కణితి సూక్ష్మ పర్యావరణం (TME) యొక్క ముఖ్య లక్షణం ఇమ్యునోమోడ్యులేటరీ మెటాబోలైట్లు, కానీ కొన్ని మినహాయింపులతో, వాటి గుర్తింపులు ఎక్కువగా తెలియవు. ఇక్కడ, హై-గ్రేడ్ సీరస్ కార్సినోమా (HGSC) ఉన్న రోగుల కణితులు మరియు అసైట్‌ల నుండి కణితులు మరియు T కణాలను విశ్లేషించి, ఈ విభిన్న TME విభాగాల జీవక్రియను వెల్లడించాము. అసైట్‌లు మరియు కణితి కణాలు విస్తృతమైన జీవక్రియ వ్యత్యాసాలను కలిగి ఉంటాయి. అసైట్‌లతో పోలిస్తే, కణితి-చొరబాటు T కణాలు 1-మిథైల్‌నికోటినామైడ్ (MNA)లో గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉంటాయి. T కణాలలో MNA స్థాయి పెరిగినప్పటికీ, నికోటినామైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ (S-అడెనోసిల్మెథియోనిన్ నుండి నికోటినామైడ్‌కు మిథైల్ సమూహాల బదిలీని ఉత్ప్రేరకపరిచే ఎంజైమ్) యొక్క వ్యక్తీకరణ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు మరియు కణితి కణాలకే పరిమితం. క్రియాత్మకంగా, కణితిని ప్రోత్సహించే సైటోకైన్ ట్యూమర్ నెక్రోసిస్ ఫ్యాక్టర్ ఆల్ఫాను స్రవించడానికి MNA T కణాలను ప్రేరేపిస్తుంది. అందువల్ల, TME-ఉత్పన్నమైన MNA T కణాల రోగనిరోధక నియంత్రణకు దోహదం చేస్తుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు సంభావ్య ఇమ్యునోథెరపీ లక్ష్యాన్ని సూచిస్తుంది.
కణితి నుండి ఉత్పన్నమయ్యే జీవక్రియలు కణితి నిరోధక రోగనిరోధక శక్తిపై తీవ్ర నిరోధక ప్రభావాన్ని చూపుతాయి మరియు వ్యాధి పురోగతికి కీలకమైన చోదక శక్తిగా కూడా పనిచేస్తాయని మరిన్ని ఆధారాలు చూపిస్తున్నాయి (1). వార్‌బర్గ్ ప్రభావంతో పాటు, కణితి కణాల జీవక్రియ స్థితిని మరియు కణితి సూక్ష్మ పర్యావరణం (TME) యొక్క రోగనిరోధక స్థితితో దాని సంబంధాన్ని వర్గీకరించడానికి ఇటీవలి పని ప్రారంభమైంది. మౌస్ నమూనాలు మరియు మానవ T కణాలపై అధ్యయనాలు గ్లూటామైన్ జీవక్రియ (2), ఆక్సీకరణ జీవక్రియ (3) మరియు గ్లూకోజ్ జీవక్రియ (4) వివిధ రోగనిరోధక కణ ఉప సమూహాలపై స్వతంత్రంగా పనిచేయగలవని చూపించాయి. ఈ మార్గాల్లోని అనేక జీవక్రియలు T కణాల యాంటీ-ట్యూమర్ పనితీరును నిరోధిస్తాయి. కోఎంజైమ్ టెట్రాహైడ్రోబయోప్టెరిన్ (BH4) యొక్క దిగ్బంధనం T కణాల విస్తరణను దెబ్బతీస్తుందని మరియు శరీరంలో BH4 పెరుగుదల CD4 మరియు CD8 ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించే యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను పెంచుతుందని నిరూపించబడింది. అదనంగా, BH4 (5) యొక్క పరిపాలన ద్వారా కైనూరెనిన్ యొక్క రోగనిరోధక శక్తిని తగ్గించే ప్రభావాన్ని రక్షించవచ్చు. ఐసోసిట్రేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (IDH) మ్యూటెంట్ గ్లియోబ్లాస్టోమాలో, ఎనాంటియోమెటబాలిక్ (R)-2-హైడ్రాక్సీగ్లుటరేట్ (R-2-HG) స్రావం T సెల్ యాక్టివేషన్, ప్రొలిఫరేషన్ మరియు సైటోలిసిస్ యాక్టివిటీని నిరోధిస్తుంది (6). ఇటీవల, గ్లైకోలిసిస్ యొక్క ఉప-ఉత్పత్తి అయిన మిథైల్గ్లైక్సాల్, మైలోయిడ్ మూలం యొక్క సప్రెసర్ కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి అవుతుందని మరియు మిథైల్గ్లైక్సాల్ యొక్క T సెల్ బదిలీ ఎఫెక్టర్ T సెల్ ఫంక్షన్‌ను నిరోధించగలదని తేలింది. చికిత్సలో, మిథైల్గ్లైక్సాల్ యొక్క తటస్థీకరణ మైలోయిడ్-డెరైవ్డ్ సప్రెసర్ కణాల (MDSC) కార్యకలాపాలను అధిగమించగలదు మరియు మౌస్ నమూనాలలో చెక్‌పాయింట్ బ్లాకేడ్ థెరపీని సినర్జిస్టిక్‌గా మెరుగుపరుస్తుంది (7). ఈ అధ్యయనాలు T సెల్ ఫంక్షన్ మరియు కార్యాచరణను నియంత్రించడంలో TME-ఉత్పన్న జీవక్రియల కీలక పాత్రను సమిష్టిగా నొక్కి చెబుతున్నాయి.
అండాశయ క్యాన్సర్‌లో T సెల్ పనిచేయకపోవడం విస్తృతంగా నివేదించబడింది (8). ఇది హైపోక్సియా మరియు అసాధారణ కణితి వాస్కులేచర్‌లో అంతర్లీనంగా ఉన్న జీవక్రియ లక్షణాల కారణంగా (9), దీని ఫలితంగా గ్లూకోజ్ మరియు ట్రిప్టోఫాన్ లాక్టిక్ ఆమ్లం మరియు కైనూరెనిన్ వంటి ఉప-ఉత్పత్తులుగా మారుతాయి. అధిక ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ లాక్టేట్ ఇంటర్ఫెరాన్-γ (IFN-γ) ఉత్పత్తిని తగ్గిస్తుంది మరియు మైలోసప్రెసివ్ ఉప సమూహాల భేదాన్ని నడిపిస్తుంది (10, 11). ట్రిప్టోఫాన్ వినియోగం నేరుగా T సెల్ విస్తరణను నిరోధిస్తుంది మరియు T సెల్ రిసెప్టర్ సిగ్నలింగ్‌ను నిరోధిస్తుంది (12-14). ఈ పరిశీలనలు ఉన్నప్పటికీ, రోగనిరోధక జీవక్రియ చుట్టూ చాలా పని ఇన్ విట్రో T సెల్ సంస్కృతిలో ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన మీడియాను ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది లేదా ఇన్ వివోలో హోమోలాగస్ మౌస్ మోడళ్లకు పరిమితం చేయబడింది, వీటిలో ఏవీ మానవ క్యాన్సర్ల యొక్క వైవిధ్యతను మరియు శారీరక స్థూల మరియు సూక్ష్మ వాతావరణాన్ని పూర్తిగా ప్రతిబింబించవు.
