ యొక్క సెల్ స్వయంప్రతిపత్తిపై మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క ప్రభావం సరిగా అర్థం కాలేదు. ఇక్కడ, అంతరాయం కలిగించిన మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ డైనమిక్స్ వల్ల కలిగే ప్రగతిశీల OXPHOS లోపంతో పుర్కింజే న్యూరాన్‌ల యొక్క సెల్-నిర్దిష్ట ప్రోటీమ్‌ను మేము పరిచయం చేస్తున్నాము. మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ప్రోటీమిక్స్ రంగంలో లోతైన మార్పును ప్రేరేపించిందని, ఇది చివరికి కణ మరణానికి ముందు ఖచ్చితమైన జీవక్రియ కార్యక్రమాల వరుస క్రియాశీలతకు దారితీసిందని మేము కనుగొన్నాము. ఊహించని విధంగా, పైరువేట్ కార్బాక్సిలేస్ (PCx) మరియు TCA చక్రం యొక్క మధ్యవర్తులను భర్తీ చేసే ఇతర యాంటీ-ఏజింగ్ ఎంజైమ్‌ల స్పష్టమైన ప్రేరణను మేము నిర్ణయించాము. PCx ని నిరోధించడం వలన ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి మరియు న్యూరోడీజనరేషన్ తీవ్రతరం అవుతుంది, ఇది OXPHOS లేని న్యూరాన్‌లలో అథెరోస్క్లెరోసిస్ రక్షణ ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుందని సూచిస్తుంది. చివరికి క్షీణించిన న్యూరాన్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ పునరుద్ధరణ ఈ జీవక్రియ లక్షణాలను పూర్తిగా తిప్పికొడుతుంది, తద్వారా కణాల మరణాన్ని నివారిస్తుంది. మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి స్థితిస్థాపకతను అందించే గతంలో తెలియని మార్గాలను మా పరిశోధనలు గుర్తిస్తాయి మరియు వ్యాధి యొక్క చివరి దశలలో కూడా న్యూరోడీజనరేషన్‌ను తిప్పికొట్టవచ్చని చూపిస్తుంది.
నాడీ శక్తి జీవక్రియను నిర్వహించడంలో మైటోకాండ్రియా యొక్క ప్రధాన పాత్ర మానవ మైటోకాన్డ్రియల్ వ్యాధులతో సంబంధం ఉన్న విస్తృతమైన నాడీ సంబంధిత లక్షణాల ద్వారా నొక్కి చెప్పబడింది. ఈ వ్యాధులలో ఎక్కువ భాగం మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యు వ్యక్తీకరణను నియంత్రించే జన్యు ఉత్పరివర్తనలు (1, 2) లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌కు సంబంధించిన జన్యు విధ్వంసం వల్ల సంభవిస్తాయి, ఇవి మైటోకాన్డ్రియల్ DNA (mtDNA) యొక్క స్థిరత్వాన్ని పరోక్షంగా ప్రభావితం చేస్తాయి (3, 4). జంతువుల నమూనాలలో చేసిన పని, చుట్టుపక్కల కణజాలాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి ప్రతిస్పందనగా, సాంప్రదాయిక జీవక్రియ మార్గాలను (5-7) సక్రియం చేయవచ్చని చూపించింది, ఇది ఈ సంక్లిష్ట వ్యాధుల వ్యాధికారకతను లోతుగా అర్థం చేసుకోవడానికి ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, మెదడు మైటోకాన్డ్రియల్ అడెనోసిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (ATP) ఉత్పత్తి యొక్క సాధారణ వైఫల్యం వల్ల కలిగే నిర్దిష్ట కణ రకాల జీవక్రియ మార్పుల గురించి మన అవగాహన ప్రాథమికమైనది (8), వ్యాధిని నివారించడానికి లేదా నిరోధించడానికి ఉపయోగించగల చికిత్సా లక్ష్యాలను గుర్తించాల్సిన అవసరాన్ని నొక్కి చెబుతుంది. న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను నిరోధించండి (9). సమాచారం లేకపోవడం ఏమిటంటే, నాడీ కణాలు చుట్టుపక్కల కణజాలాల కణ రకాలతో పోలిస్తే చాలా పరిమిత జీవక్రియ వశ్యతను కలిగి ఉన్నాయని విస్తృతంగా పరిగణించబడుతున్నాయి (10). సినాప్టిక్ ట్రాన్స్‌మిషన్‌ను ప్రోత్సహించడానికి మరియు గాయం మరియు వ్యాధి పరిస్థితులకు ప్రతిస్పందించడానికి న్యూరాన్‌లకు జీవక్రియల సరఫరాను సమన్వయం చేయడంలో ఈ కణాలు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి కాబట్టి, మెదడు కణజాలం యొక్క సవాలుతో కూడిన పరిస్థితులకు కణ జీవక్రియను స్వీకరించే సామర్థ్యం దాదాపు గ్లియల్ కణాలకే పరిమితం చేయబడింది (11-14). అదనంగా, మెదడు కణజాలం యొక్క స్వాభావిక సెల్యులార్ వైవిధ్యత నిర్దిష్ట న్యూరాన్ ఉప సమూహాలలో సంభవించే జీవక్రియ మార్పుల అధ్యయనాన్ని ఎక్కువగా అడ్డుకుంటుంది. ఫలితంగా, న్యూరాన్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క ఖచ్చితమైన సెల్యులార్ మరియు జీవక్రియ పరిణామాల గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.
మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల కలిగే జీవక్రియ పరిణామాలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మైటోకాన్డ్రియల్ బాహ్య పొర కలయిక (Mfn2) నాశనం వల్ల కలిగే న్యూరోడీజెనరేషన్ యొక్క వివిధ దశలలో మేము పుర్కింజే న్యూరాన్‌లను (PNలు) వేరుచేసాము. మానవులలో Mfn2 ఉత్పరివర్తనలు చార్కోట్-మేరీ-టూత్ రకం 2A (15) అని పిలువబడే వంశపారంపర్య మోటార్ సెన్సరీ న్యూరోపతితో సంబంధం కలిగి ఉన్నప్పటికీ, ఎలుకలలో Mfn2 యొక్క షరతులతో కూడిన విధ్వంసం అనేది ఆక్సీకరణ ఫాస్ఫోరైలేషన్ (OXPHOS) పనిచేయకపోవడం యొక్క బాగా గుర్తించబడిన ప్రేరణ. వివిధ న్యూరానల్ సబ్టైప్‌లు (16-19) మరియు ఫలితంగా వచ్చే న్యూరోడీజెనరేటివ్ ఫినోటైప్ కదలిక రుగ్మతలు (18, 19) లేదా సెరెబెల్లార్ అటాక్సియా (16) వంటి ప్రగతిశీల నాడీ సంబంధిత లక్షణాలతో కూడి ఉంటాయి. లేబుల్-ఫ్రీ క్వాంటిటేటివ్ (LFQ) ప్రోటీమిక్స్, మెటబోలోమిక్స్, ఇమేజింగ్ మరియు వైరోలాజికల్ పద్ధతుల కలయికను ఉపయోగించడం ద్వారా, ప్రగతిశీల న్యూరోడీజెనరేషన్ పైరువేట్ కార్బాక్సిలేస్ (PCx) మరియు PNల ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్‌లో పాల్గొన్న ఇతర కారకాలను బలంగా ప్రేరేపిస్తుందని మేము చూపిస్తాము ఇన్ వివో ఎంజైమ్‌ల వ్యక్తీకరణ. ఈ అన్వేషణ యొక్క ఔచిత్యాన్ని ధృవీకరించడానికి, మేము ప్రత్యేకంగా Mfn2-లోపం ఉన్న PNలలో PCx యొక్క వ్యక్తీకరణను తగ్గించాము మరియు ఈ ఆపరేషన్ ఆక్సీకరణ ఒత్తిడిని తీవ్రతరం చేసి న్యూరోడిజనరేషన్‌ను వేగవంతం చేసిందని కనుగొన్నాము, తద్వారా అజోస్పెర్మియా కణ మరణానికి జీవక్రియ అనుకూలతను అందిస్తుందని నిరూపించింది. MFN2 యొక్క తీవ్రమైన వ్యక్తీకరణ తీవ్రమైన OXPHOS లోపం, మైటోకాన్డ్రియల్ DNA యొక్క భారీ వినియోగం మరియు స్పష్టంగా విరిగిన మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌తో టెర్మినల్ క్షీణత PNని పూర్తిగా రక్షించగలదు, ఇది ఈ రకమైన న్యూరోడిజనరేషన్ కణ మరణానికి ముందు వ్యాధి యొక్క అధునాతన దశలో కూడా కోలుకోగలదని మరింత నొక్కి చెబుతుంది.
Mfn2 నాకౌట్ PNలలో మైటోకాండ్రియాను దృశ్యమానం చేయడానికి, Cre-ఆధారిత మైటోకాండ్రియా పసుపు ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (YFP) (mtYFP) (20) Cre వ్యక్తీకరణను లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి అనుమతించే మౌస్ స్ట్రెయిన్‌ను మేము ఉపయోగించాము మరియు ఇన్ వివోలో మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణాన్ని తనిఖీ చేసాము. PNలలో Mfn2 జన్యువు నాశనం మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ యొక్క క్రమంగా విభజనకు దారితీస్తుందని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి S1A), మరియు తొలి మార్పు 3 వారాల వయస్సులో కనుగొనబడింది. దీనికి విరుద్ధంగా, కాల్బిండిన్ ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కోల్పోవడం ద్వారా రుజువు చేయబడినట్లుగా, PN కణ పొర యొక్క గణనీయమైన క్షీణత 12 వారాల వయస్సు వరకు ప్రారంభం కాలేదు (మూర్తి 1, A మరియు B). మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణంలో తొలి మార్పులు మరియు న్యూరోనల్ మరణం యొక్క కనిపించే ప్రారంభం మధ్య సమయ అసమతుల్యత కణ మరణానికి ముందు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల ప్రేరేపించబడిన జీవక్రియ మార్పులను పరిశోధించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది. YFP (YFP+)-వ్యక్తీకరించే PN (మూర్తి 1C) ను వేరుచేయడానికి మరియు నియంత్రణ ఎలుకలలో (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ను వేరుచేయడానికి మేము ఫ్లోరోసెన్స్-యాక్టివేటెడ్ సెల్ సార్టింగ్ (FACS) ఆధారిత వ్యూహాన్ని అభివృద్ధి చేసాము, దీనిని ఇకపై CTRL (మూర్తి S1B) గా సూచిస్తారు. YFP సిగ్నల్ యొక్క సాపేక్ష తీవ్రత ఆధారంగా గేటింగ్ వ్యూహం యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ PN ల యొక్క YFP+ బాడీ (YFPhigh) ను PNలు కానివి (మూర్తి S1B) లేదా పుటేటివ్ ఫ్లోరోసెంట్ ఆక్సాన్/డెన్డ్రిటిక్ ఫ్రాగ్మెంట్లు (YFPlow; చిత్రం S1D, ఎడమ) నుండి శుద్ధి చేయడానికి అనుమతిస్తుంది, ఇది కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా నిర్ధారించబడింది (మూర్తి S1D, కుడి). వర్గీకరించబడిన జనాభా యొక్క గుర్తింపును ధృవీకరించడానికి, మేము LFQ ప్రోటీమిక్స్ మరియు తరువాత ప్రధాన భాగాల విశ్లేషణను నిర్వహించాము మరియు YFPhigh మరియు YFPneg కణాల మధ్య స్పష్టమైన విభజన ఉందని కనుగొన్నాము (మూర్తి S1C). YFPhigh కణాలు తెలిసిన PNల మార్కర్ల (అంటే Calb1, Pcp2, Grid2 మరియు Itpr3) నికర సుసంపన్నతను చూపించాయి (21, 22), కానీ న్యూరాన్లు లేదా ఇతర కణ రకాల్లో సాధారణంగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీన్ల సుసంపన్నత లేదు (మూర్తి 1D). స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో సేకరించిన వర్గీకరించబడిన YFPhigh కణాలలోని నమూనాల మధ్య పోలిక సహసంబంధ గుణకం 0.9ని చూపించింది, ఇది జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాల మధ్య మంచి పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది (మూర్తి S1E). సారాంశంలో, ఈ డేటా సాధ్యమయ్యే PN యొక్క తీవ్రమైన మరియు నిర్దిష్ట ఐసోలేషన్ కోసం మా ప్రణాళికను ధృవీకరించింది. ఉపయోగించిన L7-cre డ్రైవర్ సిస్టమ్ డెలివరీ తర్వాత మొదటి వారంలో మొజాయిక్ పునఃసంయోగాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది కాబట్టి (23), మేము CTRL మరియు షరతులతో కూడిన (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) నుండి ఎలుకలను తొలగించడం ప్రారంభించాము. న్యూరాన్‌లను సేకరించండి. పునఃసంయోగం పూర్తయిన తర్వాత, దీనిని 4 వారాల వయస్సులో Mfn2cKO అంటారు. ముగింపు బిందువుగా, స్పష్టమైన మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్రాగ్మెంటేషన్ ఉన్నప్పటికీ PN పొర చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు మేము 8 వారాల వయస్సును ఎంచుకున్నాము (మూర్తి 1B మరియు చిత్రం S1A). మొత్తంగా, మేము మొత్తం 3013 ప్రోటీన్‌లను లెక్కించాము, వీటిలో దాదాపు 22% మైటోకాన్డ్రియాల్ ప్రోటీమ్ ఆధారంగా మైటోకార్టా 2.0 ఉల్లేఖనాలపై ఆధారపడి ఉన్నాయి (మూర్తి 1E) (మూర్తి 1E) (24). 8వ వారంలో నిర్వహించిన అవకలన జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ అన్ని ప్రోటీన్లలో 10.5% మాత్రమే గణనీయమైన మార్పులను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది (మూర్తి 1F మరియు చిత్రం S1F), వీటిలో 195 ప్రోటీన్లు తక్కువ-నియంత్రించబడ్డాయి మరియు 120 ప్రోటీన్లు పైకి నియంత్రించబడ్డాయి (మూర్తి 1F). ఈ డేటా సమితి యొక్క "వినూత్న మార్గ విశ్లేషణ" భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువులు ప్రధానంగా నిర్దిష్ట జీవక్రియ మార్గాల యొక్క పరిమితం చేయబడిన సమితికి చెందినవని చూపిస్తుంది (మూర్తి 1G). ఆసక్తికరంగా, OXPHOS మరియు కాల్షియం సిగ్నలింగ్‌కు సంబంధించిన మార్గాల తగ్గింపు ఫ్యూజన్-లోపం ఉన్న PNలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క ప్రేరణను నిర్ధారిస్తున్నప్పటికీ, ప్రధానంగా అమైనో ఆమ్ల జీవక్రియను కలిగి ఉన్న ఇతర వర్గాలు గణనీయంగా నియంత్రించబడతాయి, ఇది మైటోకాన్డ్రియల్ PNలలో సంభవించే జీవక్రియకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. రివైరింగ్ స్థిరంగా ఉంటుంది. పనిచేయకపోవడం.
(ఎ) CTRL మరియు Mfn2cKO ఎలుకల సెరెబెల్లార్ విభాగాల ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ ఛాయాచిత్రాలు PNల ప్రగతిశీల నష్టాన్ని చూపిస్తున్నాయి (కాల్బిండిన్, బూడిద రంగు); న్యూక్లియైలు DAPIతో ప్రతిస్పందించబడ్డాయి. (బి) (ఎ) యొక్క పరిమాణీకరణ (వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ, ***P<0.001; n = మూడు ఎలుకల నుండి 4 నుండి 6 వృత్తాలు). (సి) ప్రయోగాత్మక వర్క్‌ఫ్లో. (డి) పుర్కింజే (పైభాగం) మరియు ఇతర కణ రకాలు (మధ్య) లకు ప్రత్యేకమైన మార్కర్ల హీట్ మ్యాప్ పంపిణీ. (ఇ) వర్గీకరించబడిన PNలో గుర్తించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్ల సంఖ్యను చూపించే వెన్ రేఖాచిత్రం. (ఎఫ్) 8 వారాలలో Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీన్ల అగ్నిపర్వత ప్లాట్ (1.3 యొక్క ప్రాముఖ్యత కట్-ఆఫ్ విలువ). (జి) సృజనాత్మకత మార్గం విశ్లేషణ 8 వారాలుగా వర్గీకరించబడిన Mfn2cKO PNలో ఐదు ముఖ్యమైన అప్-రెగ్యులేషన్ (ఎరుపు) మరియు డౌన్-రెగ్యులేషన్ (నీలం) మార్గాలను చూపిస్తుంది. కనుగొనబడిన ప్రతి ప్రోటీన్ యొక్క సగటు వ్యక్తీకరణ స్థాయి చూపబడింది. గ్రేస్కేల్ హీట్ మ్యాప్: సర్దుబాటు చేయబడిన P విలువ. ns, ముఖ్యమైనది కాదు.
ప్రోటీమిక్స్ డేటా ప్రకారం I, III మరియు IV కాంప్లెక్స్‌ల ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ క్రమంగా తగ్గింది. I, III మరియు IV కాంప్లెక్స్‌లన్నీ ముఖ్యమైన mtDNA-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన సబ్‌యూనిట్‌లను కలిగి ఉన్నాయి, అయితే న్యూక్లియర్-కోడ్ చేయబడిన కాంప్లెక్స్ II ప్రాథమికంగా ప్రభావితం కాలేదు (మూర్తి 2A మరియు మూర్తి S2A). . ప్రోటీమిక్స్ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, సెరెబెల్లార్ టిష్యూ విభాగాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ PNలోని కాంప్లెక్స్ IV యొక్క MTCO1 (మైటోకాన్డ్రియల్ సైటోక్రోమ్ C ఆక్సిడేస్ సబ్యూనిట్ 1) సబ్యూనిట్ స్థాయి క్రమంగా తగ్గిందని చూపించింది (మూర్తి 2B). mtDNA-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన సబ్యూనిట్ Mtatp8 గణనీయంగా తగ్గింది (మూర్తి S2A), అయితే న్యూక్లియర్-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ATP సింథేస్ సబ్యూనిట్ యొక్క స్థిరమైన-స్థితి స్థాయి మారలేదు, ఇది mtDNA వ్యక్తీకరణ స్థిరంగా ఉన్నప్పుడు తెలిసిన స్థిరమైన ATP సింథేస్ సబ్‌అసెంబ్లీ F1 కాంప్లెక్స్‌తో స్థిరంగా ఉంటుంది. నిర్మాణం స్థిరంగా ఉంటుంది. అంతరాయం (7). క్రమబద్ధీకరించబడిన Mfn2cKO PNలలో mtDNA స్థాయిని రియల్-టైమ్ పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (qPCR) ద్వారా మూల్యాంకనం చేయడం వలన mtDNA కాపీ సంఖ్యలో క్రమంగా తగ్గుదల నిర్ధారించబడింది. నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, 8 వారాల వయస్సులో, mtDNA స్థాయిలో దాదాపు 20% మాత్రమే నిలుపుకోబడింది (మూర్తి 2C). ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, Mfn2cKO PNల యొక్క కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ స్టెయినింగ్ DNAని గుర్తించడానికి ఉపయోగించబడింది, ఇది మైటోకాన్డ్రియల్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల సమయ-ఆధారిత వినియోగాన్ని చూపుతుంది (మూర్తి 2D). మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్ క్షీణత మరియు ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలో పాల్గొన్న కొంతమంది అభ్యర్థులు మాత్రమే Lonp1, Afg3l2 మరియు Clpx మరియు OXPHOS కాంప్లెక్స్ అసెంబ్లీ కారకాలతో సహా అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డారని మేము కనుగొన్నాము. అపోప్టోసిస్‌లో పాల్గొన్న ప్రోటీన్ల స్థాయిలలో గణనీయమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు (మూర్తి S2B). అదేవిధంగా, కాల్షియం రవాణాలో పాల్గొన్న మైటోకాండ్రియా మరియు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం ఛానెల్‌లు స్వల్ప మార్పులను మాత్రమే కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి S2C). అదనంగా, ఆటోఫాగి-సంబంధిత ప్రోటీన్ల మూల్యాంకనంలో ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులు కనిపించలేదు, ఇది ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ మరియు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా వివోలో గమనించిన ఆటోఫాగోజోమ్‌ల కనిపించే ప్రేరణకు అనుగుణంగా ఉంటుంది (మూర్తి S3). అయితే, PNలలో ప్రగతిశీల OXPHOS పనిచేయకపోవడం స్పష్టమైన అల్ట్రాస్ట్రక్చరల్ మైటోకాన్డ్రియల్ మార్పులతో కూడి ఉంటుంది. 5 మరియు 8 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO PNల సెల్ బాడీలు మరియు డెన్డ్రిటిక్ చెట్లలో మైటోకాన్డ్రియల్ క్లస్టర్‌లను చూడవచ్చు మరియు లోపలి పొర నిర్మాణం తీవ్ర మార్పులకు గురైంది (మూర్తి S4, A మరియు B). ఈ అల్ట్రాస్ట్రక్చరల్ మార్పులు మరియు mtDNAలో గణనీయమైన తగ్గుదలకు అనుగుణంగా, టెట్రామెథైల్‌రోడమైన్ మిథైల్ ఈస్టర్ (TMRM)తో తీవ్రమైన సెరిబ్రల్ సెరెబెల్లార్ ముక్కల విశ్లేషణ Mfn2cKO PNలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పొర సంభావ్యత గణనీయంగా తగ్గిందని చూపించింది (మూర్తి S4C).