అండాశయ క్యాన్సర్ యొక్క సాధారణ లక్షణం పెరిటోనియల్ వ్యాప్తి మరియు అసైట్స్ కనిపించడం. అసైట్స్‌లో కణ ద్రవం చేరడం అధునాతన వ్యాధి మరియు పేలవమైన రోగ నిరూపణతో ముడిపడి ఉంటుంది (15). నివేదికల ప్రకారం, ఈ ప్రత్యేకమైన కంపార్ట్‌మెంట్ హైపోక్సిక్, అధిక స్థాయిలో వాస్కులర్ ఎండోథెలియల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (VEGF) మరియు ఇండోలిమైన్ 2,3-డయాక్సిజనేస్ (IDO) కలిగి ఉంటుంది మరియు T నియంత్రణ కణాలు మరియు మైలోయిడ్ ఇన్హిబిటరీ కణాల ద్వారా చొరబడుతుంది (15-18). అసైట్స్ యొక్క జీవక్రియ వాతావరణం కణితి నుండి భిన్నంగా ఉండవచ్చు, కాబట్టి పెరిటోనియల్ ప్రదేశంలో T కణాల పునఃప్రోగ్రామింగ్ అస్పష్టంగా ఉంటుంది. అదనంగా, కణితి వాతావరణంలో ఉన్న అసైట్స్ మరియు మెటాబోలైట్‌ల మధ్య కీలక తేడాలు మరియు వైవిధ్యత రోగనిరోధక కణాల చొరబాటుకు మరియు కణితులపై వాటి పనితీరును అడ్డుకోవచ్చు మరియు మరింత పరిశోధన అవసరం.
ఈ సమస్యలను పరిష్కరించడానికి, వివిధ కణ రకాలను (CD4 + మరియు CD8 + T కణాలతో సహా) అలాగే కణితుల లోపల మరియు మధ్య అధ్యయనం చేయడానికి మేము సున్నితమైన కణ విభజన మరియు ద్రవ క్రోమాటోగ్రఫీ టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS/MS) పద్ధతిని రూపొందించాము. దీని జీవక్రియలు రోగి యొక్క అదే అస్సైట్స్ మరియు కణితి వాతావరణంలో కణాలను విస్తరించి ఉంటాయి. ఈ కీలక జనాభా యొక్క జీవక్రియ స్థితి యొక్క అత్యంత పరిష్కార చిత్రపటాన్ని అందించడానికి మేము ఈ పద్ధతిని హై-డైమెన్షనల్ ఫ్లో సైటోమెట్రీ మరియు సింగిల్-సెల్ RNA సీక్వెన్సింగ్ (scRNA-seq)తో కలిపి ఉపయోగిస్తాము. ఈ పద్ధతి కణితి T కణాలలో 1-మిథైల్నికోటినామైడ్ (MNA) స్థాయిలో గణనీయమైన పెరుగుదలను వెల్లడించింది మరియు ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలు T కణ పనితీరుపై MNA యొక్క ఇమ్యునోమోడ్యులేటరీ ప్రభావం గతంలో తెలియదని చూపించాయి. సాధారణంగా, ఈ పద్ధతి కణితులు మరియు రోగనిరోధక కణాల మధ్య పరస్పర జీవక్రియ పరస్పర చర్యలను వెల్లడిస్తుంది మరియు రోగనిరోధక నియంత్రణ జీవక్రియలపై ప్రత్యేకమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది, ఇది T కణ-ఆధారిత అండాశయ క్యాన్సర్ ఇమ్యునోథెరపీ చికిత్స అవకాశాల చికిత్సకు ఉపయోగపడుతుంది.
గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం [2-(N-(7-నైట్రోఫెనిల్-2-ఆక్సా-1,3-డయాజా-4-yl)అమైనో)-2-డియోక్సిగ్లూకోజ్ (2-NBDG) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ యాక్టివిటీ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) లను ఏకకాలంలో లెక్కించడానికి మేము హై-డైమెన్షనల్ ఫ్లో సైటోమెట్రీని ఉపయోగించాము, ఇవి రోగనిరోధక కణాలు మరియు కణితి కణ జనాభాను వేరు చేసే పక్కపక్కనే ఉన్న సాధారణ గుర్తులు (టేబుల్ S2 మరియు ఫిగర్ S1A). ఈ విశ్లేషణ T కణాలతో పోలిస్తే, అస్సైట్స్ మరియు కణితి కణాలు అధిక గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం స్థాయిలను కలిగి ఉన్నాయని, కానీ మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలలో చిన్న తేడాలను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది. కణితి కణాల సగటు గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T కణాల కంటే మూడు నుండి నాలుగు రెట్లు, మరియు CD4 + T కణాల సగటు గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం CD8 + T కణాల కంటే 1.2 రెట్లు, ఇది కణితి చొరబాటు లింఫోసైట్లు (TIL) ఒకే TMEలో కూడా వేర్వేరు జీవక్రియ అవసరాలను కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తుంది (మూర్తి 1A). దీనికి విరుద్ధంగా, కణితి కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య CD4 + T కణాల మాదిరిగానే ఉంటుంది మరియు రెండు రకాల కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది (మూర్తి 1B). సాధారణంగా, ఈ ఫలితాలు జీవక్రియ స్థాయిని వెల్లడిస్తాయి. కణితి కణాల జీవక్రియ చర్య CD4 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది మరియు CD4 + T కణాల జీవక్రియ చర్య CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది. కణ రకాల్లో ఈ ప్రభావాలు ఉన్నప్పటికీ, కణితులతో పోలిస్తే CD4 + మరియు CD8 + T కణాల జీవక్రియ స్థితిలో లేదా అస్సైట్‌లలో వాటి సాపేక్ష నిష్పత్తిలో స్థిరమైన తేడా లేదు (మూర్తి 1C). దీనికి విరుద్ధంగా, CD45-సెల్ భిన్నంలో, అస్సైట్‌లతో పోలిస్తే కణితిలో EpCAM+ కణాల నిష్పత్తి పెరిగింది (మూర్తి 1D). EpCAM+ మరియు EpCAM- సెల్ భాగాల మధ్య స్పష్టమైన జీవక్రియ వ్యత్యాసాన్ని కూడా మేము గమనించాము. EpCAM+ (కణితి) కణాలు EpCAM- కణాల కంటే ఎక్కువ గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలను కలిగి ఉంటాయి, ఇది TME లోని కణితి కణాలలో ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌ల జీవక్రియ కార్యకలాపాల కంటే చాలా ఎక్కువ (మూర్తి 1, E మరియు F).