(ఎ) OXPHOS కాంప్లెక్స్ యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయి యొక్క సమయ కోర్సు విశ్లేషణ. 8 వారాలలో P<0.05 ఉన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే పరిగణించండి (టూ-వే ANOVA). చుక్కల రేఖ: CTRL తో పోలిస్తే సర్దుబాటు లేదు. (బి) ఎడమ: యాంటీ-MTCO1 యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ విభాగం యొక్క ఉదాహరణ (స్కేల్ బార్, 20 μm). పుర్కింజే సెల్ బాడీలు ఆక్రమించిన ప్రాంతం పసుపు రంగుతో కప్పబడి ఉంటుంది. కుడి: MTCO1 స్థాయిల పరిమాణీకరణ (వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ; n = మూడు ఎలుకల నుండి విశ్లేషించబడిన 7 నుండి 20 కణాలు). (సి) క్రమబద్ధీకరించబడిన PNలో mtDNA కాపీ సంఖ్య యొక్క qPCR విశ్లేషణ (వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ; n = 3 నుండి 7 ఎలుకలు). (డి) ఎడమ: యాంటీ-DNA యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ స్లైస్ యొక్క ఉదాహరణ (స్కేల్ బార్, 20 μm). పుర్కింజే సెల్ బాడీలు ఆక్రమించిన ప్రాంతం పసుపు రంగుతో కప్పబడి ఉంటుంది. కుడి: mtDNA గాయాల పరిమాణీకరణ (వ్యత్యాసం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ; n = మూడు ఎలుకల నుండి 5 నుండి 9 కణాలు). (E) మొత్తం-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లో mitoYFP + పుర్కింజే కణాలు (బాణం) చూపించే తీవ్రమైన సెరెబెల్లార్ విభాగానికి ఉదాహరణ. (F) IV వక్రత యొక్క పరిమాణీకరణ. (G) CTRL మరియు Mfn2cKO పుర్కింజే కణాలలో డిపోలరైజింగ్ కరెంట్ ఇంజెక్షన్ యొక్క ప్రాతినిధ్య రికార్డింగ్‌లు. టాప్ ట్రేస్: APని ప్రేరేపించిన మొదటి పల్స్. దిగువ ట్రేస్: గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీ. (H) పోస్ట్‌నాప్టిక్ స్పాంటేనియస్ ఇన్‌పుట్‌ల (sPSPలు) పరిమాణీకరణ. ప్రాతినిధ్య రికార్డింగ్ ట్రేస్ మరియు దాని జూమ్ నిష్పత్తి (I)లో చూపబడ్డాయి. వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ మూడు ఎలుకల నుండి n = 5 నుండి 20 కణాలను విశ్లేషించింది. డేటా సగటు ± SEMగా వ్యక్తీకరించబడింది; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) చిల్లులు గల ప్యాచ్ క్లాంప్ మోడ్‌ని ఉపయోగించి రికార్డ్ చేయబడిన స్పాంటేనియస్ AP యొక్క ప్రాతినిధ్య జాడలు. టాప్ ట్రేస్: గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీ. దిగువ ట్రేస్: ఒకే AP యొక్క జూమ్. (K) (J) ప్రకారం సగటు మరియు గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీని లెక్కించండి. మాన్-విట్నీ పరీక్ష; n = 5 కణాలను నాలుగు ఎలుకల నుండి విశ్లేషించారు. డేటా సగటు ± SEM గా వ్యక్తీకరించబడింది; ముఖ్యమైనది కాదు.
8 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO PN లో స్పష్టమైన OXPHOS నష్టం కనుగొనబడింది, ఇది న్యూరాన్ల యొక్క శారీరక పనితీరు తీవ్రంగా అసాధారణంగా ఉందని సూచిస్తుంది. అందువల్ల, మేము 4 నుండి 5 వారాలు మరియు 7 నుండి 8 వారాలలో తీవ్రమైన సెరెబెల్లార్ ముక్కలలో పూర్తి-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లను నిర్వహించడం ద్వారా OXPHOS-లోపం ఉన్న న్యూరాన్‌ల యొక్క నిష్క్రియాత్మక విద్యుత్ లక్షణాలను విశ్లేషించాము (మూర్తి 2E). ఊహించని విధంగా, Mfn2cKO న్యూరాన్‌ల సగటు విశ్రాంతి పొర సంభావ్యత మరియు ఇన్‌పుట్ నిరోధకత నియంత్రణకు సమానంగా ఉన్నాయి, అయినప్పటికీ కణాల మధ్య సూక్ష్మ వ్యత్యాసాలు ఉన్నాయి (టేబుల్ 1). అదేవిధంగా, 4 నుండి 5 వారాల వయస్సులో, ప్రస్తుత-వోల్టేజ్ సంబంధంలో (IV కర్వ్) గణనీయమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు (మూర్తి 2F). అయితే, 7 నుండి 8 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO న్యూరాన్‌లు IV నియమావళి (హైపర్‌పోలరైజేషన్ దశ) నుండి బయటపడలేదు, ఈ చివరి దశలో హైపర్‌పోలరైజేషన్ సంభావ్యతకు స్పష్టమైన సున్నితత్వం ఉందని సూచిస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో, పునరావృత చర్య సంభావ్యత (AP) ఉత్సర్గాలకు కారణమయ్యే డిపోలరైజింగ్ ప్రవాహాలు బాగా తట్టుకోగలవు, వాటి మొత్తం ఉత్సర్గ నమూనాలు 8 వారాల వయస్సు గల నియంత్రణ న్యూరాన్‌ల (టేబుల్ 1 మరియు ఫిగర్ 2G) నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా లేవని సూచిస్తున్నాయి. అదేవిధంగా, స్పాంటేనియస్ పోస్ట్‌నాప్టిక్ కరెంట్‌ల (sPSCలు) ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు వ్యాప్తి నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చదగినవి, మరియు సంఘటనల ఫ్రీక్వెన్సీ 4 వారాల నుండి 5 వారాల నుండి 7 వారాల నుండి 8 వారాల వరకు పెరిగింది, ఇదే విధమైన పెరుగుదలతో (మూర్తి 2, H మరియు I). PNలలో సినాప్టిక్ పరిపక్వత కాలం (25). చిల్లులు గల PNల ప్యాచ్‌ల తర్వాత ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి. ఈ కాన్ఫిగరేషన్ సెల్యులార్ ATP లోపాల యొక్క సాధ్యమైన పరిహారాన్ని నిరోధిస్తుంది, ఇది మొత్తం-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లో జరగవచ్చు. ముఖ్యంగా, Mfn2cKO న్యూరాన్‌ల విశ్రాంతి పొర సంభావ్యత మరియు స్పాంటేనియస్ ఫైరింగ్ ఫ్రీక్వెన్సీ ప్రభావితం కాలేదు (మూర్తి 2, J మరియు K). సారాంశంలో, ఈ ఫలితాలు స్పష్టమైన OXPHOS పనిచేయకపోవడం ఉన్న PNలు అధిక-ఫ్రీక్వెన్సీ ఉత్సర్గ నమూనాలను బాగా ఎదుర్కోగలవని సూచిస్తున్నాయి, ఇవి సాధారణ ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ ప్రతిస్పందనలను నిర్వహించడానికి అనుమతించే పరిహార విధానం ఉందని సూచిస్తున్నాయి.
డేటా సగటు ± SEM (వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ, హోల్మ్-సిడాక్ యొక్క బహుళ పోలిక పరీక్ష; *P<0.05) గా వ్యక్తీకరించబడింది. యూనిట్ సంఖ్య బ్రాకెట్ల ద్వారా సూచించబడుతుంది.
ప్రోటీమిక్స్ డేటాసెట్ (Figure 1G) లోని ఏదైనా వర్గం తీవ్రమైన OXPHOS లోపాన్ని ఎదుర్కోగల మార్గాలను కలిగి ఉందా అని పరిశోధించడానికి మేము బయలుదేరాము, తద్వారా ప్రభావిత PN దాదాపు సాధారణ ఎలక్ట్రోఫిజియాలజీని ఎందుకు నిర్వహించగలదో వివరిస్తుంది (Figure 2, E నుండి K వరకు). . బ్రాంచ్డ్ చైన్ అమైనో ఆమ్లాల (BCAA) ఉత్ప్రేరకంలో పాల్గొన్న ఎంజైమ్‌లు గణనీయంగా నియంత్రించబడ్డాయని ప్రోటీమిక్స్ విశ్లేషణ చూపించింది (Figure 3A మరియు Figure S5A), మరియు తుది ఉత్పత్తి ఎసిటైల్-CoA (CoA) లేదా సక్సినైల్ CoA ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్ యాసిడ్ (TCA) చక్రంలో ట్రైకార్బాక్సిలేట్‌లను భర్తీ చేయగలవు. BCAA ట్రాన్సామినేస్ 1 (BCAT1) మరియు BCAT2 రెండింటి కంటెంట్ పెరిగినట్లు మేము కనుగొన్నాము. అవి α-కీటోగ్లుటరేట్ (26) నుండి గ్లూటామేట్‌ను ఉత్పత్తి చేయడం ద్వారా BCAA ఉత్ప్రేరకం యొక్క మొదటి దశను ఉత్ప్రేరకపరుస్తాయి. బ్రాంచ్డ్ చైన్ కీటో యాసిడ్ డీహైడ్రోజినేస్ (BCKD) కాంప్లెక్స్‌ను తయారు చేసే అన్ని ఉపవిభాగాలు అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడతాయి (ఈ కాంప్లెక్స్ ఫలితంగా వచ్చే BCAA కార్బన్ అస్థిపంజరం యొక్క తదుపరి మరియు తిరిగి మార్చలేని డీకార్బాక్సిలేషన్‌ను ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది) (మూర్తి 3A మరియు చిత్రం S5A). అయితే, క్రమబద్ధీకరించబడిన PNలో BCAAలో స్పష్టమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు, ఇది ఈ ముఖ్యమైన అమైనో ఆమ్లాల సెల్యులార్ తీసుకోవడం పెరగడం లేదా TCA చక్రాన్ని భర్తీ చేయడానికి ఇతర వనరులను (గ్లూకోజ్ లేదా లాక్టిక్ ఆమ్లం) ఉపయోగించడం వల్ల కావచ్చు (మూర్తి S5B). OXPHOS లేని PNలు 8 వారాల వయస్సులో పెరిగిన గ్లూటామైన్ కుళ్ళిపోవడం మరియు ట్రాన్స్‌అమినేషన్ కార్యకలాపాలను కూడా చూపించాయి, ఇది మైటోకాన్డ్రియల్ ఎంజైమ్‌లు గ్లుటామినేస్ (GLS) మరియు గ్లుటామిన్ పైరువేట్ ట్రాన్సామినేస్ 2 (GPT2) యొక్క అప్-రెగ్యులేషన్ ద్వారా ప్రతిబింబిస్తుంది (మూర్తి 3, A మరియు C). GLS యొక్క అప్-రెగ్యులేషన్ స్ప్లైస్డ్ ఐసోఫార్మ్ గ్లూటామినేస్ C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL యొక్క మార్పు సుమారు 4.5 రెట్లు, P = 0.05) కి పరిమితం చేయబడిందని మరియు క్యాన్సర్ కణజాలాలలో దాని నిర్దిష్ట అప్-రెగ్యులేషన్ మైటోకాన్డ్రియల్ బయోఎనర్జీకి మద్దతు ఇవ్వగలదని గమనించాలి. (27).
(ఎ) 8 వారాలలో పేర్కొన్న మార్గంలో ప్రోటీన్ స్థాయిలో మడత మార్పును హీట్ మ్యాప్ చూపిస్తుంది. (బి) యాంటీ-పిసిఎక్స్ యాంటీబాడీ (స్కేల్ బార్, 20 μm) తో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ స్లైస్ యొక్క ఉదాహరణ. పసుపు బాణం పుర్కింజే సెల్ బాడీని సూచిస్తుంది. (సి) అథెరోస్క్లెరోసిస్ (మల్టిపుల్ టి-టెస్ట్, *ఎఫ్‌డిఆర్ <5%; ఎన్ = 3-5 ఎలుకలు) కోసం ముఖ్యమైన అభ్యర్థిగా గుర్తించబడిన టైమ్ కోర్స్ ప్రోటీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణ. (డి) పైన: [1-13C]పైరువేట్ ట్రేసర్‌లో ఉన్న లేబుల్ చేయబడిన కార్బన్‌లోకి ప్రవేశించే వివిధ మార్గాలను చూపించే స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (అంటే, పిడిహెచ్ లేదా ట్రాన్స్-ఆర్టీరియల్ రూట్ ద్వారా). దిగువన: [1-13C]పైరువేట్ (జత చేసిన టి-టెస్ట్; ** పి <0.01) తో అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ ముక్కలను లేబుల్ చేసిన తర్వాత అస్పార్టిక్ ఆమ్లం, సిట్రిక్ ఆమ్లం మరియు మాలిక్ ఆమ్లంగా మార్చబడిన సింగిల్-లేబుల్ చేయబడిన కార్బన్ (M1) శాతాన్ని వయోలిన్ చార్ట్ చూపిస్తుంది. (ఇ) సూచించిన మార్గం యొక్క సమగ్ర సమయ చరిత్ర విశ్లేషణ. 8 వారాలలో P<0.05 ఉన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే పరిగణించండి​
మా విశ్లేషణలో, BCAA క్యాటాబోలిజం కీలకమైన అప్-రెగ్యులేషన్ మార్గాలలో ఒకటిగా మారింది. OXPHOS లేని PNలో TCA చక్రంలోకి ప్రవేశించే వెంటిలేషన్ వాల్యూమ్ మారవచ్చని ఈ వాస్తవం బలంగా సూచిస్తుంది. ఇది న్యూరోనల్ మెటబాలిక్ రివైరింగ్ యొక్క ప్రధాన రూపాన్ని సూచిస్తుంది, ఇది తీవ్రమైన OXPHOS పనిచేయకపోవడం నిర్వహణ సమయంలో న్యూరోనల్ ఫిజియాలజీ మరియు మనుగడపై ప్రత్యక్ష ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. ఈ పరికల్పనకు అనుగుణంగా, ప్రధాన యాంటీ-అథెరోస్క్లెరోటిక్ ఎంజైమ్ PCx అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడిందని మేము కనుగొన్నాము (Mfn2cKO/CTRL సుమారు 1.5 సార్లు మారుతుంది; మూర్తి 3A), ఇది పైరువేట్‌ను ఆక్సలోఅసెటేట్‌గా మార్చడాన్ని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది (28), ఇది మెదడు కణజాలంలో ఉందని నమ్ముతారు. in వ్యక్తీకరణ ఆస్ట్రోసైట్‌లకు పరిమితం చేయబడింది (29, 30). ప్రోటీమిక్స్ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ PCx వ్యక్తీకరణ OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలలో ప్రత్యేకంగా మరియు గణనీయంగా పెరిగిందని చూపించింది, అయితే PCx రియాక్టివిటీ ప్రధానంగా నియంత్రణ యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న బెర్గ్‌మాన్ గ్లియల్ కణాలకు పరిమితం చేయబడింది (మూర్తి 3B). PCx యొక్క గమనించిన అప్‌రెగ్యులేషన్‌ను క్రియాత్మకంగా పరీక్షించడానికి, మేము తీవ్రమైన సెరెబెల్లార్ ముక్కలను [1-13C] పైరువేట్ ట్రేసర్‌తో చికిత్స చేసాము. పైరువేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (PDH) ద్వారా ఆక్సీకరణం చెందినప్పుడు, దాని ఐసోటోప్ లేబుల్ అదృశ్యమైంది, కానీ వాస్కులర్ ప్రతిచర్యల ద్వారా పైరువేట్ జీవక్రియ చేయబడినప్పుడు TCA సైకిల్ ఇంటర్మీడియట్‌లలో చేర్చబడుతుంది (మూర్తి 3D). మా ప్రోటీమిక్స్ డేటాకు మద్దతుగా, Mfn2cKO ముక్కల అస్పార్టిక్ ఆమ్లంలో ఈ ట్రేసర్ నుండి పెద్ద సంఖ్యలో మార్కర్‌లను మేము గమనించాము, అయితే సిట్రిక్ ఆమ్లం మరియు మాలిక్ ఆమ్లం కూడా మితమైన ధోరణిని కలిగి ఉన్నాయి, అయినప్పటికీ ముఖ్యమైనవి కావు (మూర్తి 3D).
డోపమైన్ న్యూరాన్లు మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ A జన్యువు (Tfam) ను ప్రత్యేకంగా నాశనం చేయడం వల్ల కలిగే మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ఉన్న మిటోపార్క్ ఎలుకల డోపమైన్ న్యూరాన్లలో (Figure S6B), PCx వ్యక్తీకరణ కూడా గణనీయంగా నియంత్రించబడింది (31), ఇది అసిటోన్ యాసిడ్ ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్ శరీరంలోని న్యూరానల్ OXPHOS పనిచేయకపోవడం సమయంలో వ్యాధి సంభవించడం నియంత్రించబడుతుందని సూచిస్తుంది. ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్‌తో సంబంధం ఉన్న న్యూరాన్‌లలో వ్యక్తీకరించబడే ప్రత్యేకమైన ఎంజైమ్‌లు (32-34) OXPHOS లేని PNలలో గణనీయంగా నియంత్రించబడతాయని కనుగొనబడింది, ప్రొపియోనిల్-CoA కార్బాక్సిలేస్ (PCC-A), మాలోనిల్-CoA ప్రొపియోనిల్-CoA ను సక్సినైల్-CoA గా మారుస్తుంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ మాలిక్ ఎంజైమ్ 3 (ME3), దీని ప్రధాన పాత్ర మలేట్ నుండి పైరువేట్‌ను తిరిగి పొందడం (మూర్తి 3, A మరియు C) (33, 35). అదనంగా, Pdk3 ఎంజైమ్‌లో గణనీయమైన పెరుగుదలను మేము కనుగొన్నాము, ఇది ఫాస్ఫోరైలేట్ చేస్తుంది మరియు తద్వారా PDH ని నిష్క్రియం చేస్తుంది (36), అయితే PDH లేదా PDH ఎంజైమ్ కాంప్లెక్స్‌ను సక్రియం చేసే Pdp1 ఎంజైమ్‌లో ఎటువంటి మార్పులు కనుగొనబడలేదు (మూర్తి 3A). స్థిరంగా, Mern2cKO PNలలో, Ser293లోని PDH కాంప్లెక్స్‌లోని పైరువేట్ డీహైడ్రోజినేస్ E1 భాగం యొక్క α1 సబ్యూనిట్ α (PDHE1α) సబ్యూనిట్ యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్ (మూర్తి S6C) (మూర్తి S6C) మెరుగుపరచబడింది. పైరువేట్‌కు వాస్కులర్ యాక్సెస్ లేదు.
చివరగా, సెరైన్ మరియు గ్లైసిన్ బయోసింథసిస్ యొక్క సూపర్ పాత్‌వే, సంబంధిత మైటోకాన్డ్రియల్ ఫోలేట్ (1C) సైకిల్ మరియు ప్రోలిన్ బయోసింథసిస్ (మూర్తి 1G మరియు చిత్రం S5C) అన్నీ యాక్టివేషన్ ప్రక్రియలో గణనీయంగా పైకి నియంత్రించబడుతున్నాయని మేము కనుగొన్నాము. చుట్టుపక్కల కణజాలాలు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం (5-7) తో సక్రియం చేయబడతాయి. ఈ ప్రోటీమిక్స్ డేటాను సమర్ధించే కాన్ఫోకల్ విశ్లేషణ, OXPHOS లేని PNలో, 8 వారాల వయస్సు గల ఎలుకల సెరెబెల్లార్ ముక్కలు మైటోకాన్డ్రియల్ ఫోలేట్ చక్రం యొక్క కీలక ఎంజైమ్ అయిన సెరైన్ హైడ్రాక్సీమీథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ 2 (SHMT2) కు గురయ్యాయని చూపించింది. గణనీయమైన రోగనిరోధక ప్రతిస్పందన (మూర్తి S5D). 13 CU-గ్లూకోజ్-ఇంక్యుబేటెడ్ అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లలో, మెటబాలిక్ ట్రేసింగ్ ప్రయోగాలు సెరైన్ మరియు ప్రోలిన్ బయోసింథసిస్ యొక్క పైకి నియంత్రించడాన్ని మరింత ధృవీకరించాయి, ఇది కార్బన్ ఐసోఫామ్‌లను సెరైన్ మరియు ప్రోలిన్‌లోకి ప్రవహించడాన్ని సూచిస్తుంది (మూర్తి S5E). GLS మరియు GPT2 ద్వారా ప్రోత్సహించబడిన ప్రతిచర్యలు గ్లూటామైన్ నుండి గ్లూటామేట్ సంశ్లేషణకు మరియు గ్లూటామేట్ మరియు α-కీటోగ్లుటరేట్ మధ్య ట్రాన్స్‌మినేషన్‌కు కారణమవుతాయి కాబట్టి, వాటి అప్‌రెగ్యులేషన్ OXPHOS-లోపం ఉన్న న్యూరాన్‌లకు గ్లూటామేట్ కోసం పెరిగిన డిమాండ్ ఉందని సూచిస్తుంది, ఇది ప్రోలిన్ యొక్క పెరిగిన బయోసింథసిస్‌ను నిర్వహించడం లక్ష్యంగా ఉండవచ్చు (మూర్తి S5C). ఈ మార్పులకు విరుద్ధంగా, PN-నిర్దిష్ట Mfn2cKO ఎలుకల నుండి సెరెబెల్లార్ ఆస్ట్రోసైట్‌ల యొక్క ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ ఈ మార్గాలు (అన్ని యాంటీపెరాక్సిడేస్‌లతో సహా) వ్యక్తీకరణలో గణనీయంగా మారలేదని చూపించింది, తద్వారా ఈ జీవక్రియ దారి మళ్లింపు క్షీణించిన PNకి ఎంపిక చేయబడింది (మూర్తి S6, D నుండి G వరకు).
సారాంశంలో, ఈ విశ్లేషణలు PNలలో నిర్దిష్ట జీవక్రియ మార్గాల యొక్క తాత్కాలిక క్రియాశీలత యొక్క గణనీయంగా భిన్నమైన నమూనాలను వెల్లడించాయి. అసాధారణమైన న్యూరానల్ మైటోకాన్డ్రియల్ ఫంక్షన్ ప్రారంభ అథెరోస్క్లెరోసిస్ మరియు 1C పునర్నిర్మాణానికి దారితీయవచ్చు (మూర్తి 3E మరియు చిత్రం S5C), మరియు I మరియు IV కాంప్లెక్స్‌ల వ్యక్తీకరణలో ఊహించదగిన మార్పులకు కూడా దారితీసినప్పటికీ, సెరైన్ డి నోవో సంశ్లేషణలో మార్పులు చివరి దశలలో మాత్రమే స్పష్టంగా కనిపించాయి. OXPHOS పనిచేయకపోవడం (మూర్తి 3E మరియు చిత్రం S5C). ఈ పరిశోధనలు TCA చక్రంలో అథెరోస్క్లెరోసిస్ పెరుగుదలతో ఒత్తిడి-ప్రేరిత మైటోకాన్డ్రియల్ (1C చక్రం) మరియు సైటోప్లాస్మిక్ (సెరైన్ బయోసింథసిస్) సినర్జిస్టిక్‌గా స్పందించే ఒక వరుస ప్రక్రియను నిర్వచించాయి, దీనిలో న్యూరోనల్ జీవక్రియను పునర్నిర్మించడానికి.
8 వారాల వయస్సు గల OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలు అధిక-ఫ్రీక్వెన్సీ ఉత్తేజిత కార్యకలాపాలను నిర్వహించగలవు మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని భర్తీ చేయడానికి గణనీయమైన జీవక్రియ పునఃసంయోగానికి లోనవుతాయి. ఈ ఆవిష్కరణ ఈ సమయంలో కూడా, ఈ కణాలు న్యూరోడీజనరేషన్‌ను ఆలస్యం చేయడానికి లేదా నిరోధించడానికి చికిత్సా జోక్యాన్ని కూడా పొందవచ్చనే ఆసక్తికరమైన అవకాశాన్ని లేవనెత్తుతుంది. ఆలస్యంగా. మేము రెండు స్వతంత్ర జోక్యాల ద్వారా ఈ అవకాశాన్ని పరిష్కరించాము. మొదటి పద్ధతిలో, మేము Cre-ఆధారిత అడెనో-అసోసియేటెడ్ వైరస్ (AAV) వెక్టర్‌ను రూపొందించాము, తద్వారా MFN2ను OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలలో ఇన్ వివోలో ఎంపిక చేసి వ్యక్తీకరించవచ్చు (మూర్తి S7A). AAV ఎన్‌కోడింగ్ MFN2 మరియు ఫ్లోరోసెంట్ రిపోర్టర్ జన్యువు mCherry (Mfn2-AAV) ఇన్ విట్రోలో ప్రాథమిక న్యూరాన్ సంస్కృతులలో ధృవీకరించబడ్డాయి, ఇది MFN2ను Cre-ఆధారిత పద్ధతిలో వ్యక్తీకరించడానికి కారణమైంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణ శాస్త్రాన్ని రక్షించింది, తద్వారా Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో న్యూరోమ్యుటేషన్‌ను నిరోధించింది (మూర్తి S7, B, D మరియు E). తరువాత, 8 వారాల వయసున్న Mfn2-AAV ని Mfn2cKO యొక్క సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్ కు స్టీరియోటాక్టికల్ గా అందించడానికి మరియు ఎలుకలను నియంత్రించడానికి మేము ఇన్ వివో ప్రయోగాలు నిర్వహించాము మరియు 12 వారాల వయసున్న ఎలుకలను విశ్లేషించాము (మూర్తి 4A). చికిత్స పొందిన Mfn2cKO ఎలుకలు చనిపోయాయి (మూర్తి 1, A మరియు B) (16). వైరల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ ఇన్ వివో ఫలితంగా కొన్ని సెరెబెల్లార్ సర్కిల్‌లలో PN యొక్క ఎంపిక వ్యక్తీకరణ జరిగింది (మూర్తి S7, G మరియు H). mCherry (Ctrl-AAV) ను మాత్రమే వ్యక్తీకరించే కంట్రోల్ AAV యొక్క ఇంజెక్షన్ Mfn2cKO జంతువులలో న్యూరోడిజనరేషన్ స్థాయిపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు. దీనికి విరుద్ధంగా, Mfn2-AAV తో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన Mfn2cKO ల విశ్లేషణ PN సెల్ పొర యొక్క గణనీయమైన రక్షణ ప్రభావాన్ని చూపించింది (మూర్తి 4, B మరియు C). ముఖ్యంగా, న్యూరాన్ సాంద్రత నియంత్రణ జంతువుల నుండి దాదాపుగా వేరు చేయలేనిదిగా కనిపిస్తుంది (మూర్తి 4, B మరియు C, మరియు చిత్రం S7, H మరియు I). MFN2 కాని MFN1 యొక్క వ్యక్తీకరణ న్యూరోనల్ మరణాన్ని కాపాడటంలో సమానంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది (మూర్తి 4C మరియు చిత్రం S7, C మరియు F), ఇది ఎక్టోపిక్ MFN1 యొక్క వ్యక్తీకరణ MFN2 లేకపోవడాన్ని సమర్థవంతంగా భర్తీ చేయగలదని సూచిస్తుంది. సింగిల్ PN స్థాయిలో మరింత విశ్లేషణలో Mfn2-AAV మైటోకాండ్రియా యొక్క అల్ట్రాస్ట్రక్చర్‌ను ఎక్కువగా రక్షించిందని, mtDNA స్థాయిలను సాధారణీకరించిందని మరియు యాంటీ-యాంజియోజెనిసిస్ మార్కర్ PCx (మూర్తి 4, C నుండి E వరకు) యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను తిప్పికొట్టిందని చూపించింది. విశ్రాంతి స్థితిలో రక్షించబడిన Mfn2cKO ఎలుకల దృశ్య తనిఖీలో వాటి భంగిమ మరియు మోటారు లక్షణాలు (కదలిక S1 నుండి S3 వరకు) మెరుగుపడ్డాయని తేలింది. ముగింపులో, OXPHOSలో తీవ్రంగా లోపం ఉన్న PNలలోకి MFN2 యొక్క ఆలస్యమైన పునఃప్రవేశం mtDNA వినియోగాన్ని తిప్పికొట్టడానికి మరియు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి సరిపోతుందని, తద్వారా ఆక్సాన్ క్షీణత మరియు న్యూరానల్ మరణాన్ని ఇన్ వివోలో నివారిస్తుందని ఈ ప్రయోగాలు చూపిస్తున్నాయి.
(A) సూచించబడిన జీవక్రియ మార్గం సక్రియం చేయబడినప్పుడు AAV ఎన్‌కోడింగ్ MFN2 కోసం ప్రయోగాత్మక షెడ్యూల్‌ను చూపించే పథకం. (B) Mfn2cKO ఎలుకలలో 8 వారాలలో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన మరియు యాంటీ-కాల్బిండిన్ యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన 12 వారాల వయస్సు గల సెరెబెల్లార్ ముక్కల యొక్క ప్రాతినిధ్య కాన్ఫోకల్ చిత్రాలు. కుడి: ఆక్సాన్ ఫైబర్‌ల స్కేలింగ్. ఆక్సాన్ జూమ్ యొక్క స్కేల్ 450 మరియు 75 μm. (C) ఎడమ: AAV ట్రాన్స్‌డక్షన్ లూప్ (AAV+)లో పుర్కింజే సెల్ సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (వ్యత్యాసం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ; n = 3 ఎలుకలు). కుడి: 12వ వారంలో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన PNలో mtDNA ఫోకస్ విశ్లేషణ (జత చేయని t-పరీక్ష; n = మూడు ఎలుకల నుండి 6 కణాలు). * P <0.05; ** P <0.01. (D) సూచించబడిన వైరల్ వెక్టర్‌లతో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన Mfn2cKO సెరెబెల్లార్ విభాగాల PNల ప్రాతినిధ్య ప్రసార ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు. గులాబీ రంగు ముసుగు డెండ్రైట్‌లు ఆక్రమించిన ప్రాంతాన్ని వివరిస్తుంది మరియు పసుపు చుక్కల చతురస్రం కుడి వైపున అందించబడిన జూమ్‌ను వివరిస్తుంది; n కేంద్రకాన్ని సూచిస్తుంది. స్కేల్ బార్, 1μm. (E) 12 వారాలలో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన PNలో PCx స్టెయినింగ్ యొక్క ఉదాహరణను చూపిస్తుంది. స్కేల్ బార్, 20μm. OE, ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్; FC, ఫోల్డ్ మార్పు.
చివరగా, OXPHOS పనిచేయకపోవడం వల్ల కలిగే PNలలో పెరాక్సిడేస్-ప్రేరిత కణాల మనుగడ యొక్క ప్రాముఖ్యతను మేము పరిశోధించాము. మేము ప్రత్యేకంగా మౌస్ PCx mRNA (AAV-shPCx) ను లక్ష్యంగా చేసుకుని mCherry ఎన్‌కోడింగ్ AAV-shRNA (షార్ట్ హెయిర్‌పిన్ RNA) ను ఉత్పత్తి చేసాము మరియు వైరస్ లేదా దాని స్క్రాంబుల్డ్ కంట్రోల్ (AAV-scr) ను Mfn2cKO ఎలుకల సెరెబెల్లమ్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేసాము. PCx వ్యక్తీకరణ పెరిగిన (Figure 3C) మరియు PN సెల్ పొర ఇంకా చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న కాలంలో ప్రభావవంతమైన PCx నాక్‌డౌన్‌ను సాధించడానికి ఇంజెక్షన్ వయస్సు యొక్క నాల్గవ వారంలో (Figure 5A) నిర్వహించబడింది (Figure 1A). PCx (Figure S8A) ను నాక్ డౌన్ చేయడం వలన PN మరణం గణనీయంగా త్వరణం అవుతుందని గమనించాలి, ఇది సోకిన రింగ్‌కు పరిమితం చేయబడింది (Figure 5, B మరియు C). PCx అప్-రెగ్యులేషన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన జీవక్రియ ప్రభావాల యంత్రాంగాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి, PCx నాక్‌డౌన్ మరియు AAV-మధ్యవర్తిత్వ ఆప్టికల్ బయోసెన్సర్ Grx1-roGFP2 ఏకకాలంలో వ్యక్తీకరించబడిన తర్వాత PNల యొక్క రెడాక్స్ స్థితిని మేము అధ్యయనం చేసాము (మూర్తి S8, B నుండి D వరకు) గ్లూటాతియోన్‌ను అంచనా వేయడానికి పెప్టైడ్ రెడాక్స్ పొటెన్షియల్ యొక్క సాపేక్ష మార్పు (38). అప్పుడు, FLIM పరిస్థితులను ధృవీకరించిన తర్వాత సైటోప్లాస్మిక్ రెడాక్స్ స్థితిలో సంభావ్య మార్పులను గుర్తించడానికి 7 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO లేదా కంట్రోల్ లిట్టర్‌మేట్‌ల యొక్క తీవ్రమైన మెదడు ముక్కలలో మేము రెండు-ఫోటాన్ ఫ్లోరోసెన్స్ లైఫ్‌టైమ్ ఇమేజింగ్ మైక్రోస్కోపీ (FLIM)ని నిర్వహించాము (మూర్తి S8, E నుండి G వరకు). PCx వ్యక్తీకరణ లేని ఒకే Mfn2cKO PNల ఆక్సీకరణ స్థితిలో విశ్లేషణ గణనీయమైన పెరుగుదలను చూపించింది, ఇది స్క్రాంబుల్డ్ shRNAని మాత్రమే వ్యక్తీకరించే కంట్రోల్ న్యూరాన్‌లు లేదా Mfn2cKO PNల నుండి భిన్నంగా ఉంటుంది (మూర్తి 5, D మరియు E). PCx వ్యక్తీకరణను తగ్గించినప్పుడు, అధిక ఆక్సీకరణ స్థితిని చూపించే Mfn2cKO PNల శాతం మూడు రెట్లు ఎక్కువ పెరిగింది (మూర్తి 5E), ఇది PCx అప్-రెగ్యులేషన్ క్షీణించిన న్యూరాన్ల రెడాక్స్ సామర్థ్యాన్ని నిర్వహిస్తుందని సూచిస్తుంది.
(ఎ) సూచించబడిన జీవక్రియ మార్గం సక్రియం చేయబడినప్పుడు AAV ఎన్‌కోడింగ్ shPCx ఇంజెక్ట్ చేయడానికి ప్రయోగాత్మక షెడ్యూల్‌ను చూపించే పథకం. (బి) 4 వారాలలో యాంటీ-కాల్సినూరిన్ యాంటీబాడీతో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన మరియు లేబుల్ చేయబడిన Mfn2cKO ఎలుకలలోని 8 వారాల వయస్సు గల సెరెబెల్లార్ విభాగాల ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ ఛాయాచిత్రాలు. స్కేల్ బార్, 450μm. (సి) AAV-ట్రాన్స్‌డ్యూస్డ్ లూప్‌లలో పుర్కింజే సెల్ సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (వ్యత్యాసం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ; n = 3 నుండి 4 ఎలుకలు). డేటా సగటు ± SEMగా వ్యక్తీకరించబడింది; ***P<0.001. (డి) ప్రతినిధి FLIM చిత్రం పేర్కొన్న ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులలో గ్లూటాతియోన్ రెడాక్స్ సెన్సార్ Grx1-roGFP2ని వ్యక్తీకరించే 7 వారాల వయస్సు గల PN యొక్క సగటు జీవిత కాలాన్ని చూపుతుంది. LUT (లుక్-అప్ టేబుల్) నిష్పత్తి: మనుగడ సమయ విరామం (పికోసెకన్లలో). స్కేల్ బార్, 25μm. (E) హిస్టోగ్రాం (D) (n=158 నుండి 368 కణాల వరకు రెండు ఎలుకలలోని ప్రతి పరిస్థితిలో Grx1-roGFP2 జీవితకాల విలువల పంపిణీని చూపిస్తుంది. ప్రతి హిస్టోగ్రాం పైన ఉన్న పై చార్ట్: గణనీయంగా పొడవైన (ఎరుపు, ఆక్సిడైజ్డ్) లేదా తక్కువ (నీలం, తగ్గిన) జీవితకాల విలువలు కలిగిన కణాల సంఖ్యను చూపుతుంది, ఇవి CTRL-AAV-scrలో సగటు జీవితకాల విలువలో 1 SDని మించిపోయాయి. (F) ప్రతిపాదిత నమూనా న్యూరోనల్ PCx యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్ యొక్క రక్షిత ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.
మొత్తం మీద, మేము ఇక్కడ అందించే డేటా ప్రకారం, MFN2 యొక్క పునః వ్యక్తీకరణ తీవ్రమైన OXPHOS లోపం, తీవ్రమైన mtDNA క్షీణత మరియు చాలా అసాధారణమైన ఇస్టా లాంటి పదనిర్మాణ శాస్త్రంతో అధునాతన PNని పూర్తిగా రక్షించగలదని, తద్వారా అధునాతన వ్యాధులలో కూడా నిరంతర పురోగతిని అందిస్తుంది. న్యూరోడిజెనరేషన్ కణ మరణానికి ముందు దశ యొక్క రివర్సిబుల్ ఆధారాలను అందిస్తుంది. ఈ స్థాయి జీవక్రియ వశ్యత అథెరోస్క్లెరోసిస్ (TCA చక్రం యొక్క రివైరింగ్) ను ప్రేరేపించే న్యూరాన్ల సామర్థ్యం ద్వారా మరింత నొక్కి చెప్పబడింది, ఇది OXPHOS లేని PNలలో PCx వ్యక్తీకరణను నిరోధిస్తుంది మరియు కణ మరణాన్ని పెంచుతుంది, తద్వారా రక్షణ పాత్ర పోషిస్తుంది (మూర్తి 5F).