(A మరియు B) గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం యొక్క మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత (MFI) (2-NBDG) (A) మరియు CD4 + T కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యాచరణ (MitoTracker ముదురు ఎరుపు) (B) అసైట్స్ మరియు కణితి నుండి ప్రాతినిధ్య గ్రాఫ్‌లు (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి), CD8 + T కణాలు మరియు EpCAM + CD45-కణితి కణాలు. (C) అసైట్స్ మరియు కణితిలో CD4 + మరియు CD8 + కణాల నిష్పత్తి (CD3 + T కణాల నిష్పత్తి). (D) అసైట్స్ మరియు కణితిలో EpCAM + కణితి కణాల నిష్పత్తి (CD45−). (E మరియు F) EpCAM + CD45-కణితి మరియు EpCAM-CD45-మాట్రిక్స్ గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం (2-NBDG) (E) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యాచరణ (MitoTracker ముదురు ఎరుపు) (F) ప్రాతినిధ్య గ్రాఫ్‌లు (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి) అసైట్స్ మరియు కణితి కణాలు. (G) ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా CD25, CD137 మరియు PD1 వ్యక్తీకరణ యొక్క ప్రాతినిధ్య గ్రాఫ్‌లు. (H మరియు I) CD4 + T కణాలు (H) మరియు CD8 + T కణాలు (I) పై CD25, CD137 మరియు PD1 వ్యక్తీకరణ. (J మరియు K) CCR7 మరియు CD45RO యొక్క వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా నైవ్, సెంట్రల్ మెమరీ (Tcm), ఎఫెక్టర్ (Teff) మరియు ఎఫెక్టర్ మెమరీ (Tem) ఫినోటైప్‌లు. అస్సైట్స్ మరియు ట్యూమర్‌లలో CD4 + T కణాలు (J) మరియు CD8 + T కణాలు (K) యొక్క ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి). జత చేసిన t-పరీక్ష (*P<0.05, **P<0.01 మరియు ***P<0.001) ద్వారా నిర్ణయించబడిన P విలువలు. లైన్ సరిపోలిన రోగులను సూచిస్తుంది (n = 6). FMO, ఫ్లోరోసెన్స్ మైనస్ వన్; MFI, మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత.
మరింత విశ్లేషణలో బాగా పరిష్కరించబడిన T సెల్ ఫినోటైపిక్ స్థితి మధ్య ఇతర ముఖ్యమైన తేడాలు వెల్లడయ్యాయి. కణితుల్లో యాక్టివేట్ చేయబడిన (మూర్తి 1, G నుండి I) మరియు ఎఫెక్టర్ మెమరీ (మూర్తి 1, J మరియు K) అసైట్స్ (CD3 + T కణాల నిష్పత్తి) కంటే చాలా తరచుగా ఉంటాయి. అదేవిధంగా, యాక్టివేషన్ మార్కర్స్ (CD25 మరియు CD137) మరియు డిప్లిషన్ మార్కర్స్ [ప్రోగ్రామ్డ్ సెల్ డెత్ ప్రోటీన్ 1 (PD1)] వ్యక్తీకరణ ద్వారా ఫినోటైప్‌ను విశ్లేషించడం వలన ఈ జనాభా యొక్క జీవక్రియ లక్షణాలు భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ (మూర్తి S1, B నుండి E), కానీ అమాయక, ఎఫెక్టర్ లేదా మెమరీ ఉపసమితుల మధ్య ఎటువంటి ముఖ్యమైన జీవక్రియ తేడాలు స్థిరంగా గమనించబడలేదు (మూర్తి S1, F నుండి I). సెల్ ఫినోటైప్‌లను స్వయంచాలకంగా కేటాయించడానికి యంత్ర అభ్యాస పద్ధతులను ఉపయోగించడం ద్వారా ఈ ఫలితాలు నిర్ధారించబడ్డాయి (21), ఇది రోగి యొక్క అసైట్స్‌లో పెద్ద సంఖ్యలో ఎముక మజ్జ కణాలు (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ఉనికిని మరింత వెల్లడించింది (మూర్తి S2A). గుర్తించబడిన అన్ని కణ రకాలలో, ఈ మైలోయిడ్ కణ జనాభా అత్యధిక గ్లూకోజ్ శోషణ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలను చూపించింది (మూర్తి S2, B నుండి G వరకు). ఈ ఫలితాలు HGSC రోగులలో అస్సైట్స్ మరియు కణితుల్లో కనిపించే బహుళ కణ రకాల మధ్య బలమైన జీవక్రియ వ్యత్యాసాలను హైలైట్ చేస్తాయి.
TIL యొక్క జీవక్రియ లక్షణాలను అర్థం చేసుకోవడంలో ప్రధాన సవాలు ఏమిటంటే, కణితుల నుండి తగినంత స్వచ్ఛత, నాణ్యత మరియు పరిమాణం కలిగిన T సెల్ నమూనాలను వేరుచేయడం. ఇటీవలి అధ్యయనాలు ఫ్లో సైటోమెట్రీ ఆధారంగా క్రమబద్ధీకరించడం మరియు పూసల సుసంపన్న పద్ధతులు సెల్యులార్ మెటాబోలైట్ ప్రొఫైల్‌లలో మార్పులకు దారితీయవచ్చని చూపించాయి (22-24). ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, LC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషణకు ముందు శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించబడిన మానవ అండాశయ క్యాన్సర్ నుండి TIL ను వేరుచేయడానికి మరియు వేరుచేయడానికి మేము పూసల సుసంపన్న పద్ధతిని ఆప్టిమైజ్ చేసాము (మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ చూడండి; మూర్తి 2A). మెటాబోలైట్ మార్పులపై ఈ ప్రోటోకాల్ యొక్క మొత్తం ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, పైన పేర్కొన్న పూసల విభజన దశ తర్వాత ఆరోగ్యకరమైన దాతల ద్వారా సక్రియం చేయబడిన T కణాల మెటాబోలైట్ ప్రొఫైల్‌లను పూసలను వేరు చేయని కానీ మంచు మీద ఉన్న కణాలతో పోల్చాము. ఈ నాణ్యత నియంత్రణ విశ్లేషణ ఈ రెండు పరిస్థితుల మధ్య అధిక సహసంబంధం ఉందని కనుగొంది (r = 0.77), మరియు 86 జీవక్రియల సమూహం యొక్క సాంకేతిక పునరావృతత అధిక పునరావృతతను కలిగి ఉందని కనుగొంది (మూర్తి 2B). అందువల్ల, ఈ పద్ధతులు కణ రకం సుసంపన్నతకు గురైన కణాలలో ఖచ్చితమైన జీవక్రియ విశ్లేషణను నిర్వహించగలవు, తద్వారా HGSCలో నిర్దిష్ట జీవక్రియలను గుర్తించడానికి మొదటి అధిక-రిజల్యూషన్ వేదికను అందిస్తాయి, తద్వారా ప్రజలు కణ విశిష్టత లైంగిక జీవక్రియ కార్యక్రమం గురించి లోతైన అవగాహన పొందగలుగుతారు.