ఈ అధ్యయనంలో, OXPHOS పనిచేయకపోవడానికి PNల ప్రతిస్పందన క్రమంగా జీవక్రియ కార్యక్రమాల ద్వారా సక్రియం చేయబడిన అవకలన క్రియాశీలత మార్గం ద్వారా TCA సైకిల్ అథెరోస్క్లెరోసిస్‌కు కలుస్తుందని మేము ఆధారాలను అందించాము. ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణను అనేక పరిపూరకరమైన పద్ధతులతో మేము ధృవీకరించాము మరియు తీవ్రమైన మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ద్వారా సవాలు చేయబడినప్పుడు, న్యూరాన్లు గతంలో తెలియని జీవక్రియ స్థితిస్థాపకతను కలిగి ఉన్నాయని వెల్లడించాము. మా ఆశ్చర్యానికి, మొత్తం రివైరింగ్ ప్రక్రియ తప్పనిసరిగా న్యూరోడిజనరేషన్‌తో పాటుగా ఉండే టెర్మినల్ జీవక్రియ స్థితిని గుర్తించదు, కానీ మా డేటా కణ మరణానికి ముందు దశలో కూడా ఇది నిర్వహణ న్యూరాన్‌ను ఏర్పరుస్తుందని సూచిస్తుంది. ఫంక్షనల్ పరిహార యంత్రాంగం. ఈ పరిశోధన న్యూరాన్లు శరీరంలో గణనీయమైన స్థాయిలో జీవక్రియ ప్లాస్టిసిటీని కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తుంది. MFN2 యొక్క తరువాతి పునఃప్రవేశం కీలక జీవక్రియ గుర్తుల వ్యక్తీకరణను తిప్పికొట్టగలదని మరియు PN క్షీణతను నిరోధించగలదని ఈ వాస్తవం రుజువు చేస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, ఇది అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు నరాలను వేగవంతం చేస్తుంది. లింగమార్పిడి.
మా పరిశోధనలో అత్యంత ఆకర్షణీయమైన ఫలితాలలో ఒకటి, OXPHOS లేని PNలు ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రత్యేకంగా ప్రేరేపించే ఎంజైమ్‌లను నియంత్రించడం ద్వారా TCA సైకిల్ జీవక్రియను సవరించగలవు. జీవక్రియ పునర్వ్యవస్థీకరణ అనేది క్యాన్సర్ కణాల యొక్క ఒక సాధారణ లక్షణం, వీటిలో కొన్ని TCA సైకిల్ ఇంటర్మీడియట్‌లను భర్తీ చేయడానికి గ్లూటామైన్‌పై ఆధారపడతాయి, ఇవి తగ్గించే సమానమైన వాటిని ఉత్పత్తి చేస్తాయి, ఇవి శ్వాసకోశ గొలుసును నడిపిస్తాయి మరియు లిపిడ్ మరియు న్యూక్లియోటైడ్ బయోసింథసిస్ పూర్వగాముల ఉత్పత్తిని నిర్వహిస్తాయి (39, 40). ఇటీవలి అధ్యయనం ప్రకారం OXPHOS పనిచేయకపోవడాన్ని ఎదుర్కొంటున్న పరిధీయ కణజాలాలలో, గ్లూటామైన్/గ్లుటామేట్ జీవక్రియ యొక్క పునఃసంయోగం కూడా ఒక ప్రముఖ లక్షణం (5, 41), ఇక్కడ TCA చక్రంలోకి గ్లూటామైన్ ప్రవేశ దిశ ఆధారపడి ఉంటుంది OXPHOS గాయం యొక్క తీవ్రత కారణంగా (41). అయితే, శరీరంలో న్యూరోనల్ మెటబాలిక్ ప్లాస్టిసిటీ యొక్క ఏదైనా సారూప్యత మరియు వ్యాధి సందర్భంలో దాని సంభావ్య ఔచిత్యంపై స్పష్టమైన ఆధారాలు లేవు. ఇటీవలి ఇన్ విట్రో అధ్యయనంలో, ప్రాథమిక కార్టికల్ న్యూరాన్లు న్యూరోట్రాన్స్మిషన్ కోసం గ్లూటామేట్ పూల్‌లను సమీకరిస్తాయని చూపబడింది, తద్వారా జీవక్రియ ఒత్తిడి పరిస్థితులలో ఆక్సీకరణ జీవక్రియ మరియు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తాయి (42). TCA సైకిల్ ఎంజైమ్ సక్సినేట్ డీహైడ్రోజినేస్ యొక్క ఫార్మకోలాజికల్ ఇన్హిబిషన్ కింద, పైరువేట్ కార్బాక్సిలేషన్ కల్చర్డ్ సెరెబెల్లార్ గ్రాన్యూల్ న్యూరాన్లలో ఆక్సలోఅసిటేట్ సంశ్లేషణను నిర్వహిస్తుందని నమ్ముతారు (34). అయితే, మెదడు కణజాలానికి ఈ విధానాల యొక్క శారీరక ఔచిత్యం (ఎథెరోస్క్లెరోసిస్ ప్రధానంగా ఆస్ట్రోసైట్‌లకు పరిమితం చేయబడిందని నమ్ముతారు) ఇప్పటికీ ముఖ్యమైన శారీరక ప్రాముఖ్యతను కలిగి ఉంది (43). ఈ సందర్భంలో, శరీరంలో OXPHOS ద్వారా దెబ్బతిన్న PN లను BCAA క్షీణత మరియు పైరువేట్ కార్బాక్సిలేషన్‌కు మార్చవచ్చని మా డేటా చూపిస్తుంది, ఇవి TCA పూల్ ఇంటర్మీడియట్‌ల అనుబంధానికి రెండు ప్రధాన వనరులు. న్యూరోనల్ ఎనర్జీ మెటబాలిజంకు BCAA క్యాటాబోలిజం యొక్క సంభావ్య సహకారం ప్రతిపాదించబడినప్పటికీ, న్యూరోట్రాన్స్మిషన్ కోసం గ్లూటామేట్ మరియు GABA పాత్రతో పాటు (44), వివోలో ఈ విధానాలకు ఇప్పటికీ ఎటువంటి ఆధారాలు లేవు. అందువల్ల, పనిచేయని PN లు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను పెంచడం ద్వారా సమీకరణ ప్రక్రియ ద్వారా నడిచే TCA ఇంటర్మీడియట్‌ల వినియోగాన్ని స్వయంచాలకంగా భర్తీ చేయగలవని ఊహించడం సులభం. ముఖ్యంగా, అస్పార్టిక్ ఆమ్లం కోసం పెరిగిన డిమాండ్‌ను నిర్వహించడానికి PCx యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్ అవసరం కావచ్చు, ఇది మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ఉన్న కణాల విస్తరణలో సూచించబడింది (45). అయితే, మా జీవక్రియ విశ్లేషణ Mfn2cKO PNలలో అస్పార్టిక్ ఆమ్లం యొక్క స్థిరమైన-స్థితి స్థాయిలో ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులను వెల్లడించలేదు (చిత్రం S6A), ఇది బహుశా విస్తరించే కణాలు మరియు పోస్ట్-మైటోటిక్ న్యూరాన్‌ల మధ్య అస్పార్టిక్ ఆమ్లం యొక్క విభిన్న జీవక్రియ వినియోగాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. ఇన్ వివో పనిచేయని న్యూరాన్‌లలో PCx అప్‌రెగ్యులేషన్ యొక్క ఖచ్చితమైన యంత్రాంగం ఇంకా వర్గీకరించబడాల్సి ఉన్నప్పటికీ, ఈ అకాల ప్రతిస్పందన న్యూరాన్‌ల యొక్క రెడాక్స్ స్థితిని నిర్వహించడంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని మేము నిరూపించాము, ఇది సెరెబెల్లార్ ముక్కలపై FLIM ప్రయోగాలలో ప్రదర్శించబడింది. ముఖ్యంగా, PCx ని అప్‌రెగ్యులేట్ చేయకుండా PN లను నిరోధించడం మరింత ఆక్సీకరణ స్థితికి దారితీస్తుంది మరియు కణ మరణాన్ని వేగవంతం చేస్తుంది. BCAA క్షీణత యొక్క క్రియాశీలత మరియు పైరువేట్ యొక్క కార్బాక్సిలేషన్ మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క పరిధీయ కణజాలాలను వర్గీకరించడానికి మార్గాలు కాదు (7). అందువల్ల, అవి OXPHOS- లోపం ఉన్న న్యూరాన్ల యొక్క ప్రాధాన్యత లక్షణంగా కనిపిస్తాయి, న్యూరోడీజెనరేషన్‌కు ముఖ్యమైన ఏకైక లక్షణం కాకపోయినా. .
సెరెబెల్లార్ వ్యాధి అనేది ఒక వైవిధ్యమైన న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధి, ఇది సాధారణంగా అటాక్సియాగా వ్యక్తమవుతుంది మరియు తరచుగా PNలను దెబ్బతీస్తుంది (46). ఈ న్యూరాన్ జనాభా ముఖ్యంగా మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి గురవుతుంది ఎందుకంటే ఎలుకలలో వాటి ఎంపిక క్షీణత మానవ స్పినోసెరెబెల్లార్ అటాక్సియాను వర్ణించే అనేక మోటారు లక్షణాలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి సరిపోతుంది (16, 47, 48). నివేదికల ప్రకారం, ఉత్పరివర్తన చెందిన జన్యువుతో ట్రాన్స్‌జెనిక్ మౌస్ మోడల్ మానవ స్పినోసెరెబెల్లార్ అటాక్సియాతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం (49, 50), PNPHలో OXPHOS లోపం యొక్క పరిణామాలను అధ్యయనం చేయడం యొక్క ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది. అందువల్ల, ఈ ప్రత్యేకమైన న్యూరాన్ జనాభాను సమర్థవంతంగా వేరుచేసి అధ్యయనం చేయడం చాలా అనుకూలంగా ఉంటుంది. అయితే, PNలు ఒత్తిడికి చాలా సున్నితంగా ఉంటాయి మరియు మొత్తం సెరెబెల్లార్ కణ జనాభాలో తక్కువ నిష్పత్తిని కలిగి ఉంటాయి కాబట్టి, అనేక ఓమిక్స్-ఆధారిత అధ్యయనాలకు, వాటిని మొత్తం కణాలుగా ఎంపిక చేయడం ఇప్పటికీ ఒక సవాలుగా ఉన్న అంశం. ఇతర కణ రకాల (ముఖ్యంగా వయోజన కణజాలాల) కాలుష్యం పూర్తిగా లేకపోవడం దాదాపు అసాధ్యం అయినప్పటికీ, దిగువ ప్రోటీమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం తగినంత సంఖ్యలో ఆచరణీయ న్యూరాన్‌లను పొందడానికి మేము FACSతో ప్రభావవంతమైన విచ్ఛేదన దశను కలిపాము మరియు మొత్తం సెరెబెల్లమ్ యొక్క ప్రస్తుత డేటా సెట్‌తో పోలిస్తే చాలా ఎక్కువ ప్రోటీన్ కవరేజ్ (సుమారు 3000 ప్రోటీన్లు) కలిగి ఉన్నాము (51). మొత్తం కణాల సాధ్యతను కాపాడటం ద్వారా, మేము ఇక్కడ అందించే పద్ధతి మైటోకాండ్రియాలోని జీవక్రియ మార్గాల్లోని మార్పులను తనిఖీ చేయడానికి మాత్రమే కాకుండా, దాని సైటోప్లాస్మిక్ ప్రతిరూపాలలో మార్పులను కూడా తనిఖీ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది, ఇది కణ రకాన్ని సుసంపన్నం చేయడానికి మైటోకాన్డ్రియాల్ మెమ్బ్రేన్ ట్యాగ్‌ల వాడకాన్ని పూర్తి చేస్తుంది. సంక్లిష్ట కణజాలాలలో మైటోకాండ్రియా సంఖ్యకు కొత్త పద్ధతి (52, 53). మేము వివరించే పద్ధతి పుర్కింజే కణాల అధ్యయనానికి సంబంధించినది మాత్రమే కాదు, మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క ఇతర నమూనాలతో సహా వ్యాధిగ్రస్తులైన మెదడుల్లో జీవక్రియ మార్పులను పరిష్కరించడానికి ఏ రకమైన కణానికైనా సులభంగా వర్తించవచ్చు.
చివరగా, ఈ జీవక్రియ పునర్వ్యవస్థీకరణ ప్రక్రియలో సెల్యులార్ ఒత్తిడి యొక్క కీలక సంకేతాలను పూర్తిగా తిప్పికొట్టగల మరియు న్యూరోనల్ క్షీణతను నిరోధించగల చికిత్సా విండోను మేము గుర్తించాము. అందువల్ల, ఇక్కడ వివరించిన రివైరింగ్ యొక్క క్రియాత్మక చిక్కులను అర్థం చేసుకోవడం వలన మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం సమయంలో న్యూరోనల్ సాధ్యతను నిర్వహించడానికి సాధ్యమయ్యే చికిత్సలపై ప్రాథమిక అంతర్దృష్టులు అందించవచ్చు. ఇతర మెదడు కణ రకాల్లో శక్తి జీవక్రియలో మార్పులను విడదీయడం లక్ష్యంగా భవిష్యత్తు పరిశోధన ఇతర నాడీ సంబంధిత వ్యాధులకు ఈ సూత్రం యొక్క వర్తనీయతను పూర్తిగా వెల్లడించడానికి అవసరం.
మిటోపార్క్ ఎలుకలను గతంలో (31) వర్ణించారు. loxP పార్శ్వ Mfn2 జన్యువులతో C57BL/6N ఎలుకలను గతంలో (18) వర్ణించారు మరియు L7-Cre ఎలుకలతో (23) సంకరం చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన డబుల్ హెటెరోజైగస్ సంతానాన్ని హోమోజైగస్ Mfn2loxP/Mfn2loxP ఎలుకలతో సంకరం చేశారు, తద్వారా Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) కోసం పుర్కింజె-నిర్దిష్ట జన్యు నాకౌట్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తారు. సంభోగం యొక్క ఉపసమితిలో, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP యుగ్మ వికల్పం (stop-mtYFP) అదనపు క్రాసింగ్‌ల ద్వారా ప్రవేశపెట్టబడింది (20). అన్ని జంతు విధానాలు యూరోపియన్, జాతీయ మరియు సంస్థాగత మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు జర్మనీలోని నార్త్ రైన్-వెస్ట్‌ఫాలియాలోని ఉమ్‌వెల్ట్ మరియు వెర్బ్రాచెర్‌షుట్జ్‌కు చెందిన లాండెసామ్‌ట్‌ఫర్‌నాటర్ ఆమోదించాయి. జంతు పని యూరోపియన్ ఫెడరేషన్ ఆఫ్ లాబొరేటరీ యానిమల్ సైన్సెస్ అసోసియేషన్ల మార్గదర్శకత్వాన్ని కూడా అనుసరిస్తుంది.
గర్భిణీ స్త్రీ గర్భాశయ తొలగుటను మత్తుమందు ఇచ్చిన తర్వాత, ఎలుక పిండాన్ని వేరు చేస్తారు (E13). హాంక్స్ బ్యాలెన్స్‌డ్ సాల్ట్ సొల్యూషన్ (HBSS)లో 10 mM హెప్స్‌తో అనుబంధంగా కార్టెక్స్‌ను విచ్ఛేదనం చేసి, పాపైన్ (20 U/ml) మరియు సిస్టీన్ (1μg/ml) కలిగిన డల్బెకోస్ మోడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియంపైకి పంపారు. DMEMలో కణజాలాన్ని పొదిగించి, ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియ ద్వారా దానిని విడదీస్తారు. Ml) 37°C వద్ద 20 నిమిషాలు, ఆపై 10% పిండం బోవిన్ సీరంతో అనుబంధంగా DMEMలో యాంత్రికంగా మిల్లింగ్ చేస్తారు. 6 సెం.మీ కల్చర్ డిష్‌కు 2×106 సాంద్రతతో లేదా ఇమేజింగ్ విశ్లేషణ కోసం 0.5×105 కణాలు/సెం.మీ2 సాంద్రతతో పాలీలైసిన్‌తో పూత పూసిన గాజు కవర్‌లిప్‌లపై కణాలను సీడ్ చేశారు. 4 గంటల తర్వాత, మాధ్యమాన్ని 1% B27 సప్లిమెంట్ మరియు 0.5 mM గ్లూటామాక్స్ కలిగిన న్యూరోబాసల్ సీరం-రహిత మాధ్యమంతో భర్తీ చేశారు. ఆ తరువాత ప్రయోగం అంతటా న్యూరాన్‌లను 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద నిర్వహించి, వారానికి ఒకసారి తినిపించారు. ఇన్ విట్రోలో పునఃసంయోగాన్ని ప్రేరేపించడానికి, కింది AAV9 వైరస్ వెక్టర్ యొక్క 3μl (24-బావి కల్చర్ డిష్) లేదా 0.5μl (24-బావి ప్లేట్)ను రెండవ రోజు ఇన్ విట్రోలో న్యూరాన్‌లకు చికిత్స చేయడానికి ఉపయోగించారు: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (యాడ్‌జీన్, కేటలాగ్ నంబర్ 105530-AAV9) మరియు AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (యాడ్‌జీన్, కేటలాగ్ నంబర్ 105545-AAV9).
మౌస్ Mfn1 మరియు Mfn2 పరిపూరక DNA (వరుసగా యాడ్జీన్ ప్లాస్మిడ్ #23212 మరియు #23213 నుండి పొందబడ్డాయి) C-టెర్మినస్ వద్ద V5 సీక్వెన్స్ (GKPIPNPLLGLDST) తో గుర్తించబడ్డాయి మరియు T2A సీక్వెన్స్ ద్వారా ఫ్రేమ్‌లో mCherry తో కలిసిపోయాయి. Grx1-roGFP2 అనేది హైడెల్బర్గ్ TP డిక్ DFKZ (డ్యూచెస్ క్రెబ్స్ఫోర్స్‌చంగ్స్‌జెంట్రమ్) నుండి వచ్చిన బహుమతి. సాంప్రదాయ క్లోనింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి tdTomato క్యాసెట్‌ను భర్తీ చేయడం ద్వారా, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 మరియు pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 వెక్టర్‌లను ఉత్పత్తి చేయడానికి క్యాసెట్‌ను pAAV-CAG-FLEX-tdTomato బ్యాక్‌బోన్ (యాడ్‌జీన్ రిఫరెన్స్ నంబర్ 28306)లోకి సబ్‌క్లోన్ చేశారు. నియంత్రణ వెక్టర్ pAAV-CAG-FLEX-mCherryని ఉత్పత్తి చేయడానికి ఇలాంటి వ్యూహాన్ని ఉపయోగించారు. AAV-shPCx నిర్మాణాన్ని ఉత్పత్తి చేయడానికి, ప్లాస్మిడ్ AAV వెక్టర్ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) అవసరం, ఇది shRNA టార్గెటింగ్ మౌస్ PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ను ఎన్కోడ్ చేసే DNA క్రమాన్ని కలిగి ఉంటుంది. U6 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో, mCherry CMV ప్రమోటర్ నియంత్రణలో ఉపయోగించబడుతుంది. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం (సెల్ బయోలాబ్స్) సహాయక AAV వెక్టర్ల ఉత్పత్తి జరిగింది. సంక్షిప్తంగా, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) లను మోసే బదిలీ ప్లాస్మిడ్‌ను తాత్కాలికంగా ఉపయోగించండి. 293AAV కణాలు-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) లేదా Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) కోడింగ్ జన్యువు యొక్క బదిలీ, అలాగే AAV1 క్యాప్సిడ్ ప్రోటీన్ మరియు అనుబంధ ప్రోటీన్‌ను కోడింగ్ చేయడం. కాల్షియం ఫాస్ఫేట్ పద్ధతిని ఉపయోగించి ప్లాస్మిడ్ ప్లాస్మిడ్ ప్యాకేజింగ్. ముడి వైరస్ సూపర్‌నాటెంట్‌ను పొడి మంచు/ఇథనాల్ స్నానంలో ఫ్రీజ్-థా సైకిల్స్ ద్వారా మరియు ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS)లో లైస్డ్ కణాల ద్వారా పొందారు. AAV వెక్టర్‌ను నిరంతరాయ అయోడిక్సానాల్ గ్రేడియంట్ అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూగేషన్ (32,000 rpm మరియు 4°C వద్ద 24 గంటలు) ద్వారా శుద్ధి చేశారు మరియు అమికాన్ అల్ట్రా-15 సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్‌ని ఉపయోగించి కేంద్రీకరించారు. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 జీనోమ్ కాపీ (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX యొక్క జీనోమ్ టైటర్ గతంలో వివరించిన విధంగా ఉంది (54), రియల్-టైమ్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) మరియు AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ద్వారా కొలుస్తారు.
ఐస్-కోల్డ్ 1x PBSలో ప్రాథమిక న్యూరాన్‌లను స్క్రాప్ చేసి, గుళికలుగా చేసి, ఆపై ఫాస్ఫేటేస్ మరియు ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ (రోచె) కలిగిన 0.5% ట్రైటాన్ X-100 / 0.5% సోడియం డియోక్సికోలేట్/PBS లైసిస్ బఫర్‌లో సజాతీయపరచారు. బిసిన్‌చోనినిక్ యాసిడ్ అస్సే (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ క్వాంటిఫికేషన్ నిర్వహించబడింది. తర్వాత ప్రోటీన్‌లను SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా వేరు చేసి, ఆపై పాలీవినైలిడిన్ ఫ్లోరైడ్ పొర (GE హెల్త్‌కేర్)పై బ్లాట్ చేశారు. నాన్-స్పెసిఫిక్ సైట్‌లను బ్లాక్ చేసి, TBSTలో 5% పాలలో (ట్వీన్‌తో ట్రిస్-బఫర్డ్ సెలైన్), వాషింగ్ స్టెప్స్ మరియు TBST ఇంక్యుబేట్‌లో సెకండరీ యాంటీబాడీలో ప్రైమరీ యాంటీబాడీతో (వివరాల కోసం టేబుల్ S1 చూడండి) ఇంక్యుబేట్ చేయండి. +4°C వద్ద రాత్రిపూట ప్రైమరీ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేయండి. కడిగిన తర్వాత, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటలు సెకండరీ యాంటీబాడీని అప్లై చేయండి. తదనంతరం, యాంటీ-β-ఆక్టిన్ యాంటీబాడీతో అదే బ్లాట్‌ను ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా, అదే లోడింగ్ నిర్ధారించబడింది. కెమిలుమినిసెన్స్‌గా మార్చడం మరియు కెమిలుమినిసెన్స్‌ను పెంచడం ద్వారా గుర్తించడం (GE హెల్త్‌కేర్).
గతంలో గాజు కవర్‌లిప్‌లపై సీడ్ చేసిన న్యూరాన్‌లను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పేర్కొన్న సమయ బిందువు వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 4% పారాఫార్మల్డిహైడ్ (PFA)/PBSతో స్థిరపరిచారు. కవర్‌లిప్‌లను మొదట గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాల పాటు 0.1% ట్రైటాన్ X-100/PBSతో చొచ్చుకుపోయి, ఆపై బ్లాకింగ్ బఫర్‌లో [3% బోవిన్ సీరం అల్బుమిన్ (BSA)/PBS] చేస్తారు. రెండవ రోజు, కవర్‌లిప్‌లను బ్లాకింగ్ బఫర్‌తో కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు తగిన ఫ్లోరోఫోర్-కంజుగేటెడ్ సెకండరీ యాంటీబాడీతో పొదిగించారు; చివరగా, నమూనాలను PBSలో 4′,6-డయామిడినో-2 -ఫెనిలిండోల్ (DAPI)తో పూర్తిగా కడిగి, ఆపై ఆక్వా-పాలీ/మౌంట్‌తో మైక్రోస్కోప్ స్లైడ్‌లో స్థిరపరిచారు.
ఎలుకలకు (మగ మరియు ఆడ) కెటామైన్ (130 mg/kg) మరియు జిలాజైన్ (10 mg/kg) ఇంట్రాపెరిటోనియల్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా మత్తుమందు ఇవ్వబడింది మరియు కార్ప్రోఫెన్ అనాల్జేసిక్ (5 mg/kg) తో సబ్కటానియస్‌గా ఇవ్వబడింది మరియు వెచ్చని ప్యాడ్‌తో కూడిన స్టీరియోటాక్టిక్ ఇన్స్ట్రుమెంట్ (Kopf) లో ఉంచబడింది. పుర్రెను బహిర్గతం చేసి, మిస్ ఎముకకు సంబంధించిన సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్ భాగాన్ని సన్నగా చేయడానికి డెంటల్ డ్రిల్‌ను ఉపయోగించండి (లాంబ్డా నుండి: తోక 1.8, పార్శ్వ 1, లోబుల్స్ IV మరియు V కి అనుగుణంగా ఉంటుంది). దిగువ వాస్కులేచర్‌కు అంతరాయం కలగకుండా ఉండటానికి పుర్రెలో ఒక చిన్న రంధ్రం జాగ్రత్తగా సృష్టించడానికి వంపుతిరిగిన సిరంజి సూదిని ఉపయోగించండి. తరువాత సన్నని గాజు కేశనాళికను నెమ్మదిగా మైక్రో-హోల్‌లోకి (డ్యూరా మేటర్ యొక్క వెంట్రల్ వైపున -1.3 నుండి -1 వరకు) చొప్పించబడుతుంది మరియు 200 నుండి 300 nl AAVని 10 నుండి 20 నిమిషాల వ్యవధిలో తక్కువ పీడనం వద్ద మాన్యువల్ సిరంజిలతో (నారిషిగే) మైక్రో-ఇంజెక్టర్ (నారిషిగే)లోకి అనేకసార్లు ఇంజెక్ట్ చేస్తారు. ఇన్ఫ్యూషన్ తర్వాత, వైరస్ పూర్తిగా వ్యాప్తి చెందడానికి కేశనాళికను మరో 10 నిమిషాలు ఉంచండి. కేశనాళికలను ఉపసంహరించుకున్న తర్వాత, గాయం వాపును తగ్గించడానికి మరియు జంతువు కోలుకోవడానికి చర్మాన్ని జాగ్రత్తగా కుట్టిస్తారు. ఆపరేషన్ తర్వాత చాలా రోజులు జంతువులకు అనాల్జెసిక్స్ (కాస్పోఫెన్) తో చికిత్స అందించారు, ఈ సమయంలో వాటి శారీరక స్థితిని జాగ్రత్తగా పర్యవేక్షించారు మరియు పేర్కొన్న సమయంలో వాటిని అనాయాసంగా మార్చారు. అన్ని విధానాలు యూరోపియన్, జాతీయ మరియు సంస్థాగత మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు జర్మనీలోని నార్త్ రైన్-వెస్ట్‌ఫాలియాలోని ఉమ్‌వెల్ట్ మరియు వెర్బ్రాచెర్‌షుట్జ్‌కు చెందిన లాండెసామ్‌ట్‌ఫర్‌నాటర్ ఆమోదించారు.
జంతువులకు కెటామైన్ (100 mg/kg) మరియు జిలాజైన్ (10 mg/kg) తో మత్తుమందు ఇచ్చారు, మరియు గుండెను మొదట 0.1 M PBS తో, తరువాత PBS లో 4% PFA తో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు. కణజాలాన్ని విచ్ఛేదనం చేసి రాత్రిపూట 4°C వద్ద 4% PFA/PBS లో స్థిరపరిచారు. PBS లో స్థిర మెదడు నుండి సాగిట్టల్ విభాగాలను (50 μm మందం) సిద్ధం చేయడానికి వైబ్రేటింగ్ కత్తి (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) ఉపయోగించబడింది. వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే, పైన వివరించిన విధంగా (13) గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద మరియు కదిలించడం వద్ద స్వేచ్ఛగా తేలియాడే విభాగాల మరకలు వేయబడ్డాయి. సంక్షిప్తంగా, మొదట, పొందిన ముక్కలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 15 నిమిషాలు 0.5% ట్రైటాన్ X-100/PBS తో పారగమ్యపరచారు; కొన్ని ఎపిటోప్‌లకు (Pcx మరియు Shmt2), 80°C (PH 9) వద్ద ట్రిస్-EDTA బఫర్ ద్వారా ఈ దశకు బదులుగా ముక్కలను 25 నిమిషాలు వేడి చేయండి. తరువాత, విభాగాలను బ్లాకింగ్ బఫర్ (3% BSA/PBS)లో రాత్రిపూట 4°C వద్ద కదిలించడం ద్వారా ప్రాథమిక యాంటీబాడీతో (టేబుల్ S1 చూడండి) ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మరుసటి రోజు, విభాగాలను బ్లాకింగ్ బఫర్‌తో కడిగి, తగిన ఫ్లోరోఫోర్-కంజుగేటెడ్ సెకండరీ యాంటీబాడీతో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు; చివరగా, విభాగాలను PBSలో పూర్తిగా కడిగి, DAPIతో కౌంటర్-స్టెయిన్ చేసి, ఆపై మైక్రోస్కోప్ స్లైడ్‌లో AquaPolymountతో పరిష్కరించారు.
తెల్లని కాంతి లేజర్ మరియు 405 డయోడ్ అతినీలలోహిత లేజర్‌తో కూడిన లేజర్ స్కానింగ్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (TCS SP8-X లేదా TCS డిజిటల్ లైట్ షీట్, లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) నమూనాను చిత్రించడానికి ఉపయోగించబడింది. ఫ్లోరోఫోర్‌ను ఉత్తేజపరచడం ద్వారా మరియు హైబ్రిడ్ డిటెక్టర్ (HyDs)తో సిగ్నల్‌ను సేకరించడం ద్వారా, LAS-X సాఫ్ట్‌వేర్ నైక్విస్ట్ నమూనాకు అనుగుణంగా ఉన్న స్టాక్ చేయబడిన చిత్రాలను సీక్వెన్షియల్ మోడ్‌లో సేకరించడానికి ఉపయోగించబడింది: నాన్-క్వాంటిటేటివ్ ప్యానెల్‌ల కోసం, ఇది అత్యంత డైనమిక్ సిగ్నల్స్ (ఉదాహరణకు, సోమాటిక్ సెల్స్ మరియు డెండ్రైట్‌లలో) mtYFP) BrightR మోడ్‌లో PNల సంఖ్యను గుర్తించడానికి HyDని ఉపయోగించండి). నేపథ్యాన్ని తగ్గించడానికి 0.3 నుండి 6 ns వరకు గేటింగ్ వర్తించబడుతుంది.
క్రమబద్ధీకరించబడిన కణాల నిజ-సమయ ఇమేజింగ్. 1% B27 సప్లిమెంట్ మరియు 0.5 mM గ్లూటామాక్స్ కలిగిన న్యూరోబాసల్-ఎ మాధ్యమంలో క్రమబద్ధీకరించిన తర్వాత, కణాలను వెంటనే పాలీ-ఎల్-లైసిన్-కోటెడ్ గ్లాస్ స్లైడ్‌లపై (μ-స్లయిడ్8 వెల్, ఇబిడి, కేటలాగ్ నంబర్ 80826) సీడ్ చేసి, ఆపై కణాలు స్థిరపడటానికి 1 గంట పాటు 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద ఉంచండి. తెల్లటి లేజర్, HyD, 63×[1.4 సంఖ్యా ద్వారం (NA)] ఆయిల్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ మరియు తాపన దశతో కూడిన లైకా SP8 లేజర్ స్కానింగ్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌లో రియల్-సమయ ఇమేజింగ్ ప్రదర్శించబడింది.
ఎలుకను త్వరగా కార్బన్ డయాక్సైడ్‌తో మత్తుమందు చేసి శిరచ్ఛేదం చేశారు, మెదడును పుర్రె నుండి త్వరగా తొలగించి, 200μm మందంతో (13C లేబులింగ్ ప్రయోగానికి) లేదా 275μm మందంతో (రెండు ఫోటాన్ ప్రయోగాలకు) సాగిట్టల్ విభాగంలోకి కత్తిరించారు. ఐస్ క్రీం (HM-650 V, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్‌డార్ఫ్, జర్మనీ) కింది పదార్థాలతో నిండి ఉంది: 125 mM మంచు-చల్లని, కార్బన్-సంతృప్త (95% O2 మరియు 5% CO2) తక్కువ Ca2 + కృత్రిమ సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవం (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25 mM NaHCO3, 25 mM గ్లూకోజ్, 0.5 mM CaCl2 మరియు 3.5 mM MgCl2 (310 నుండి 330 mmol వరకు ఆస్మాటిక్ పీడనం). పొందిన మెదడు ముక్కలను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 2.0 mM MgCl2) మీడియం) pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mmol) కలిగిన ప్రీ-ఇంక్యుబేషన్ చాంబర్‌కు బదిలీ చేయండి.
ఇమేజింగ్ ప్రక్రియలో, స్లైస్‌లను ఒక ప్రత్యేక ఇమేజింగ్ గదిలోకి తరలించారు మరియు 32° నుండి 33°C వరకు స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిరంతర ACSF పెర్ఫ్యూజన్ కింద ఈ ప్రయోగం జరిగింది. స్లైస్ ఇమేజింగ్ కోసం లైకా 25x ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (NA 0.95, నీరు), Ti: సఫైర్ లేజర్ (ఛమేలియన్ విజన్ II, కోహెరెంట్)తో కూడిన మల్టీఫోటాన్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (TCS SP8 MP-OPO, లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించబడింది. FLIM మాడ్యూల్ (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 యొక్క FLIM. PNల యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ రెడాక్స్ స్థితిలో మార్పులను సాగిట్టల్ మెదడు ముక్కలలో రెండు-ఫోటాన్ FLIM ద్వారా కొలుస్తారు, ఇక్కడ Grx1-roGFP2 బయోసెన్సర్ PNలను లక్ష్యంగా చేసుకుంది. PN పొరలో, ఆచరణీయమైన PN (అంటే, పూసల నిర్మాణం లేకపోవడం లేదా డెండ్రైట్‌ల వెంట న్యూరానల్ పదనిర్మాణ మార్పులు) మరియు డబుల్ పాజిటివ్ roGFP2 సెన్సార్ మరియు AAV ఎన్‌కోడింగ్ shRNA PCx లేదా దాని నియంత్రణ క్రమం (ప్రతి ఒక్కటి mCherryని సహ-వ్యక్తీకరించడం) ఉండేలా చూసుకోవడానికి స్లైస్ ఉపరితలం నుండి 50 నుండి 80 μm దిగువన అక్విజిషన్ ఫీల్డ్ ఎంపిక చేయబడుతుంది. 2x డిజిటల్ జూమ్‌తో సింగిల్-స్టాక్ చిత్రాలను సేకరించండి [ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యం: 890 nm; 512 nm 512 పిక్సెల్స్]. గుర్తింపు: అంతర్గత HyD, ఫ్లోరోసెసిన్ ఐసోథియోసైనేట్ (FITC) ఫిల్టర్ గ్రూప్] మరియు 2 నుండి 3 నిమిషాలలోపు ఇమేజ్ సగటును ఉపయోగించి కర్వ్ ఫిట్టింగ్ కోసం తగినంత ఫోటాన్లు (మొత్తం 1000 ఫోటాన్లు) సేకరించబడ్డాయని నిర్ధారించుకుంటారు. పెర్ఫ్యూజన్ ACSFకి బాహ్య 10 mM H2O2ని జోడించేటప్పుడు (ఆక్సీకరణను పెంచడానికి, జీవితకాలం పెరుగుతుంది), ఆపై 2 mM డైథియోథ్రెయిటాల్‌ను జోడించేటప్పుడు roGFP2 యొక్క జీవితకాలం విలువను పర్యవేక్షించడం ద్వారా Grx1-roGFP2 ప్రోబ్ యొక్క సున్నితత్వం మరియు FLIM పరిస్థితుల ధృవీకరణ నిర్వహించబడ్డాయి (తగ్గింపు స్థాయిని తగ్గిస్తుంది, జీవితకాలం తగ్గుతుంది) (చిత్రం S8, D నుండి G వరకు). పొందిన ఫలితాలను విశ్లేషించడానికి FLIMfit 5.1.1 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి, మొత్తం చిత్రం యొక్క సింగిల్ ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ డికే కర్వ్‌ను కొలిచిన IRF (ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ రెస్పాన్స్ ఫంక్షన్)కి అమర్చండి మరియు χ2 సుమారు 1. ఒకే PN జీవితకాలాన్ని లెక్కించడానికి, నరాల శరీరం చుట్టూ ఉన్న మాస్క్‌ను మాన్యువల్‌గా గీస్తారు మరియు ప్రతి మాస్క్‌లోని సగటు జీవితకాలం పరిమాణీకరణ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది.
మైటోకాన్డ్రియల్ పొటెన్షియల్ విశ్లేషణ. అక్యూట్ సెక్షన్‌ను పెర్ఫ్యూజ్డ్ ACSFకి నేరుగా జోడించిన 100 nM TMRMతో 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసిన తర్వాత, PNల యొక్క మైటోకాన్డ్రియల్ పొటెన్షియల్ మార్పులను టూ-ఫోటాన్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా కొలుస్తారు. 920 nm వద్ద ప్రోబ్‌ను ఉత్తేజపరచడం ద్వారా మరియు అంతర్గత HyD (టెట్రామెథైల్‌రోడమైన్ ఐసోథియోసైనేట్: 585/40 nm) ఉపయోగించి సిగ్నల్‌లను సేకరించడం ద్వారా TMRM ఇమేజింగ్ నిర్వహించబడింది; అదే ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యాన్ని ఉపయోగించి కానీ mtYFPని ఇమేజ్ చేయడానికి వేరే అంతర్గత HyD (FITC :525/50)ని ఉపయోగించడం ద్వారా. సింగిల్ సెల్ స్థాయిలో మైటోకాన్డ్రియల్ పొటెన్షియల్‌ను అంచనా వేయడానికి ImageJ యొక్క ఇమేజ్ కాలిక్యులేటర్ ప్లగ్-ఇన్‌ని ఉపయోగించండి. సంక్షిప్తంగా, ప్లగ్-ఇన్ సమీకరణం: సిగ్నల్ = min (mtYFP, TMRM) సంబంధిత ఛానెల్ యొక్క సింగిల్-స్టాక్ కన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లో పుర్కింజే సోమాలిలో TMRM సిగ్నల్‌ను చూపించే మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రాంతాన్ని గుర్తించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది. తరువాత ఫలిత మాస్క్‌లోని పిక్సెల్ ప్రాంతాన్ని లెక్కించి, ఆపై మైటోకాన్డ్రియల్ సంభావ్యతను చూపించే మైటోకాన్డ్రియల్ భిన్నాన్ని పొందడానికి mtYFP ఛానెల్ యొక్క సంబంధిత థ్రెషోల్డ్ సింగిల్-స్టాక్ ఇమేజ్‌పై సాధారణీకరించబడుతుంది.