(ఎ) అయస్కాంత పూస సుసంపన్నత యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. LC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషణకు ముందు, కణాలు వరుసగా మూడు రౌండ్ల అయస్కాంత పూస సుసంపన్నతకు లోనవుతాయి లేదా మంచు మీద ఉంటాయి. (బి) జీవక్రియల సమృద్ధిపై సుసంపన్నత రకం ప్రభావం. ప్రతి సుసంపన్నత రకం ± SE కోసం మూడు కొలతల సగటు. బూడిద రంగు రేఖ 1:1 సంబంధాన్ని సూచిస్తుంది. అక్షం లేబుల్‌లో చూపబడిన పునరావృత కొలతల ఇంట్రా-క్లాస్ సహసంబంధం (ICC). NAD, నికోటినామైడ్ అడెనిన్ డైన్యూక్లియోటైడ్. (సి) రోగి మెటాబోలైట్ విశ్లేషణ యొక్క వర్క్‌ఫ్లో యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. అసైట్‌లు లేదా కణితులు రోగుల నుండి సేకరించబడతాయి మరియు క్రయోప్రెజర్వ్ చేయబడతాయి. ప్రతి నమూనాలో ఒక చిన్న భాగాన్ని ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు, మిగిలిన నమూనాలు CD4+, CD8+ మరియు CD45- కణాల కోసం మూడు రౌండ్ల సుసంపన్నతకు లోనయ్యాయి. ఈ కణ భిన్నాలను LC-MS/MS ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. (డి) ప్రామాణిక మెటాబోలైట్ సమృద్ధి యొక్క హీట్ మ్యాప్. డెండ్రోగ్రామ్ నమూనాల మధ్య యూక్లిడియన్ దూరాల వార్డ్ యొక్క క్లస్టరింగ్‌ను సూచిస్తుంది. (E) ప్రతి నమూనా యొక్క మూడు ప్రతిరూపాలను చూపించే నమూనా మెటాబోలైట్ మ్యాప్ యొక్క ప్రధాన భాగం విశ్లేషణ (PCA), ఒకే రోగి నుండి నమూనాలను ఒక లైన్ ద్వారా అనుసంధానించారు. (F) రోగిపై కండిషన్ చేయబడిన నమూనా యొక్క మెటాబోలైట్ ప్రొఫైల్ యొక్క PCA (అంటే, పాక్షిక రిడెండెన్సీని ఉపయోగించి); నమూనా రకం కుంభాకార పొట్టు ద్వారా పరిమితం చేయబడింది. PC1, ప్రధాన భాగం 1; PC2, ప్రధాన భాగం 2.
తరువాత, ఆరుగురు HGSC రోగుల ప్రాథమిక అసైట్స్ మరియు కణితులలోని CD4 +, CD8 + మరియు CD45-కణ భిన్నాలలోని 99 జీవక్రియలను విశ్లేషించడానికి మేము ఈ సుసంపన్న పద్ధతిని ఉపయోగించాము (మూర్తి 2C, చిత్రం S3A మరియు పట్టిక S3 మరియు S4). అసలు పెద్ద నమూనా జీవన కణాలలో ఆసక్తి జనాభా 2% నుండి 70% వరకు ఉంటుంది మరియు కణాల నిష్పత్తి రోగుల మధ్య చాలా తేడా ఉంటుంది. పూసలను వేరు చేసిన తర్వాత, ఆసక్తి యొక్క సుసంపన్నమైన భిన్నం (CD4+, CD8+ లేదా CD45-) నమూనాలోని అన్ని జీవ కణాలలో సగటున 85% కంటే ఎక్కువ ఉంటుంది. ఈ సుసంపన్న పద్ధతి మానవ కణితి కణజాల జీవక్రియ నుండి కణ జనాభాను విశ్లేషించడానికి అనుమతిస్తుంది, ఇది పెద్ద నమూనాల నుండి చేయడం అసాధ్యం. ఈ ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి, l-కైనురెనైన్ మరియు అడెనోసిన్, ఈ రెండు బాగా-వర్గీకరించబడిన రోగనిరోధక శక్తిని తగ్గించే జీవక్రియలు కణితి T కణాలు లేదా కణితి కణాలలో (మూర్తి S3, B మరియు C) పెరిగినట్లు మేము నిర్ధారించాము. అందువల్ల, ఈ ఫలితాలు రోగి కణజాలాలలో జీవశాస్త్రపరంగా ముఖ్యమైన జీవక్రియలను కనుగొనడంలో మా కణ విభజన మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ సాంకేతికత యొక్క విశ్వసనీయత మరియు సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి.
మా విశ్లేషణ రోగుల లోపల మరియు రోగుల మధ్య కణ రకాల యొక్క బలమైన జీవక్రియ విభజనను కూడా వెల్లడించింది (మూర్తి 2D మరియు చిత్రం S4A). ముఖ్యంగా, ఇతర రోగులతో పోలిస్తే, రోగి 70 విభిన్న జీవక్రియ లక్షణాలను చూపించాడు (మూర్తి 2E మరియు చిత్రం S4B), రోగుల మధ్య గణనీయమైన జీవక్రియ వైవిధ్యత ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది. ఇతర రోగులతో పోలిస్తే (1.2 నుండి 2 లీటర్లు; టేబుల్ S1), రోగి 70 (80 ml) లో సేకరించిన మొత్తం అస్సైట్‌ల మొత్తం తక్కువగా ఉందని గమనించడం విలువ. ప్రధాన భాగాల విశ్లేషణ సమయంలో (ఉదాహరణకు, పాక్షిక పునరావృత విశ్లేషణను ఉపయోగించి) అంతర్-రోగ్య వైవిధ్యత నియంత్రణ కణ రకాల మధ్య స్థిరమైన మార్పులను చూపుతుంది మరియు కణ రకాలు మరియు/లేదా సూక్ష్మ పర్యావరణం మెటాబోలైట్ ప్రొఫైల్ ప్రకారం స్పష్టంగా సమగ్రపరచబడతాయి (మూర్తి 2F). ఒకే జీవక్రియల విశ్లేషణ ఈ ప్రభావాలను నొక్కి చెప్పింది మరియు కణ రకాలు మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణం మధ్య గణనీయమైన తేడాలను వెల్లడించింది. గమనించిన అత్యంత తీవ్రమైన వ్యత్యాసం MNA అని గమనించడం విలువ, ఇది సాధారణంగా CD45- కణాలలో మరియు కణితిలోకి చొరబడే CD4+ మరియు CD8+ కణాలలో సమృద్ధిగా ఉంటుంది (మూర్తి 3A). CD4 + కణాలకు, ఈ ప్రభావం చాలా స్పష్టంగా ఉంటుంది మరియు CD8 + కణాలలో MNA కూడా పర్యావరణం ద్వారా తీవ్రంగా ప్రభావితమైనట్లు అనిపిస్తుంది. అయితే, ఇది ముఖ్యం కాదు, ఎందుకంటే ఆరుగురు రోగులలో ముగ్గురిని మాత్రమే కణితి CD8+ స్కోర్‌ల కోసం అంచనా వేయవచ్చు. MNA తో పాటు, అసైట్స్ మరియు కణితులలోని వివిధ రకాల కణాలలో, TILలో పేలవంగా వర్గీకరించబడిన ఇతర జీవక్రియలు కూడా విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉంటాయి (గణాంకాలు S3 మరియు S4). అందువల్ల, ఈ డేటా తదుపరి పరిశోధన కోసం ఇమ్యునోమోడ్యులేటరీ జీవక్రియల యొక్క ఆశాజనక సమితిని వెల్లడిస్తుంది.