ఈ చిత్రాన్ని హ్యూజెన్స్ ప్రో (సైంటిఫిక్ వాల్యూమ్ ఇమేజింగ్) సాఫ్ట్‌వేర్‌తో డీకన్వోల్యూట్ చేశారు. టైల్స్ యొక్క స్కాన్ చేసిన చిత్రాల కోసం, LAS-X సాఫ్ట్‌వేర్ అందించిన ఆటోమేటిక్ స్టిచింగ్ అల్గోరిథం ఉపయోగించి ఒకే టైల్ యొక్క మాంటేజ్ తయారు చేయబడుతుంది. ఇమేజ్ క్రమాంకనం తర్వాత, ఇమేజ్‌ను మరింత ప్రాసెస్ చేయడానికి మరియు బ్రైట్‌నెస్ మరియు కాంట్రాస్ట్‌ను ఏకరీతిలో సర్దుబాటు చేయడానికి ImageJ మరియు Adobe Photoshopలను ఉపయోగించండి. గ్రాఫిక్ తయారీ కోసం Adobe Illustratorని ఉపయోగించండి.
mtDNA ఫోకస్ విశ్లేషణ. కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా DNA కి వ్యతిరేకంగా యాంటీబాడీలతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ విభాగాలపై mtDNA గాయాల సంఖ్యను లెక్కించారు. ప్రతి లక్ష్య ప్రాంతం సెల్ బాడీ మరియు ప్రతి కణం యొక్క న్యూక్లియస్ కోసం సృష్టించబడింది మరియు సంబంధిత ప్రాంతాన్ని మల్టీ మెజర్ ప్లగ్-ఇన్ (ఇమేజ్‌జె సాఫ్ట్‌వేర్) ఉపయోగించి లెక్కించారు. సైటోప్లాస్మిక్ ప్రాంతాన్ని పొందడానికి సెల్ బాడీ ప్రాంతం నుండి న్యూక్లియర్ ప్రాంతాన్ని తీసివేయండి. చివరగా, థ్రెషోల్డ్ ఇమేజ్‌పై mtDNAని సూచించే సైటోప్లాస్మిక్ DNA పాయింట్లను స్వయంచాలకంగా లెక్కించడానికి అనలైజ్ పార్టికల్స్ ప్లగ్-ఇన్ (ఇమేజ్‌జె సాఫ్ట్‌వేర్) ఉపయోగించబడింది మరియు పొందిన ఫలితాలు CTRL ఎలుకల PN సగటుకు సాధారణీకరించబడ్డాయి. ఫలితాలు ప్రతి సెల్‌కు సగటు న్యూక్లియోసైడ్‌ల సంఖ్యగా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి.
ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ. సింగిల్ సెల్ స్థాయిలో PNలో ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణను అంచనా వేయడానికి ImageJ యొక్క ఇమేజ్ కాలిక్యులేటర్ ప్లగ్-ఇన్‌ని ఉపయోగించండి. సంక్షిప్తంగా, సంబంధిత ఛానల్ యొక్క సింగిల్-లేయర్ కాన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లో, సమీకరణం ద్వారా: సిగ్నల్ = నిమిషం (mtYFP, యాంటీబాడీ), పుర్కినాలోని ఒక నిర్దిష్ట యాంటీబాడీకి రోగనిరోధక శక్తిని చూపించే మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రాంతం గుర్తించబడుతుంది. అప్పుడు ఫలిత మాస్క్‌లోని పిక్సెల్ ప్రాంతం లెక్కించబడుతుంది మరియు ప్రదర్శించబడిన ప్రోటీన్ యొక్క మైటోకాన్డ్రియల్ భిన్నాన్ని పొందడానికి mtYFP ఛానల్ యొక్క సంబంధిత థ్రెషోల్డ్ సింగిల్-స్టాక్ ఇమేజ్‌పై సాధారణీకరించబడుతుంది.
పుర్కింజే సెల్ సాంద్రత విశ్లేషణ. ఇమేజ్‌జే యొక్క సెల్ కౌంటర్ ప్లగ్-ఇన్‌ను పుర్కింజే సాంద్రతను అంచనా వేయడానికి ఉపయోగించారు, ఇది లెక్కించబడిన కణాలు ఆక్రమించిన సెరెబెల్లార్ రింగ్ పొడవుతో లెక్కించబడిన పుర్కింజే కణాల సంఖ్యను విభజించడం ద్వారా ఉపయోగించబడింది.
నమూనా తయారీ మరియు సేకరణ. నియంత్రణ సమూహం మరియు Mfn2cKO ఎలుకల మెదడులను 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (PB)లో 2% PFA/2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్‌లో స్థిరపరిచారు, ఆపై సిలియేట్‌లను (లైకా మైక్రోసిస్టమ్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) ఉపయోగించి కరోనల్ విభాగాలను తయారు చేశారు (మందం 50 నుండి 60 μm) తర్వాత గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు 1% os టెట్రాక్సైడ్ మరియు 1.5% పొటాషియం ఫెర్రోసైనైడ్‌లో PB బఫర్‌లో అమర్చారు. విభాగాలను స్వేదనజలంతో మూడుసార్లు కడిగి, ఆపై 20 నిమిషాల పాటు 1% యురేనిల్ అసిటేట్ కలిగిన 70% ఇథనాల్‌తో మరక చేశారు. ఆ విభాగాలను గ్రేడెడ్ ఆల్కహాల్‌లో డీహైడ్రేట్ చేసి, సిలికాన్-కోటెడ్ గ్లాస్ స్లైడ్‌ల మధ్య డర్కుపాన్ ACM (అరాల్డైట్ కాస్టింగ్ రెసిన్ M) ఎపాక్సీ రెసిన్ (ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ సైన్సెస్, కేటలాగ్ నంబర్ 14040)లో పొందుపరిచారు మరియు చివరకు 60°C వద్ద 48 గంటల పాటు ఓవెన్‌లో పాలిమరైజ్ చేశారు. సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్ ప్రాంతాన్ని ఎంపిక చేసి, లైకా అల్ట్రాకట్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) పై 50 nm అల్ట్రాథిన్ విభాగాలను కత్తిరించి, పాలీస్టైరిన్ ఫిల్మ్‌తో పూత పూసిన 2×1 mm కాపర్ స్లిట్ గ్రిడ్‌పై ఎంచుకున్నారు. విభాగాలను H2O లో 4% యురేనిల్ అసిటేట్ ద్రావణంతో 10 నిమిషాలు మరక చేసి, H2O తో చాలాసార్లు కడిగి, ఆపై H2O తో చాలాసార్లు కడిగి, ఆపై TVIPS (టైట్జ్ వీడియో మరియు ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ సిస్టమ్) TemCam-F416 డిజిటల్ కెమెరా (TVIPS GmbH, గౌటింగ్, USA) ఉపయోగించి ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ ఫిలిప్స్ CM100 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, MA, USA) తో మైక్రోగ్రాఫ్‌లను తీసుకున్నారు. జర్మనీ).
AAV సోకిన ఎలుకలకు, మెదడును వేరు చేసి 1 mm మందపాటి సాగిట్టల్ విభాగంలో ముక్కలు చేశారు మరియు AAV-సోకిన రింగ్ (అంటే, mCherry ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్) ను గుర్తించడానికి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్‌ను ఉపయోగించి సెరెబెల్లమ్‌ను పరిశీలించారు. AAV ఇంజెక్షన్ కనీసం రెండు వరుస సెరెబెల్లార్ రింగులలో పుర్కింజే సెల్ పొర (అంటే దాదాపు మొత్తం పొర) యొక్క చాలా అధిక ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని కలిగించే ప్రయోగాలు మాత్రమే ఉపయోగించబడతాయి. AAV-ట్రాన్స్‌డ్యూస్డ్ లూప్‌ను రాత్రిపూట పోస్ట్-ఫిక్సేషన్ కోసం మైక్రోడిసెక్ట్ చేశారు (0.1 M కోకోట్ బఫర్‌లో 4% PFA మరియు 2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్) మరియు మరింత ప్రాసెస్ చేయబడింది. EPON ఎంబెడ్డింగ్ కోసం, స్థిర కణజాలాన్ని 0.1 M సోడియం కోకోట్ బఫర్ (అప్లికెమ్) తో కడిగి, 0.1 M సోడియం కోకోట్ బఫర్ (అప్లికెమ్) లో 2% OsO4 (os, సైన్స్ సర్వీసెస్; కాకో) తో 4 గంటలు పొదిగించి, ఆపై 2 గంటలు కడగాలి. 0.1 M కోకామైడ్ బఫర్‌తో 3 సార్లు పునరావృతం చేయండి. తదనంతరం, ప్రతి ఇథనాల్ ద్రావణాన్ని 4°C వద్ద 15 నిమిషాలు పొదిగించడానికి ఇథనాల్ యొక్క ఆరోహణ శ్రేణిని ఉపయోగించారు, ఇది కణజాలాన్ని నిర్జలీకరణం చేస్తుంది. కణజాలాన్ని ప్రొపైలిన్ ఆక్సైడ్‌కు బదిలీ చేసి, 4°C వద్ద EPON (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)లో రాత్రిపూట పొదిగించారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద తాజా EPONలో కణజాలాన్ని 2 గంటల పాటు ఉంచండి, ఆపై దానిని 62°C వద్ద 72 గంటల పాటు పొందుపరచండి. 70 nm అల్ట్రాథిన్ విభాగాలను కత్తిరించడానికి అల్ట్రామైక్రోటోమ్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్, UC6) మరియు డైమండ్ కత్తి (డయాటోమ్, బీల్, స్విట్జర్లాండ్)ను ఉపయోగించండి మరియు 37°C వద్ద 15 నిమిషాలు 1.5% యురేనిల్ అసిటేట్‌తో మరక చేయండి మరియు 4 నిమిషాలు లెడ్ సిట్రేట్ ద్రావణంతో మరక చేయండి. కెమెరా వన్‌వ్యూ 4K 16-బిట్ (గటాన్) మరియు డిజిటల్ మైక్రోగ్రాఫ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (గటాన్)తో అమర్చబడిన JEM-2100 ప్లస్ ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (JEOL)ను ఉపయోగించి ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లను తీసుకున్నారు. విశ్లేషణ కోసం, ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు 5000× లేదా 10,000× డిజిటల్ జూమ్‌తో పొందబడ్డాయి.
మైటోకాండ్రియా యొక్క పదనిర్మాణ విశ్లేషణ. అన్ని విశ్లేషణల కోసం, వ్యక్తిగత మైటోకాండ్రియా యొక్క ఆకృతులను ఇమేజ్‌జే సాఫ్ట్‌వేర్‌ని ఉపయోగించి డిజిటల్ చిత్రాలలో మాన్యువల్‌గా వివరించబడింది. విభిన్న పదనిర్మాణ పారామితులను విశ్లేషించారు. మైటోకాండ్రియా సాంద్రత ప్రతి కణం యొక్క మొత్తం మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రాంతాన్ని సైటోప్లాజం ప్రాంతం (సైటోప్లాజమ్ ప్రాంతం = సెల్ ప్రాంతం-సెల్ న్యూక్లియస్ ప్రాంతం) × 100 ద్వారా విభజించడం ద్వారా పొందిన శాతంగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది. మైటోకాండ్రియా యొక్క గుండ్రనిత్వాన్ని [4π (ప్రాంతం/చుట్టుకొలత 2)] సూత్రంతో లెక్కిస్తారు. మైటోకాండ్రియా యొక్క ఇస్టా పదనిర్మాణాన్ని విశ్లేషించి, వాటి ప్రధాన ఆకారాల ప్రకారం రెండు వర్గాలుగా ("గొట్టపు" మరియు "పొక్కు") విభజించారు.
ఆటోఫాగోజోమ్/లైసోజోమ్ సంఖ్య మరియు సాంద్రత విశ్లేషణ. డిజిటల్ ఇమేజ్‌లో ప్రతి ఆటోఫాగోజోమ్/లైసోజోమ్ యొక్క ఆకృతులను మాన్యువల్‌గా రూపుమాపడానికి ఇమేజ్‌జే సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి. ఆటోఫాగోజోమ్/లైసోజోమ్ ప్రాంతం ప్రతి కణం యొక్క మొత్తం ఆటోఫాగోజోమ్/లైసోజోమ్ నిర్మాణ ప్రాంతాన్ని సైటోప్లాజమ్ ప్రాంతం (సైటోప్లాజమ్ ప్రాంతం=సెల్ ఏరియా-న్యూక్లియస్ ప్రాంతం)×100 ద్వారా విభజించడం ద్వారా లెక్కించబడిన శాతంగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది. ఆటోఫాగోజోమ్‌లు/లైసోజోమ్‌ల సాంద్రతను మొత్తం సంఖ్యను ప్రతి కణానికి ఆటోఫాగోజోమ్/లైసోజోమ్ నిర్మాణాల సంఖ్యతో (సైటోప్లాస్మిక్ ప్రాంతం పరంగా) విభజించడం ద్వారా లెక్కించబడుతుంది (సైటోప్లాస్మిక్ ప్రాంతం = సెల్ ఏరియా-న్యూక్లియర్ ప్రాంతం).
అక్యూట్ సెక్షనింగ్ మరియు నమూనా తయారీ కోసం లేబులింగ్. గ్లూకోజ్ లేబులింగ్ అవసరమయ్యే ప్రయోగాల కోసం, అక్యూట్ బ్రెయిన్ స్లైస్‌లను ప్రీ-ఇంక్యుబేషన్ చాంబర్‌కు బదిలీ చేయండి, ఇందులో సంతృప్త కార్బన్ (95% O2 మరియు 5% CO2), అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl 2 మరియు 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mOsm కు సర్దుబాటు చేయబడింది), దీనిలో గ్లూకోజ్ 13 C 6- గ్లూకోజ్ ప్రత్యామ్నాయం (యూరిసోటాప్, కేటలాగ్ సంఖ్య CLM-1396). పైరువేట్ లేబులింగ్ అవసరమయ్యే ప్రయోగాల కోసం, అక్యూట్ బ్రెయిన్ స్లైస్‌లను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 2.0mM MgCl2 జోడించండి, pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320mOsm వరకు సర్దుబాటు చేయండి) మరియు 1mM 1-[1-13C] పైరువేట్ (యూరిసోటాప్, కేటలాగ్ నంబర్ CLM-1082) జోడించండి. విభాగాలను 37°C వద్ద 90 నిమిషాలు పొదిగించండి. ప్రయోగం ముగింపులో, విభాగాలను 75 mM అమ్మోనియం కార్బోనేట్ కలిగిన జల ద్రావణం (pH 7.4)తో త్వరగా కడిగి, ఆపై 40:40:20 (v:v:v) అసిటోనిట్రైల్ (ACN): మిథనాల్: నీరులో సజాతీయపరచారు. విభాగాలను మంచు మీద 30 నిమిషాలు పొదిగించిన తర్వాత, నమూనాలను 21,000 గ్రాముల వద్ద 4°C వద్ద 10 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, స్పష్టమైన సూపర్‌నాటెంట్‌ను స్పీడ్‌వాక్ కాన్సంట్రేటర్‌లో ఎండబెట్టారు. ఫలితంగా ఎండిన మెటాబోలైట్ గుళికను విశ్లేషణ వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
13 C-లేబుల్ చేయబడిన అమైనో ఆమ్లాల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ విశ్లేషణ. లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) విశ్లేషణ కోసం, మెటాబోలైట్ గుళికను 75μl LC-MS గ్రేడ్ నీటిలో (హనీవెల్) తిరిగి ఉంచారు. 4°C వద్ద 5 నిమిషాలు 21,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, 20 μl క్లియర్ చేయబడిన సూపర్‌నాటెంట్‌ను అమైనో ఆమ్ల ప్రవాహ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించారు, మిగిలిన సారం వెంటనే అయాన్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించబడింది (క్రింద చూడండి). గతంలో వివరించిన బెంజాయిల్ క్లోరైడ్ ఉత్పన్న ప్రోటోకాల్ (55, 56) ఉపయోగించి అమైనో ఆమ్ల విశ్లేషణ జరిగింది. మొదటి దశలో, 10μl 100 mM సోడియం కార్బోనేట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను 20μl మెటాబోలైట్ సారానికి జోడించారు, ఆపై 10μl 2% బెంజాయిల్ క్లోరైడ్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను LC గ్రేడ్ ACN కు జోడించారు. నమూనాను క్లుప్తంగా వోర్టెక్స్ చేసి, ఆపై 21,000 గ్రా వద్ద 5 నిమిషాలు 20°C వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. క్లియర్ చేసిన సూపర్‌నాటెంట్‌ను శంఖాకార గాజు ఇన్సర్ట్ (200 μl వాల్యూమ్)తో 2 మి.లీ. ఆటోసాంప్లర్ వైయల్‌కు బదిలీ చేయండి. Q-ఎక్సాక్టివ్ (QE)-HF (అల్ట్రా హై ఫీల్డ్ ఆర్బిట్రాప్) హై-రిజల్యూషన్ ప్రెసిషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)కి అనుసంధానించబడిన అక్విటీ ఐక్లాస్ అల్ట్రా-హై పెర్ఫార్మెన్స్ LC సిస్టమ్ (వాటర్స్) ఉపయోగించి నమూనాలను విశ్లేషించారు. విశ్లేషణ కోసం, ఉత్పన్నమైన నమూనాలో 2μl 1.8μm కణాలను కలిగి ఉన్న 100×1.0 mm హై-స్ట్రెంత్ సిలికా T3 కాలమ్ (వాటర్స్)లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడింది. ప్రవాహం రేటు 100μl/నిమిషం, మరియు బఫర్ వ్యవస్థలో బఫర్ A (10 mM అమ్మోనియం ఫార్మేట్ మరియు నీటిలో 0.15% ఫార్మిక్ ఆమ్లం) మరియు బఫర్ B (ACN) ఉంటాయి. ప్రవణత ఈ క్రింది విధంగా ఉంటుంది: 0 నిమిషాలలో 0%B; 0%B. 0 నుండి 0.1 నిమిషాలకు 0 నుండి 15% B; 0.1 నుండి 0.5 నిమిషాలకు 15 నుండి 17% B; 0.5 నుండి 14 నిమిషాలకు 17 నుండి 55% B; 14 నుండి 14.5 నిమిషాలకు 55 నుండి 70% B; 18 నిమిషాలకు 14.5 నుండి 70 నుండి 100% B; 18 నుండి 19 నిమిషాలకు 100% B; 19 నుండి 19.1 నిమిషాలకు 100 నుండి 0% B; 19.1 నుండి 28 నిమిషాలకు 0% B (55, 56). QE-HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ 50 నుండి 750 m/z (ద్రవ్యరాశి/ఛార్జ్ నిష్పత్తి) ద్రవ్యరాశి పరిధితో సానుకూల అయనీకరణ రీతిలో పనిచేస్తుంది. అనువర్తిత రిజల్యూషన్ 60,000, మరియు పొందిన గెయిన్ కంట్రోల్ (AGC) అయాన్ లక్ష్యం 3×106, మరియు గరిష్ట అయాన్ సమయం 100 మిల్లీసెకన్లు. వేడిచేసిన ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ (ESI) మూలం 3.5 kV స్ప్రే వోల్టేజ్, 250°C కేశనాళిక ఉష్ణోగ్రత, 60 AU (ఏకపక్ష యూనిట్లు) యొక్క షీత్ ఎయిర్ ఫ్లో మరియు 20 AU యొక్క సహాయక ఎయిర్ ఫ్లో వద్ద పనిచేస్తుంది. 250°C. S లెన్స్ 60 AUకి సెట్ చేయబడింది.
13C లేబుల్ చేయబడిన సేంద్రీయ ఆమ్లాల యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రఫీ-MS విశ్లేషణ. మిగిలిన మెటాబోలైట్ అవక్షేపణ (55μl) ను QE-HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) కు అనుసంధానించబడిన డయోనెక్స్ అయాన్ క్రోమాటోగ్రఫీ సిస్టమ్ (ICS 5000+, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. సంక్షిప్తంగా, 5μl మెటాబోలైట్ సారం HPLC (2 mm×250 mm, కణ పరిమాణం 4μm, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) తో అమర్చబడిన డయోనెక్స్ అయాన్ పాక్ AS11-HC కాలమ్‌లోకి 1 ఫిల్లింగ్ నిష్పత్తితో పుష్-ఇన్ పాక్షిక లూప్ మోడ్‌లో ఇంజెక్ట్ చేయబడింది. ) డయోనెక్స్ అయాన్ పాక్ AG11-HC గార్డ్ కాలమ్ (2 mm x 50 mm, 4μm, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్). కాలమ్ ఉష్ణోగ్రత 30°C వద్ద నిర్వహించబడుతుంది మరియు ఆటోసాంప్లర్ 6°Cకి సెట్ చేయబడింది. ఎల్యూయెంట్ జనరేటర్ ద్వారా పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్ ప్రవణతను ఉత్పత్తి చేయడానికి డీయోనైజ్డ్ నీటితో అందించబడిన పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్ కార్ట్రిడ్జ్‌ను ఉపయోగించండి. 380μl/నిమిషానికి ప్రవాహ రేటుతో జీవక్రియలను వేరు చేయడం, ఈ క్రింది ప్రవణతను వర్తింపజేయడం: 0 నుండి 3 నిమిషాలు, 10 mM KOH; 3 నుండి 12 నిమిషాలు, 10 నుండి 50 mM KOH; 12 నుండి 19 నిమిషాలు, 50 నుండి 100 mM KOH; 19 నుండి 21 నిమిషాలు, 100 mM KOH; 21 నుండి 21.5 నిమిషాలు, 100 నుండి 10 mM KOH. స్తంభాన్ని 8.5 నిమిషాల పాటు 10 mM KOH కింద తిరిగి సమతౌల్యం చేశారు.