(ఎ) అస్సైట్స్ మరియు ట్యూమర్ నుండి CD4+, CD8+ మరియు CD45- కణాలలో MNA యొక్క సాధారణీకరించిన కంటెంట్. బాక్స్ ప్లాట్ మీడియన్ (లైన్), ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధి (ఫ్రేమ్ హింజ్) మరియు డేటా పరిధిని చూపిస్తుంది, ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధి (ఫ్రేమ్ విస్కర్) కంటే 1.5 రెట్లు ఎక్కువ. పేషెంట్ మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్‌లో వివరించినట్లుగా, P విలువను నిర్ణయించడానికి రోగి యొక్క లిమ్మా విలువను ఉపయోగించండి (*P<0.05 మరియు **P<0.01). (బి) MNA జీవక్రియ యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (60). జీవక్రియలు: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homosysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide రైబోస్; NMN, నికోటినామైడ్ మోనోన్యూక్లియోటైడ్. ఎంజైమ్‌లు (ఆకుపచ్చ): NNMT, నికోటినామైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్; SIRT, సిర్టుయిన్‌లు; NAMPT, నికోటినామైడ్ ఫాస్ఫోరిబోసిల్ ట్రాన్స్‌ఫేరేస్; AOX1, ఆల్డిహైడ్ ఆక్సిడేస్ 1; NRK, నికోటినామైడ్ రైబోసైడ్ కినేస్; NMNAT, నికోటినామైడ్ మోనో న్యూక్లియోటైడ్ అడెనిలేట్ ట్రాన్స్‌ఫేరేస్; Pnp1, ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్. (C) అస్సైట్స్ (బూడిద) మరియు కణితి (ఎరుపు; n = 3 రోగులు) యొక్క scRNA-seq యొక్క t-SNE. (D) scRNA-seq ఉపయోగించి గుర్తించబడిన వివిధ కణ జనాభాలో NNMT వ్యక్తీకరణ. (E) SK-OV-3, మానవ పిండ మూత్రపిండం (HEK) 293T, T కణాలు మరియు MNA-చికిత్స చేసిన T కణాలలో NNMT మరియు AOX1 యొక్క వ్యక్తీకరణ. మడతపెట్టిన వ్యక్తీకరణ SK-OV-3కి సంబంధించి చూపబడింది. SEMతో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 6 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు). 35 కంటే ఎక్కువ Ct విలువలు గుర్తించలేనివిగా పరిగణించబడతాయి (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T కణాలు మరియు 8mM MNA తో చికిత్స చేయబడిన T కణాలలో SLC22A1 మరియు SLC22A2 యొక్క వ్యక్తీకరణ. మడతపెట్టిన వ్యక్తీకరణ SK-OV-3 కి సంబంధించి చూపబడింది. SEM తో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 6 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు). 35 కంటే ఎక్కువ Ct విలువలు గుర్తించలేనివిగా పరిగణించబడతాయి (UD). (G) MNA తో 72 గంటల పొదిగే తర్వాత సక్రియం చేయబడిన ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలలో సెల్ MNA కంటెంట్. SEM తో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 4 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు).
నికోటినామైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ (NNMT; Figure 3B) ద్వారా S-adenosyl-1-methionine (SAM) నుండి నికోటినామైడ్ (NA) కు మిథైల్ సమూహాన్ని బదిలీ చేయడం ద్వారా MNA ఉత్పత్తి అవుతుంది. NNMT వివిధ రకాల మానవ క్యాన్సర్‌లలో అతిగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు విస్తరణ, దండయాత్ర మరియు మెటాస్టాసిస్‌తో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది (25-27). TME లోని T కణాలలో MNA యొక్క మూలాన్ని బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము ముగ్గురు HGSC రోగుల అస్సైట్స్ మరియు కణితుల్లో కణ రకాల్లో NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణను వర్గీకరించడానికి scRNA-seqని ఉపయోగించాము (టేబుల్ S5). సుమారు 6,500 కణాల విశ్లేషణ అస్సైట్స్ మరియు కణితి వాతావరణాలలో, NNMT వ్యక్తీకరణ ఊహించిన ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ మరియు కణితి కణ జనాభాకు పరిమితం చేయబడిందని చూపించింది (Figure 3, C మరియు D). PTPRC (CD45 +) (Figure 3D మరియు Figure S5A) ను వ్యక్తీకరించే ఏ జనాభాలోనూ స్పష్టమైన NNMT వ్యక్తీకరణ లేదని గమనించడం విలువ, ఇది మెటాబోలైట్ స్పెక్ట్రంలో కనుగొనబడిన MNA T కణాలలోకి ప్రవేశపెట్టబడిందని సూచిస్తుంది. ఆల్డిహైడ్ ఆక్సిడేస్ 1 (AOX1) యొక్క వ్యక్తీకరణ MNA ను 1-మిథైల్-2-పిరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్ (2-PYR) లేదా 1-మిథైల్-4-పిరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్ (4-PYR) గా మారుస్తుంది; Figure 3B) కూడా COL1A1 (Figure S5A) ను వ్యక్తీకరించే ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌ల జనాభాకు పరిమితం చేయబడింది, ఇవి T కణాలకు సాంప్రదాయ MNA జీవక్రియ సామర్థ్యం లేదని సూచిస్తాయి. ఈ MNA-సంబంధిత జన్యువుల వ్యక్తీకరణ నమూనాను HGSC రోగుల నుండి అసైట్‌ల నుండి రెండవ స్వతంత్ర సెల్ డేటా సెట్‌ను ఉపయోగించి ధృవీకరించారు (Figure S5B; n = 6) (16). అదనంగా, MNAతో చికిత్స పొందిన ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాల పరిమాణాత్మక పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (qPCR) విశ్లేషణ నియంత్రణ SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణాలతో పోలిస్తే, NNMT లేదా AOX1 దాదాపుగా వ్యక్తీకరించబడలేదని చూపించింది (Figure 3E). ఈ ఊహించని ఫలితాలు MNA ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు లేదా కణితుల నుండి TMEలోని ప్రక్కనే ఉన్న T కణాలలోకి స్రవించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
అభ్యర్థులలో కరిగే క్యారియర్ 22 (SLC22) కుటుంబం (SLC22A1, SLC22A2 మరియు SLC22A3) ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ఆర్గానిక్ కేషన్ ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌లు 1 నుండి 3 (OCT1, OCT2 మరియు OCT3) కుటుంబం ఉన్నప్పటికీ, MNA యొక్క సంభావ్య ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌లు ఇప్పటికీ నిర్వచించబడలేదు (28). ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాల నుండి mRNA యొక్క QPCR SLC22A1 యొక్క తక్కువ వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను చూపించింది కానీ SLC22A2 యొక్క గుర్తించలేని స్థాయిలను చూపించింది, ఇది గతంలో సాహిత్యంలో నివేదించబడిందని నిర్ధారించింది (మూర్తి 3F) (29). దీనికి విరుద్ధంగా, SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణ రేఖ రెండు ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌ల యొక్క అధిక స్థాయిలను వ్యక్తం చేసింది (మూర్తి 3F).
T కణాలు విదేశీ MNA ను గ్రహించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయో లేదో పరీక్షించడానికి, ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలను వివిధ సాంద్రతల MNA సమక్షంలో 72 గంటల పాటు కల్చర్ చేశారు. బాహ్య MNA లేనప్పుడు, MNA యొక్క సెల్యులార్ కంటెంట్‌ను కనుగొనలేము (మూర్తి 3G). అయితే, బాహ్య MNA తో చికిత్స చేయబడిన యాక్టివేట్ చేయబడిన T కణాలు కణాలలో MNA కంటెంట్‌లో మోతాదు-ఆధారిత పెరుగుదలను చూపించాయి, 6 mM MNA వరకు (మూర్తి 3G). ఈ ఫలితం ట్రాన్స్‌పోర్టర్ వ్యక్తీకరణ తక్కువ స్థాయిలో ఉన్నప్పటికీ మరియు కణాంతర MNA జీవక్రియకు బాధ్యత వహించే ప్రధాన ఎంజైమ్ లేకపోయినా, TIL ఇప్పటికీ MNA ను తీసుకోగలదని సూచిస్తుంది.
రోగుల T కణాలలో జీవక్రియల స్పెక్ట్రం మరియు ఇన్ విట్రో MNA శోషణ ప్రయోగాలు క్యాన్సర్-సంబంధిత ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు (CAF) MNAను స్రవించే అవకాశాన్ని పెంచుతాయి మరియు కణితి కణాలు TIL యొక్క సమలక్షణం మరియు పనితీరును నియంత్రించవచ్చు. T కణాలపై MNA ప్రభావాన్ని నిర్ణయించడానికి, ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలను MNA సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో ఇన్ విట్రోలో సక్రియం చేశారు మరియు వాటి విస్తరణ మరియు సైటోకిన్ ఉత్పత్తిని అంచనా వేశారు. అత్యధిక మోతాదులో MNAని జోడించిన 7 రోజుల తర్వాత, జనాభా రెట్టింపు సంఖ్య మధ్యస్తంగా తగ్గింది, అయితే అన్ని మోతాదులలో శక్తి నిర్వహించబడింది (మూర్తి 4A). అదనంగా, బాహ్య MNA చికిత్స ఫలితంగా కణితి నెక్రోసిస్ కారకం-α (TNFα; చిత్రం 4B)ని వ్యక్తీకరించే CD4 + మరియు CD8 + T కణాల నిష్పత్తిలో పెరుగుదల ఏర్పడింది. దీనికి విరుద్ధంగా, IFN-γ యొక్క కణాంతర ఉత్పత్తి CD4 + T కణాలలో గణనీయంగా తగ్గింది, కానీ CD8 + T కణాలలో కాదు, మరియు ఇంటర్‌లుకిన్ 2 (IL-2; చిత్రం 4, C మరియు D)లో గణనీయమైన మార్పు లేదు. అందువల్ల, ఈ MNA-చికిత్స పొందిన T సెల్ సంస్కృతుల నుండి సూపర్‌నాటెంట్‌ల ఎంజైమ్-లింక్డ్ ఇమ్యునోసోర్బెంట్ అస్సే (ELISA) TNFαలో గణనీయమైన పెరుగుదలను, IFN-γలో తగ్గుదలను మరియు IL-2లో ఎటువంటి మార్పును చూపించలేదు (మూర్తి 4, E నుండి G వరకు). . IFN-γ తగ్గుదల T కణాల యాంటీ-ట్యూమర్ కార్యకలాపాలను నిరోధించడంలో MNA పాత్ర పోషిస్తుందని సూచిస్తుంది. T సెల్-మధ్యవర్తిత్వ సైటోటాక్సిసిటీపై MNA ప్రభావాన్ని అనుకరించడానికి, ఫోలేట్ రిసెప్టర్ α మరియు గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) -CAR-T) కణాలచే నియంత్రించబడే CAR-T (GFP) కణాలను లక్ష్యంగా చేసుకునే చిమెరిక్ యాంటిజెన్ రిసెప్టర్ T (FRα-CAR-T) కణాలు ఆరోగ్యకరమైన దాత పరిధీయ రక్త మోనోన్యూక్లియర్ కణాలు (PBMC) ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడతాయి. CAR-T కణాలను MNA సమక్షంలో 24 గంటలు కల్చర్ చేసి, ఆపై 10:1 యొక్క ఎఫెక్టర్-టార్గెట్ నిష్పత్తిలో ఫోలేట్ రిసెప్టర్ αను వ్యక్తీకరించే మానవ SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణాలతో సహ-కల్చర్ చేశారు. MNA చికిత్స FRα-CAR-T కణాల చంపే చర్యలో గణనీయమైన తగ్గుదలకు దారితీసింది, ఇది అడెనోసిన్‌తో చికిత్స చేయబడిన FRα-CAR-T కణాల మాదిరిగానే ఉంటుంది (మూర్తి 4H).