కాలమ్ తర్వాత ఎల్యూటెడ్ మెటాబోలైట్‌లను 150μl/min ఐసోప్రొపనాల్ సప్లిమెంట్ స్ట్రీమ్‌తో కలుపుతారు మరియు తరువాత ప్రతికూల అయనీకరణ మోడ్‌లో పనిచేసే హై-రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌కు మళ్ళిస్తారు. MS 60,000 రిజల్యూషన్‌తో m/z 50 నుండి 750 వరకు ద్రవ్యరాశి పరిధిని పర్యవేక్షిస్తోంది. AGC 1×106కి సెట్ చేయబడింది మరియు గరిష్ట అయాన్ సమయం 100 ms వద్ద ఉంచబడుతుంది. వేడిచేసిన ESI మూలం 3.5 kV స్ప్రే వోల్టేజ్ వద్ద నిర్వహించబడుతుంది. అయాన్ మూలం యొక్క ఇతర సెట్టింగ్‌లు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి: కేశనాళిక ఉష్ణోగ్రత 275°C; షీత్ గ్యాస్ ప్రవాహం, 60 AU; సహాయక గ్యాస్ ప్రవాహం, 300°C వద్ద 20 AU, మరియు S లెన్స్ సెట్టింగ్ 60 AUకి.
13C లేబుల్ చేయబడిన మెటాబోలైట్ల డేటా విశ్లేషణ. ఐసోటోప్ నిష్పత్తి యొక్క డేటా విశ్లేషణ కోసం ట్రేస్‌ఫైండర్ సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 4.2, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించండి. ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క గుర్తింపును విశ్వసనీయ సూచన సమ్మేళనం ద్వారా ధృవీకరించారు మరియు స్వతంత్రంగా విశ్లేషించారు. ఐసోటోప్ సుసంపన్న విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి, ప్రతి 13C ఐసోటోప్ (Mn) యొక్క సంగ్రహించబడిన అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ (XIC) యొక్క వైశాల్యాన్ని [M + H] + నుండి సంగ్రహించారు, ఇక్కడ n అనేది లక్ష్య సమ్మేళనం యొక్క కార్బన్ సంఖ్య, అమైనో ఆమ్లాలను విశ్లేషించడానికి లేదా [MH] + అయాన్లను విశ్లేషించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది. XIC యొక్క ద్రవ్యరాశి ఖచ్చితత్వం మిలియన్‌కు ఐదు భాగాల కంటే తక్కువ, మరియు RT యొక్క ఖచ్చితత్వం 0.05 నిమిషాలు. గుర్తించబడిన ప్రతి ఐసోటోప్ యొక్క నిష్పత్తిని సంబంధిత సమ్మేళనం యొక్క అన్ని ఐసోటోపుల మొత్తానికి లెక్కించడం ద్వారా సుసంపన్న విశ్లేషణ నిర్వహించబడుతుంది. ఈ నిష్పత్తులు ప్రతి ఐసోటోప్‌కు శాతం విలువలుగా ఇవ్వబడ్డాయి మరియు ఫలితాలు గతంలో వివరించిన విధంగా మోలార్ శాతం సుసంపన్నం (MPE)గా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి (42).
ఘనీభవించిన న్యూరాన్ గుళికను మంచు-చల్లటి 80% మిథనాల్ (v/v)లో సజాతీయపరచి, వోర్టెక్స్ చేసి, -20°C వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించారు. నమూనాను మళ్ళీ వోర్టెక్స్ చేసి, +4°C వద్ద 30 నిమిషాలు కదిలించండి. నమూనాను 21,000 గ్రా వద్ద 4°C వద్ద 5 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, ఆపై ఫలిత సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించి, తదుపరి విశ్లేషణ కోసం 25°C వద్ద స్పీడ్‌వాక్ కాన్సంట్రేటర్ ఉపయోగించి ఎండబెట్టారు. పైన వివరించిన విధంగా, క్రమబద్ధీకరించబడిన కణాల అమైనో ఆమ్లాలపై LC-MS విశ్లేషణ జరిగింది. ట్రేస్‌ఫైండర్ (వెర్షన్ 4.2, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి, ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క మోనోఐసోటోపిక్ ద్రవ్యరాశిని ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ జరిగింది. ప్రీప్రాసెస్‌కోర్ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (57) ఉపయోగించి మెటాబోలైట్ డేటా యొక్క పరిమాణాత్మక సాధారణీకరణ జరిగింది.
ముక్క తయారీ. ఎలుకను త్వరగా కార్బన్ డయాక్సైడ్‌తో మత్తుమందు చేసి శిరచ్ఛేదం చేశారు, మెదడును పుర్రె నుండి త్వరగా తొలగించారు, మరియు మంచుతో నిండిన కంపించే కత్తిని (HM-650 V, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్‌డార్ఫ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి దానిని 300 నుండి 375 μm సాగిట్టల్ విభాగాలుగా కత్తిరించారు. కోల్డ్ కార్బన్ గ్యాసిఫికేషన్ (95% O2 మరియు 5% CO2) తక్కువ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 మరియు 310 నుండి 330 mOsm కు సర్దుబాటు చేయండి). పొందిన మెదడు ముక్కలను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 4.0 mM CaCl2 మరియు mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mOsm) కలిగిన గదికి బదిలీ చేయండి. ముక్కలను 20 నుండి 30 నిమిషాలు నిల్వ చేయండి, తద్వారా వాటిని రికార్డ్ చేయడానికి ముందు పునరుద్ధరించవచ్చు.
రికార్డింగ్. అన్ని రికార్డింగ్‌ల కోసం స్థిర రికార్డింగ్ చాంబర్ మరియు 20x నీటి ఇమ్మర్షన్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (సైంటిఫికా) కలిగిన మైక్రోస్కోప్ దశను ఉపయోగించారు. పుటేటివ్ పుర్కింజే కణాలను (i) శరీర పరిమాణం, (ii) సెరెబెల్లమ్ యొక్క శరీర నిర్మాణ స్థానం మరియు (iii) ఫ్లోరోసెంట్ mtYFP రిపోర్టర్ జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా గుర్తించారు. 5 నుండి 11 మెగాహోమ్‌ల చిట్కా నిరోధకత కలిగిన ప్యాచ్ పైపెట్‌ను బోరోసిలికేట్ గ్లాస్ క్యాపిల్లరీ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, సైన్స్ ప్రొడక్ట్స్, హాఫ్‌హీమ్, జర్మనీ) మరియు క్షితిజ సమాంతర పైపెట్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్ (P-1000, సుటర్), నోవాటో, CA) ద్వారా బయటకు తీస్తారు. అన్ని రికార్డింగ్‌లు ELC-03XS npi ప్యాచ్ క్లాంప్ యాంప్లిఫైయర్ (npi ఎలక్ట్రానిక్ GmbH, టామ్, జర్మనీ) ద్వారా నిర్వహించబడ్డాయి, దీనిని సాఫ్ట్‌వేర్ సిగ్నల్ (వెర్షన్ 6.0, కేంబ్రిడ్జ్ ఎలక్ట్రానిక్, కేంబ్రిడ్జ్, UK) ద్వారా నియంత్రించారు. ప్రయోగం 12.5 kHz నమూనా రేటుతో రికార్డ్ చేయబడింది. సిగ్నల్ వరుసగా 1.3 మరియు 10 kHz కటాఫ్ ఫ్రీక్వెన్సీలతో రెండు షార్ట్-పాస్ బెస్సెల్ ఫిల్టర్‌లతో ఫిల్టర్ చేయబడుతుంది. పొర మరియు పైపెట్ యొక్క కెపాసిటెన్స్ యాంప్లిఫైయర్ ఉపయోగించి పరిహార సర్క్యూట్ ద్వారా భర్తీ చేయబడుతుంది. అన్ని ప్రయోగాలు ఓర్కా-ఫ్లాష్ 4.0 కెమెరా (హమామట్సు, గెర్డెన్, జర్మనీ) నియంత్రణలో నిర్వహించబడ్డాయి, దీనిని హోకావో సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 2.8, హమామట్సు, గెర్డెన్, జర్మనీ) నియంత్రించింది.
సాధారణ మొత్తం-కణ ఆకృతీకరణ మరియు విశ్లేషణ. రికార్డింగ్‌కు ముందు, పైపెట్‌ను ఈ క్రింది పదార్థాలను కలిగి ఉన్న అంతర్గత ద్రావణంతో నింపండి: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM పొటాషియం గ్లూకోనేట్, 10.0 mM హెప్స్, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM గ్వానోసిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (GTP) (Na) మరియు 10.0 mM క్రియేటినిన్ ఫాస్ఫేట్ pH 7.25కి సర్దుబాటు చేయబడ్డాయి మరియు ఆస్మాటిక్ పీడనం 290 mOsm (సుక్రోజ్)గా ఉంది. పొరను చీల్చడానికి 0 pA బలాన్ని ప్రయోగించిన వెంటనే, విశ్రాంతి పొర సంభావ్యతను కొలుస్తారు. -40, -30, -20, మరియు -10 pA యొక్క హైపర్‌పోలరైజ్డ్ కరెంట్‌లను వర్తింపజేయడం ద్వారా ఇన్‌పుట్ నిరోధకతను కొలుస్తారు. వోల్టేజ్ ప్రతిస్పందన పరిమాణాన్ని కొలవండి మరియు ఇన్‌పుట్ నిరోధకతను లెక్కించడానికి ఓమ్ నియమాన్ని ఉపయోగించండి. వోల్టేజ్ క్లాంప్‌లో 5 నిమిషాల పాటు ఆకస్మిక కార్యాచరణ నమోదు చేయబడింది మరియు sPSCని గుర్తించి ఇగోర్ ప్రో (వెర్షన్ 32 7.01, వేవ్‌మెట్రిక్స్, లేక్ ఓస్వెగో, ఒరెగాన్, USA)లో సెమీ-ఆటోమేటిక్ రికగ్నిషన్ స్క్రిప్ట్‌ని ఉపయోగించి కొలుస్తారు. IV కర్వ్ మరియు స్టెడి-స్టేట్ కరెంట్‌ను బ్యాటరీని వేర్వేరు పొటెన్షియల్స్ వద్ద (-110 mV నుండి ప్రారంభించి) బిగించడం ద్వారా మరియు 5 mV దశల్లో వోల్టేజ్‌ను పెంచడం ద్వారా కొలుస్తారు. డిపోలరైజింగ్ కరెంట్‌ను వర్తింపజేయడం ద్వారా AP ఉత్పత్తిని పరీక్షించారు. డిపోలరైజింగ్ కరెంట్ పల్స్‌ను వర్తింపజేస్తున్నప్పుడు సెల్‌ను -70 mV వద్ద బిగించండి. ప్రతి రికార్డింగ్ యూనిట్ యొక్క దశ పరిమాణాన్ని విడిగా సర్దుబాటు చేయండి (10 నుండి 60 pA). అత్యధిక AP ఫ్రీక్వెన్సీకి కారణమయ్యే పల్స్ స్పైక్‌లను మాన్యువల్‌గా లెక్కించడం ద్వారా గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీని లెక్కించండి. మొదట ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ APలను ప్రేరేపించే డిపోలరైజేషన్ పల్స్ యొక్క రెండవ ఉత్పన్నాన్ని ఉపయోగించడం ద్వారా AP థ్రెషోల్డ్ విశ్లేషించబడుతుంది.
చిల్లులు గల ప్యాచ్ కాన్ఫిగరేషన్ మరియు విశ్లేషణ. ప్రామాణిక ప్రోటోకాల్‌లను ఉపయోగించి చిల్లులు గల ప్యాచ్ రికార్డింగ్‌ను నిర్వహించండి. కింది పదార్థాలు లేని ATP- మరియు GTP-రహిత పైపెట్‌ను ఉపయోగించండి: 128 mM గ్లూకోనేట్ K, 10 mM KCl, 10 mM హెప్స్, 0.1 mM EGTA మరియు 2 mM MgCl2, మరియు pH 7.2కి సర్దుబాటు చేయండి (KOH ఉపయోగించి). కణ త్వచం యొక్క అనియంత్రిత పారగమ్యతను నివారించడానికి ATP మరియు GTP కణాంతర ద్రావణం నుండి తొలగించబడతాయి. పంచ్డ్ ప్యాచ్ రికార్డ్‌ను పొందడానికి ప్యాచ్ పైపెట్‌ను యాంఫోటెరిసిన్ కలిగిన అంతర్గత ద్రావణంతో (సుమారు 200 నుండి 250μg/ml; G4888, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) నింపుతారు. యాంఫోటెరిసిన్‌ను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్‌లో కరిగించారు (తుది సాంద్రత: 0.1 నుండి 0.3%; DMSO; D8418, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్). ఉపయోగించిన DMSO యొక్క సాంద్రత అధ్యయనం చేయబడిన న్యూరాన్‌లపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు. పంచింగ్ ప్రక్రియలో, ఛానల్ రెసిస్టెన్స్ (Ra) నిరంతరం పర్యవేక్షించబడుతుంది మరియు Ra మరియు AP యొక్క వ్యాప్తి స్థిరీకరించబడిన తర్వాత (20-40 నిమిషాలు) ప్రయోగం ప్రారంభించబడింది. 2 నుండి 5 నిమిషాల పాటు వోల్టేజ్ మరియు/లేదా కరెంట్ క్లాంప్‌లో స్పాంటేనియస్ యాక్టివిటీని కొలుస్తారు. ఇగోర్ ప్రో (వెర్షన్ 7.05.2, వేవ్‌మెట్రిక్స్, USA), ఎక్సెల్ (వెర్షన్ 2010, మైక్రోసాఫ్ట్ కార్పొరేషన్, రెడ్‌మండ్, USA) మరియు గ్రాప్‌ప్యాడ్ ప్రిజం (వెర్షన్ 8.1.2, గ్రాప్‌ప్యాడ్ సాఫ్ట్‌వేర్ ఇంక్., లా జోల్లా, CA) ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. స్పాంటేనియస్ APలను గుర్తించడానికి, ఇగోర్‌ప్రో యొక్క న్యూరోమాటిక్ v3.0c ప్లగ్-ఇన్ ఉపయోగించబడుతుంది. ఇచ్చిన థ్రెషోల్డ్‌ను ఉపయోగించి APలను స్వయంచాలకంగా గుర్తించండి, ఇది ప్రతి రికార్డ్‌కు వ్యక్తిగతంగా సర్దుబాటు చేయబడుతుంది. స్పైక్ విరామాన్ని ఉపయోగించి, గరిష్ట తక్షణ స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు సగటు స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీతో స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీని నిర్ణయించండి.
PN ఐసోలేషన్. గతంలో ప్రచురించబడిన ప్రోటోకాల్‌కు అనుగుణంగా, PNలను మౌస్ సెరెబెల్లమ్ నుండి ఒక నిర్దిష్ట దశలో శుద్ధి చేశారు (58). సంక్షిప్తంగా, సెరెబెల్లమ్‌ను ఐస్-కోల్డ్ డిస్సోసియేషన్ మాధ్యమంలో విచ్ఛేదనం చేసి ముక్కలు చేశారు [HBSS Ca2+ మరియు Mg2+ లేకుండా, 20 mM గ్లూకోజ్, పెన్సిలిన్ (50 U/ml) మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml) తో అనుబంధంగా], ఆపై మాధ్యమాన్ని పాపైన్‌లో జీర్ణం చేశారు [HBSS, 1-సిస్టీన్·HCl (1 mg / ml), పాపైన్ (16 U / ml) మరియు డియోక్సిరిబోన్యూక్లీస్ I (DNase I; 0.1 mg/ml) తో అనుబంధంగా] 30°C వద్ద 30 నిమిషాలు చికిత్స చేయండి. ముందుగా ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియను నివారించడానికి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద గుడ్డు శ్లేష్మం (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) మరియు DNase (0.1 mg/ml) కలిగిన HBSS మాధ్యమంలో కణజాలాలను కడగాలి, ఆపై 20 mM గ్లూకోజ్ కలిగిన HBSS మాధ్యమంలో HBSSలో మెత్తగా రుబ్బుతూ, పెన్సిలిన్ (50 U/ml), స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml) మరియు DNase (0.1 mg/ml) ఒకే కణాలను విడుదల చేస్తాయి. ఫలితంగా వచ్చే కణ సస్పెన్షన్‌ను 70μm సెల్ స్ట్రైనర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేశారు, తర్వాత కణాలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (1110 rpm, 5 నిమిషాలు, 4°C) ద్వారా గుళికలుగా చేసి, సార్టింగ్ మాధ్యమంలో తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు [HBSS, 20 mM గ్లూకోజ్, 20% ఫీటల్ బోవిన్‌తో అనుబంధించబడింది) సీరం, పెన్సిలిన్ (50 U/ml) మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml)]; ప్రొపిడియం అయోడైడ్‌తో కణ సాధ్యతను అంచనా వేయండి మరియు కణ సాంద్రతను 1×106 నుండి 2×106 కణాలు/ml వరకు సర్దుబాటు చేయండి. ఫ్లో సైటోమెట్రీకి ముందు, సస్పెన్షన్ 50 μm సెల్ స్ట్రైనర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడింది.
ఫ్లో సైటోమీటర్. FACSAria III యంత్రం (BD బయోసైన్సెస్) మరియు FACSDiva సాఫ్ట్‌వేర్ (BD బయోసైన్సెస్, వెర్షన్ 8.0.1) ఉపయోగించి 4°C వద్ద సెల్ సార్టింగ్ నిర్వహించబడింది. సెల్ సస్పెన్షన్ 100 μm నాజిల్ ఉపయోగించి 20 psi ఒత్తిడితో ~2800 ఈవెంట్‌లు/సెకను రేటుతో క్రమబద్ధీకరించబడింది. సాంప్రదాయ గేటింగ్ ప్రమాణాలు (సెల్ పరిమాణం, బైమోడల్ వివక్షత మరియు స్కాటరింగ్ లక్షణాలు) ఇతర సెల్ రకాల నుండి PN యొక్క సరైన ఐసోలేషన్‌ను నిర్ధారించలేవు కాబట్టి, mitoYFP+ ​​మరియు నియంత్రణ mitoYFP − ఎలుకలలో YFP తీవ్రత మరియు ఆటోఫ్లోరోసెన్స్ యొక్క ప్రత్యక్ష పోలిక ఆధారంగా గేటింగ్ వ్యూహం సెట్ చేయబడింది. 488 nm లేజర్ లైన్‌తో నమూనాను రేడియేషన్ చేయడం ద్వారా YFP ఉత్తేజితమవుతుంది మరియు 530/30 nm బ్యాండ్ పాస్ ఫిల్టర్‌ని ఉపయోగించి సిగ్నల్ కనుగొనబడుతుంది. mitoYFP+ ​​ఎలుకలలో, న్యూరోనల్ బాడీ మరియు ఆక్సాన్ శకలాలను వేరు చేయడానికి Rosa26-mitoYFP రిపోర్టర్ జన్యువు యొక్క సాపేక్ష బలం కూడా ఉపయోగించబడుతుంది. 7-AAD 561 nm పసుపు లేజర్‌తో ఉత్తేజితమై, మృత కణాలను మినహాయించడానికి 675/20 nm బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌తో గుర్తించబడింది. అదే సమయంలో ఆస్ట్రోసైట్‌లను వేరు చేయడానికి, సెల్ సస్పెన్షన్‌ను ACSA-2-APCతో మరక చేశారు, తర్వాత నమూనాను 640 nm లేజర్ లైన్‌తో రేడియేషన్ చేశారు మరియు సిగ్నల్‌ను గుర్తించడానికి 660/20 nm బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించారు.
సేకరించిన కణాలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (1110 rpm, 5 నిమిషాలు, 4°C) ద్వారా గుచ్చుతారు మరియు ఉపయోగం వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేస్తారు. విధానపరమైన వైవిధ్యాన్ని తగ్గించడానికి Mfn2cKO ఎలుకలు మరియు వాటి లిట్టర్ పిల్లలను ఒకే రోజున వర్గీకరించారు. FlowJo సాఫ్ట్‌వేర్ (FlowJo LLC, ఆష్‌ల్యాండ్, ఒరెగాన్, USA) ఉపయోగించి FACS డేటా ప్రదర్శన మరియు విశ్లేషణ జరిగింది.
పైన చెప్పినట్లుగా (59), రియల్-టైమ్ PCR ను క్రమబద్ధీకరించిన న్యూరాన్ల నుండి తదుపరి mtDNA పరిమాణీకరణ కోసం వేరుచేయడానికి ఉపయోగిస్తారు. లీనియరిటీ మరియు థ్రెషోల్డ్ సెన్సిటివిటీని మొదట్లో వివిధ కణాలపై qPCR ను అమలు చేయడం ద్వారా పరీక్షించారు. సంక్షిప్తంగా, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 మరియు ప్రోటీనేజ్ K (200 ng/ml) లతో కూడిన లైసిస్ బఫర్‌లో 300 PN ను సేకరించి 55°C 120 నిమిషాల వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రోటీనేజ్ K యొక్క పూర్తి నిష్క్రియాత్మకతను నిర్ధారించడానికి కణాలను 95°C వద్ద 10 నిమిషాలు మరింత ఇంక్యుబేట్ చేశారు. mt-Nd1 కు ప్రత్యేకమైన TaqMan ప్రోబ్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి, mtDNA ను 7900HT రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లో సెమీ-క్వాంటిటేటివ్ PCR ద్వారా కొలుస్తారు. సైన్స్, కేటలాగ్ నంబర్ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ AIVI3E8) మరియు 18S (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ Hs99999901_s1) జన్యువులు.
ప్రోటీమ్ నమూనా తయారీ. ద్రావణాన్ని 95°C వద్ద 10 నిమిషాలు వేడి చేసి సోనికేట్ చేయడం ద్వారా, లైసిస్ బఫర్‌లో [6 M గ్వానిడిన్ క్లోరైడ్, 10 mM ట్రిస్(2-కార్బాక్సీథైల్) ఫాస్ఫైన్ హైడ్రోక్లోరైడ్, 10 mM క్లోరోఅసెటమైడ్ మరియు 100 mM ట్రిస్-లైజ్ ఫ్రోజెన్ న్యూరాన్ గుళికలు HClలో]. బయోరప్టర్ (డయాజెనోడ్)పై 10 నిమిషాలు (30 సెకన్ల పల్స్ / 30 సెకన్ల పాజ్ పీరియడ్). నమూనాను 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0)లో 1:10 నిష్పత్తిలో కరిగించి, 300 ng ట్రిప్సిన్ గోల్డ్ (ప్రోమెగా)తో కలిపి, పూర్తి జీర్ణక్రియను సాధించడానికి 37°C వద్ద రాత్రిపూట పొదిగించారు. రెండవ రోజు, నమూనాను 20,000 గ్రాముల వద్ద 20 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లంతో కరిగించారు మరియు ద్రావణాన్ని స్వీయ-నిర్మిత స్టేజ్‌టిప్స్‌తో డీసాల్ట్ చేశారు. నమూనాను స్పీడ్‌వాక్ పరికరంలో (ఎప్పెండోర్ఫ్ కాన్సంట్రేటర్ ప్లస్ 5305) 45°C వద్ద ఎండబెట్టి, ఆపై పెప్టైడ్‌ను 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌లో నిలిపివేశారు. అన్ని నమూనాలను ఒకే వ్యక్తి ఒకేసారి తయారు చేశారు. ఆస్ట్రోసైట్ నమూనాలను విశ్లేషించడానికి, 4 μg డీసాల్టెడ్ పెప్టైడ్‌లను 1:20 పెప్టైడ్ నుండి TMT రియాజెంట్ నిష్పత్తితో టెన్డం మాస్ ట్యాగ్ (TMT10plex, కేటలాగ్ నంబర్ 90110, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)తో లేబుల్ చేశారు. TMT లేబులింగ్ కోసం, 70 μl అన్‌హైడ్రస్ ACNలో 0.8 mg TMT రియాజెంట్‌ను తిరిగి అమర్చారు మరియు ఎండిన పెప్టైడ్‌ను 0.1 M TEAB (ట్రైఇథైలామోనియం బైకార్బోనేట్) యొక్క 9 μlగా పునర్నిర్మించారు, దీనికి ACNలో 7 μl TMT రియాజెంట్ జోడించబడింది. గాఢత 43.75%. 60 నిమిషాల పొదిగే తర్వాత, ప్రతిచర్యను 2 μl 5% హైడ్రాక్సిలామైన్‌తో చల్లబరిచారు. లేబుల్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను సేకరించి, ఎండబెట్టి, 200μl 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్ (FA)లో తిరిగి అమర్చి, రెండుగా విభజించి, ఆపై స్వీయ-నిర్మిత స్టేజ్‌టిప్స్‌ను ఉపయోగించి డీసాల్టెడ్ చేశారు. అల్టిమేట్ 3000 అల్ట్రా హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రాఫ్ (అల్టిమేట్ 3000 అల్ట్రా హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రాఫ్) ఉపయోగించి, రెండు భాగాలలో ఒకదాన్ని 1mm x 150mm అక్విటీ క్రోమాటోగ్రాఫిక్ కాలమ్‌పై 130Å1.7μm C18 కణాలతో నింపారు (వాటర్స్, కేటలాగ్ నం. SKU: 186006935). థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్). 30μl/నిమిషం ప్రవాహం రేటుతో పెప్టైడ్‌లను వేరు చేయండి, 1% నుండి 50% బఫర్ B వరకు 85 నిమిషాలు 96 నిమిషాల స్టెప్‌వైస్ గ్రేడియంట్‌తో, 50% నుండి 95% బఫర్ B వరకు 3 నిమిషాలు, ఆపై 95% బఫర్ B కోసం 8 నిమిషాలు; బఫర్ A 5% ACN మరియు 10 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ (ABC), మరియు బఫర్ B 80% ACN మరియు 10 mM ABC. ప్రతి 3 నిమిషాలకు భిన్నాలను సేకరించి, వాటిని రెండు గ్రూపులుగా (1 + 17, 2 + 18, మొదలైనవి) కలిపి వాక్యూమ్ సెంట్రిఫ్యూజ్‌లో ఆరబెట్టండి.
LC-MS/MS విశ్లేషణ. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ కోసం, పెప్టైడ్‌లను (సంఖ్య r119.aq) 25 సెం.మీ., 75 μm లోపలి వ్యాసం కలిగిన పికోఫ్రిట్ విశ్లేషణాత్మక కాలమ్ (కొత్త ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్, పార్ట్ నంబర్ PF7508250) పై వేరు చేశారు, 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ మాధ్యమం (డాక్టర్ మైష్, మ్యాట్), యూజ్ EASY-nLC 1200 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, జర్మనీ)తో అమర్చారు. కాలమ్ 50°C వద్ద నిర్వహించబడింది. బఫర్‌లు A మరియు B వరుసగా నీటిలో 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం మరియు 80% ACNలో 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం. పెప్టైడ్‌లను 65 నిమిషాల పాటు 6% నుండి 31% బఫర్ B వరకు మరియు 5 నిమిషాల పాటు 31% నుండి 50% బఫర్ B వరకు 200 nl/min ప్రవణతతో వేరు చేశారు. ఎల్యూటెడ్ పెప్టైడ్‌లను ఆర్బిట్రాప్ ఫ్యూజన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై విశ్లేషించారు. పెప్టైడ్ పూర్వగామి m/z కొలత 350 నుండి 1500 m/z పరిధిలో 120,000 రిజల్యూషన్‌తో నిర్వహిస్తారు. 27% సాధారణీకరించిన తాకిడి శక్తిని ఉపయోగించి, 2 నుండి 6 ఛార్జ్ స్థితి కలిగిన బలమైన పూర్వగామిని అధిక శక్తి C ట్రాప్ డిస్సోసియేషన్ (HCD) క్లీవేజ్ కోసం ఎంపిక చేస్తారు. సైకిల్ సమయం 1 సెకనుకు సెట్ చేయబడింది. పెప్టైడ్ భాగం యొక్క m/z విలువను అయాన్ ట్రాప్‌లో 5×104 యొక్క అతి చిన్న AGC లక్ష్యం మరియు 86 ms గరిష్ట ఇంజెక్షన్ సమయం ఉపయోగించి కొలుస్తారు. ఫ్రాగ్మెంటేషన్ తర్వాత, పూర్వగామిని 45 సెకన్ల పాటు డైనమిక్ మినహాయింపు జాబితాలో ఉంచారు. TMT-లేబుల్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను 50 సెం.మీ., 75 μm అక్లైమ్ పెప్‌మ్యాప్ కాలమ్‌పై (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ 164942) వేరు చేశారు, మరియు మైగ్రేషన్ స్పెక్ట్రాను హై-ఫీల్డ్ అసిమెట్రిక్ వేవ్‌ఫార్మ్ అయాన్లు (FAIMS) పరికరాలతో అమర్చబడిన ఆర్బిట్రాప్ లూమోస్ ట్రిబ్రిడ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)పై విశ్లేషించారు (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) −50 మరియు −70 V యొక్క రెండు పరిహార వోల్టేజ్‌ల వద్ద పనిచేస్తుంది. సింక్రొనైజేషన్ పూర్వగామి ఆధారంగా ఎంచుకున్న MS3 TMT నివేదిక అయాన్ సిగ్నల్ కొలత కోసం ఉపయోగించబడుతుంది. పెప్టైడ్ విభజన EASY-nLC 1200లో నిర్వహించబడింది, 90% లీనియర్ గ్రేడియంట్ ఎల్యూషన్ ఉపయోగించి, 6% నుండి 31% బఫర్ సాంద్రతతో; బఫర్ A 0.1% FA, మరియు బఫర్ B 0.1% FA మరియు 80% ACN. విశ్లేషణాత్మక కాలమ్ 50°C వద్ద నిర్వహించబడుతుంది. FAIMS పరిహార వోల్టేజ్ ప్రకారం అసలు ఫైల్‌ను విభజించడానికి ఫ్రీస్టైల్ (వెర్షన్ 1.6, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించండి.
ప్రోటీన్ గుర్తింపు మరియు పరిమాణీకరణ. ఇంటిగ్రేటెడ్ ఆండ్రోమెడ సెర్చ్ ఇంజిన్‌ను ఉపయోగించి, అసలు డేటాను MaxQuant వెర్షన్ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. Aequorea victoria నుండి పొందిన Cre recombinase మరియు YFP సీక్వెన్స్‌లతో పాటు, పెప్టైడ్ ఫ్రాగ్మెంట్ స్పెక్ట్రాను మౌస్ రిఫరెన్స్ ప్రోటీమ్ యొక్క కానానికల్ సీక్వెన్స్ మరియు ఐసోఫార్మ్ సీక్వెన్స్ కోసం శోధించారు (ప్రోటీమ్ ID UP000000589, మే 2017లో UniProt నుండి డౌన్‌లోడ్ చేయబడింది). మెథియోనిన్ ఆక్సీకరణ మరియు ప్రోటీన్ N-టెర్మినల్ ఎసిటైలేషన్ వేరియబుల్ సవరణలుగా సెట్ చేయబడ్డాయి; సిస్టీన్ కార్బమోయిల్ మిథైలేషన్ స్థిర మార్పులుగా సెట్ చేయబడింది. జీర్ణక్రియ పారామితులు "నిర్దిష్టత" మరియు "ట్రిప్సిన్/P"కి సెట్ చేయబడ్డాయి. ప్రోటీన్ గుర్తింపు కోసం ఉపయోగించే పెప్టైడ్‌లు మరియు రేజర్ పెప్టైడ్‌ల కనీస సంఖ్య 1; ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల కనీస సంఖ్య 0. పెప్టైడ్ మ్యాప్ మ్యాచింగ్ పరిస్థితులలో, ప్రోటీన్ గుర్తింపు రేటు 0.01. "సెకండ్ పెప్టైడ్" ఎంపిక ప్రారంభించబడింది. వేర్వేరు అసలు ఫైళ్ల మధ్య విజయవంతమైన గుర్తింపులను బదిలీ చేయడానికి “రన్‌ల మధ్య మ్యాచ్” ఎంపికను ఉపయోగించండి. లేబుల్-రహిత క్వాంటిఫికేషన్ (LFQ) కోసం LFQ కనీస నిష్పత్తి గణన 1ని ఉపయోగించండి (60). ప్రతి సమయ బిందువు వద్ద కనీసం ఒక జన్యురూప సమూహంలో కనీసం రెండు చెల్లుబాటు అయ్యే విలువల కోసం LFQ తీవ్రత ఫిల్టర్ చేయబడుతుంది మరియు వెడల్పుతో సాధారణ పంపిణీ నుండి ఎక్స్‌ట్రాపోలేట్ చేయబడుతుంది. 0.3 మరియు క్రిందికి 1.8. LFQ ఫలితాలను విశ్లేషించడానికి పెర్సియస్ కంప్యూటింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్ (https://maxquant.net/perseus/) మరియు R (https://r-project.org/)ని ఉపయోగించండి. అవకలన వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ కోసం లిమ్మా సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ నుండి రెండు-మార్గం మోడరేట్ t పరీక్షను ఉపయోగించారు (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally మరియు pheatmap ఉపయోగించి అన్వేషణాత్మక డేటా విశ్లేషణ నిర్వహించబడుతుంది. TMT-ఆధారిత ప్రోటీమిక్స్ డేటాను MaxQuant వెర్షన్ 1.6.10.43 ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. సెప్టెంబర్ 2018లో డౌన్‌లోడ్ చేయబడిన UniProt యొక్క హ్యూమన్ ప్రోటీమిక్స్ డేటాబేస్ నుండి ముడి ప్రోటీమిక్స్ డేటా కోసం శోధించండి. విశ్లేషణలో తయారీదారు అందించిన ఐసోటోప్ స్వచ్ఛత కరెక్షన్ ఫ్యాక్టర్ ఉంటుంది. అవకలన వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ కోసం Rలో లిమ్మాను ఉపయోగించండి. అసలు డేటా, డేటాబేస్ శోధన ఫలితాలు మరియు డేటా విశ్లేషణ వర్క్‌ఫ్లో మరియు ఫలితాలు అన్నీ డేటా సెట్ ఐడెంటిఫైయర్ PXD019690తో PRIDE భాగస్వామి రిపోజిటరీ ద్వారా ProteomeXchange అలయన్స్‌లో నిల్వ చేయబడతాయి.
ఫంక్షనల్ ఉల్లేఖనాలు విశ్లేషణను సుసంపన్నం చేస్తాయి. 8 వారాలలో డేటా సెట్ యొక్క ఫంక్షనల్ ఉల్లేఖన నిబంధనల యొక్క గొప్పతనాన్ని నిర్ణయించడానికి ఇంజెనిటీ పాత్ వే విశ్లేషణ (QIAGEN) సాధనం ఉపయోగించబడింది (చిత్రం 1). సంక్షిప్తంగా, LC-MS/MS (టాండమ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ) డేటా విశ్లేషణ నుండి పొందిన పరిమాణాత్మక ప్రోటీన్ జాబితా క్రింది ఫిల్టర్ ప్రమాణాలతో ఉపయోగించబడుతుంది: మస్ మస్క్యులస్ జాతులు మరియు నేపథ్యంగా ఎంపిక చేయబడింది మరియు వర్గం బెంజమిని 0.05 లేదా అంతకంటే తక్కువ సుసంపన్నం కోసం సర్దుబాటు చేసిన P విలువను ముఖ్యమైనదిగా పరిగణిస్తుంది. ఈ గ్రాఫ్ కోసం, సర్దుబాటు చేయబడిన P విలువ ఆధారంగా ప్రతి క్లస్టర్‌లోని మొదటి ఐదు అదనపు వర్గాలు చూపబడ్డాయి. బహుళ t-పరీక్షను ఉపయోగించి, బెంజమిని, క్రీగర్ మరియు యెకుటియెలి (Q = 5%) యొక్క రెండు-దశల లీనియర్ బూస్ట్ ప్రోగ్రామ్‌ను ఉపయోగించి, ప్రతి వర్గంలో గుర్తించబడిన ముఖ్యమైన అభ్యర్థులపై టైమ్-కోర్సు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ నిర్వహించబడుతుంది మరియు ప్రతి వరుసను విడిగా విశ్లేషిస్తారు. స్థిరమైన SDని స్వీకరించాల్సిన అవసరం లేదు.
ఈ అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలను ప్రచురించబడిన డేటాబేస్‌లతో పోల్చడానికి మరియు చిత్రం 1 లో వెన్ రేఖాచిత్రాన్ని రూపొందించడానికి, మేము పరిమాణాత్మక ప్రోటీన్ జాబితాను MitoCarta 2.0 ఉల్లేఖనాలతో (24) కలిపాము. రేఖాచిత్రాన్ని రూపొందించడానికి ఆన్‌లైన్ సాధనం డ్రా వెన్ రేఖాచిత్రం (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ఉపయోగించండి.
ప్రోటీమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించే గణాంక విధానాలపై వివరణాత్మక సమాచారం కోసం, దయచేసి మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ యొక్క సంబంధిత విభాగాన్ని చూడండి. అన్ని ఇతర ప్రయోగాల కోసం, సంబంధిత లెజెండ్‌లో వివరణాత్మక సమాచారాన్ని కనుగొనవచ్చు. వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే, అన్ని డేటా సగటు ± SEMగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు అన్ని గణాంక విశ్లేషణలు గ్రాప్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8.1.2 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి.
ఈ వ్యాసం కోసం అనుబంధ సామగ్రి కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల ప్రకారం పంపిణీ చేయబడిన ఓపెన్ యాక్సెస్ ఆర్టికల్, ఇది ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగం, పంపిణీ మరియు పునరుత్పత్తిని అనుమతిస్తుంది, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు పని సరైనదే అనే ఆవరణలో. సూచన.
గమనిక: మీరు పేజీకి సిఫార్సు చేసిన వ్యక్తికి మీరు ఇమెయిల్ చూడాలనుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలుసుకోవడానికి మాత్రమే మేము మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను అందించమని అడుగుతాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సంగ్రహించము.
మీరు సందర్శకులో ఉన్నారో లేదో పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నిరోధించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
E. మోటోరి, I. అటనాసోవ్, SMV కొచన్, K. ఫోల్జ్-డోనాహ్యూ, V. శక్తివేలు, P. గియావాలిస్కో, N. టోని, J. పుయల్, N.-G ద్వారా. లార్సన్
పనిచేయని న్యూరాన్ల ప్రోటీమిక్స్ విశ్లేషణ న్యూరోడిజనరేషన్‌ను ఎదుర్కోవడానికి జీవక్రియ కార్యక్రమాలు సక్రియం చేయబడతాయని వెల్లడించింది.
E. మోటోరి, I. అటనాసోవ్, SMV కొచన్, K. ఫోల్జ్-డోనాహ్యూ, V. శక్తివేలు, P. గియావాలిస్కో, N. టోని, J. పుయల్, N.-G ద్వారా. లార్సన్
పనిచేయని న్యూరాన్ల ప్రోటీమిక్స్ విశ్లేషణ న్యూరోడిజనరేషన్‌ను ఎదుర్కోవడానికి జీవక్రియ కార్యక్రమాలు సక్రియం చేయబడతాయని వెల్లడించింది.
©2020 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.