(ఎ) 7వ రోజు సంస్కృతి నుండి నేరుగా మొత్తం ఆచరణీయ కణాల సంఖ్య మరియు జనాభా రెట్టింపు (PD). బార్ గ్రాఫ్ ఆరుగురు ఆరోగ్యకరమైన దాతల సగటు + SEMని సూచిస్తుంది. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి డేటాను సూచిస్తుంది. (B నుండి D వరకు) CD3/CD28 మరియు IL-2లను 7 రోజుల పాటు వాటి సంబంధిత MNA సాంద్రతలలో T కణాలను సక్రియం చేయడానికి ఉపయోగించారు. విశ్లేషణకు ముందు, కణాలు 4 గంటల పాటు గోల్గిస్టాప్‌తో PMA/ionomycinతో ప్రేరేపించబడ్డాయి. T కణాలలో TNFα (B) వ్యక్తీకరణ. జీవ కణాలలో TNFα వ్యక్తీకరణ యొక్క ఉదాహరణ చిత్రం (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి). T కణాలలో IFN-γ (C) మరియు IL-2 (D) వ్యక్తీకరణ. సైటోకిన్‌ల వ్యక్తీకరణను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా కొలుస్తారు. బార్ గ్రాఫ్ సగటు (n = 6 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు) + SEMని సూచిస్తుంది. P విలువను నిర్ణయించడానికి వైవిధ్యం మరియు పునరావృత కొలతల (*P<0.05 మరియు **P<0.01) యొక్క వన్-వే విశ్లేషణను ఉపయోగించండి. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి డేటాను సూచిస్తుంది. (E నుండి G) CD3/CD28 మరియు IL-2 లను 7 రోజుల పాటు వాటి సంబంధిత MNA సాంద్రతలలో T కణాలను సక్రియం చేయడానికి ఉపయోగించారు. PMA/ionomycin ఉద్దీపనకు 4 గంటల ముందు మరియు తర్వాత మాధ్యమాన్ని సేకరించారు. TNFα (E), IFN-γ (F) మరియు IL-2 (G) యొక్క సాంద్రతలను ELISA ద్వారా కొలుస్తారు. బార్ గ్రాఫ్ సగటు (n = 5 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు) + SEM ను సూచిస్తుంది. వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ మరియు పునరావృత కొలతలు (*P<0.05) ఉపయోగించి నిర్ణయించబడిన P విలువ. చుక్కల రేఖ గుర్తింపు యొక్క గుర్తింపు పరిమితిని సూచిస్తుంది. (H) సెల్ లైసిస్ అస్సే. FRα-CAR-T లేదా GFP-CAR-T కణాలను 24 గంటల పాటు అడెనోసిన్ (250μM) లేదా MNA (10 mM) తో సర్దుబాటు చేశారు లేదా చికిత్స చేయకుండా వదిలేశారు (Ctrl). SK-OV-3 కణాల శాతాన్ని చంపే శాతాన్ని కొలుస్తారు. P విలువను వెల్చ్ t పరీక్ష (*P<0.5 మరియు **P<0.01) ద్వారా నిర్ణయించారు.
MNA-ఆధారిత TNFα వ్యక్తీకరణ నియంత్రణ యొక్క యాంత్రిక అవగాహన పొందడానికి, MNA-చికిత్స పొందిన T కణాల TNFα mRNAలో మార్పులను మూల్యాంకనం చేశారు (మూర్తి 5A). MNAతో చికిత్స పొందిన ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలు TNFα ట్రాన్స్క్రిప్షన్ స్థాయిలలో రెండు రెట్లు పెరుగుదలను చూపించాయి, MNA TNFα ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణపై ఆధారపడి ఉందని సూచిస్తుంది. ఈ సాధ్యమైన నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని పరిశోధించడానికి, TNFαను నియంత్రించే రెండు తెలిసిన ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలు, అవి యాక్టివేటెడ్ T సెల్ న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ (NFAT) మరియు నిర్దిష్ట ప్రోటీన్ 1 (Sp1), MNAను ప్రాక్సిమల్ TNFα ప్రమోటర్‌కు బంధించడానికి ప్రతిస్పందనగా మూల్యాంకనం చేయబడ్డాయి (30). TNFα ప్రమోటర్ 6 గుర్తించబడిన NFAT బైండింగ్ సైట్‌లు మరియు 2 Sp1 బైండింగ్ సైట్‌లను కలిగి ఉంది, ఇవి 5'cap నుండి ఒక సైట్‌లో [-55 బేస్ జతలు (bp)] (30) అతివ్యాప్తి చెందుతాయి. క్రోమాటిన్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (ChIP) MNAతో చికిత్స చేసినప్పుడు, TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 యొక్క బైండింగ్ మూడు రెట్లు పెరిగిందని చూపించింది. NFAT యొక్క విలీనం కూడా పెరిగింది మరియు ప్రాముఖ్యతను చేరుకుంది (మూర్తి 5B). ఈ డేటా MNA, Sp1 ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ద్వారా TNFα యొక్క వ్యక్తీకరణను నియంత్రిస్తుందని మరియు కొంతవరకు NFAT యొక్క వ్యక్తీకరణను నియంత్రిస్తుందని సూచిస్తుంది.
(ఎ) MNA లేకుండా కల్చర్ చేయబడిన T కణాలతో పోలిస్తే, MNA తో చికిత్స చేయబడిన T కణాలలో TNFα వ్యక్తీకరణ యొక్క మడత మార్పు. SEM తో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 5 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు). కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి డేటాను సూచిస్తుంది. (బి) NFAT మరియు Sp1 తర్వాత 8 mM MNA తో లేదా లేకుండా చికిత్స చేయబడిన T కణాల TNFα ప్రమోటర్‌ను 4 గంటల పాటు (Ctrl) మరియు PMA/ionomycin స్టిమ్యులేషన్‌తో కలిపారు. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ కోసం ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ G (IgG) మరియు H3లను వరుసగా ప్రతికూల మరియు సానుకూల నియంత్రణలుగా ఉపయోగించారు. ChIP యొక్క పరిమాణీకరణ MNA-చికిత్స చేయబడిన కణాలలో TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 మరియు NFAT యొక్క బంధం నియంత్రణతో పోలిస్తే చాలా రెట్లు పెరిగిందని చూపించింది. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి డేటాను సూచిస్తుంది. బహుళ t-పరీక్షల ద్వారా నిర్ణయించబడిన P విలువ (*** P <0.01). (సి) HGSC యొక్క అస్సైట్‌లతో పోలిస్తే, T కణాలు (సైటోటాక్సిక్ కానివి) కణితిలో TNF యొక్క పెరిగిన వ్యక్తీకరణను చూపించాయి. రంగులు వేర్వేరు రోగులను సూచిస్తాయి. ప్రదర్శించబడిన కణాలను యాదృచ్ఛికంగా 300 కు నమూనా చేసి, ఓవర్‌డ్రాయింగ్‌ను పరిమితం చేయడానికి కదిలించారు (** పాడ్జ్ = 0.0076). (D) అండాశయ క్యాన్సర్ కోసం MNA యొక్క ప్రతిపాదిత నమూనా. TME లోని కణితి కణాలు మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో MNA ఉత్పత్తి అవుతుంది మరియు T కణాల ద్వారా తీసుకోబడుతుంది. MNA TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 యొక్క బంధాన్ని పెంచుతుంది, ఇది TNFα ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు TNFα సైటోకిన్ ఉత్పత్తిని పెంచుతుంది. MNA IFN-γ లో తగ్గుదలకు కూడా కారణమవుతుంది. T సెల్ ఫంక్షన్ నిరోధం చంపే సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు కణితి పెరుగుదలను వేగవంతం చేస్తుంది.
నివేదికల ప్రకారం, TNFα ముందు మరియు వెనుక-ఆధారిత యాంటీ-ట్యూమర్ మరియు యాంటీ-ట్యూమర్ ప్రభావాలను కలిగి ఉంటుంది, కానీ అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదల మరియు మెటాస్టాసిస్‌ను ప్రోత్సహించడంలో ఇది ప్రసిద్ధ పాత్రను కలిగి ఉంది (31-33). నివేదికల ప్రకారం, అండాశయ క్యాన్సర్ ఉన్న రోగులలో అస్సైట్స్ మరియు కణితి కణజాలాలలో TNFα సాంద్రత నిరపాయకరమైన కణజాలాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది (34-36). యంత్రాంగం పరంగా, TNFα తెల్ల రక్త కణాల క్రియాశీలత, పనితీరు మరియు విస్తరణను నియంత్రించగలదు మరియు క్యాన్సర్ కణాల సమలక్షణాన్ని మార్చగలదు (37, 38). ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, అవకలన జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ అస్సైట్స్‌తో పోలిస్తే కణితి కణజాలాలలో T కణాలలో TNF గణనీయంగా నియంత్రించబడిందని చూపించింది (మూర్తి 5C). TNF వ్యక్తీకరణలో పెరుగుదల నాన్-సైటోటాక్సిక్ ఫినోటైప్ (మూర్తి S5A) కలిగిన T సెల్ జనాభాలో మాత్రమే స్పష్టంగా కనిపించింది. సారాంశంలో, ఈ డేటా HGSCలో MNA ద్వంద్వ రోగనిరోధక శక్తిని తగ్గించే మరియు కణితిని ప్రోత్సహించే ప్రభావాలను కలిగి ఉందనే అభిప్రాయానికి మద్దతు ఇస్తుంది.
TIL జీవక్రియను అధ్యయనం చేయడానికి ఫ్లో సైటోమెట్రీ ఆధారంగా ఫ్లోరోసెంట్ లేబులింగ్ ప్రధాన పద్ధతిగా మారింది. ఈ అధ్యయనాలు పరిధీయ రక్త లింఫోసైట్లు లేదా ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాల నుండి వచ్చే T కణాలతో పోలిస్తే, మురైన్ మరియు మానవ TIL గ్లూకోజ్‌ను తీసుకునే ధోరణిని ఎక్కువగా కలిగి ఉన్నాయని చూపించాయి (4, 39) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ ఫంక్షన్ క్రమంగా కోల్పోవడం (19, 40). ఈ అధ్యయనంలో మేము ఇలాంటి ఫలితాలను గమనించినప్పటికీ, కీలకమైన అభివృద్ధి ఏమిటంటే కణితి కణాలు మరియు అదే విచ్ఛేదనం చేయబడిన కణితి కణజాలం నుండి TIL యొక్క జీవక్రియను పోల్చడం. ఈ మునుపటి కొన్ని నివేదికలకు అనుగుణంగా, అస్సైట్స్ మరియు కణితుల నుండి వచ్చే కణితి (CD45-EpCAM +) కణాలు CD8 + మరియు CD4 + T కణాల కంటే ఎక్కువ గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం కలిగి ఉంటాయి, కణితి కణాల అధిక గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం T కణాలతో పోల్చవచ్చని మద్దతు ఇస్తుంది. T కణ పోటీ భావన. TME. అయితే, కణితి కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది, కానీ మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య CD4 + T కణాల మాదిరిగానే ఉంటుంది. ఈ ఫలితాలు కణితి కణాలకు ఆక్సీకరణ జీవక్రియ ముఖ్యమనే ఉద్భవిస్తున్న థీమ్‌ను బలోపేతం చేస్తాయి (41, 42). CD8 + T కణాలు CD4 + T కణాల కంటే ఆక్సీకరణ పనిచేయకపోవడానికి ఎక్కువ అవకాశం ఉందని లేదా CD4 + T కణాలు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలను నిర్వహించడానికి గ్లూకోజ్ కాకుండా ఇతర కార్బన్ వనరులను ఉపయోగించవచ్చని కూడా వారు సూచిస్తున్నారు (43, 44). CD4 + T ఎఫెక్టర్లు, T ఎఫెక్టర్ మెమరీ మరియు అస్సైట్స్‌లోని T సెంట్రల్ మెమరీ కణాల మధ్య గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలలో ఎటువంటి తేడా లేదని మేము గమనించాలి. అదేవిధంగా, కణితుల్లో CD8 + T కణాల భేద స్థితి గ్లూకోజ్ తీసుకోవడంలో మార్పులతో సంబంధం లేదు, ఇది విట్రోలో కల్చర్ చేయబడిన T కణాలు మరియు వివోలో మానవ TIL మధ్య గణనీయమైన వ్యత్యాసాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది (22). ఈ పరిశీలనలు నిష్పాక్షికమైన ఆటోమేటిక్ సెల్ జనాభా కేటాయింపును ఉపయోగించడం ద్వారా కూడా నిర్ధారించబడ్డాయి, ఇది కణితి కణాల కంటే ఎక్కువ గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలతో CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + కణాలు ప్రబలంగా ఉన్నాయని కానీ జీవక్రియ క్రియాశీల కణ జనాభాను కలిగి ఉన్నాయని వెల్లడించింది. ఈ జనాభా scRNA-seq విశ్లేషణలో గుర్తించబడిన మైలోయిడ్ సప్రెసర్ కణాలు లేదా ప్లాస్మాసైటోయిడ్ డెన్డ్రిటిక్ కణాల పుటేటివ్ సబ్‌పోపులేషన్‌ను సూచిస్తుంది. ఈ రెండూ మానవ అండాశయ కణితుల్లో [45] నివేదించబడినప్పటికీ, వాటికి ఇంకా అవసరం ఈ మైలోయిడ్ ఉప జనాభాను వివరించడానికి మరింత కృషి అవసరం.
ఫ్లో సైటోమెట్రీ-ఆధారిత పద్ధతులు కణ రకాల మధ్య గ్లూకోజ్ మరియు ఆక్సీకరణ జీవక్రియలో సాధారణ తేడాలను స్పష్టం చేయగలిగినప్పటికీ, TMEలో మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియ కోసం గ్లూకోజ్ లేదా ఇతర కార్బన్ వనరుల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఖచ్చితమైన జీవక్రియలు ఇంకా నిర్ణయించబడలేదు. ఇచ్చిన TIL ఉపసమితికి జీవక్రియల ఉనికిని లేదా లేకపోవడాన్ని కేటాయించడానికి ఎక్సైజ్ చేయబడిన కణజాలం నుండి కణ జనాభాను శుద్ధి చేయడం అవసరం. అందువల్ల, మా కణ సుసంపన్న పద్ధతి మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కలిపి రోగి నమూనాలను సరిపోల్చడంలో T కణాలు మరియు కణితి కణ జనాభాలో విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న జీవక్రియలపై అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది. ఈ పద్ధతి ఫ్లోరోసెన్స్-యాక్టివేటెడ్ సెల్ సార్టింగ్ కంటే ప్రయోజనాలను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, కొన్ని మెటాబోలైట్ లైబ్రరీలు స్వాభావిక స్థిరత్వం మరియు/లేదా వేగవంతమైన టర్నోవర్ రేటు కారణంగా ప్రభావితమవుతాయి (22). అయినప్పటికీ, మా పద్ధతి రెండు గుర్తించబడిన రోగనిరోధక శక్తిని తగ్గించే జీవక్రియలను, అడెనోసిన్ మరియు కైనూరెనిన్‌ను గుర్తించగలిగింది, ఎందుకంటే అవి నమూనా రకాల మధ్య చాలా తేడా ఉంటాయి.
కణితులు మరియు TIL ఉపరకాల యొక్క మా జీవక్రియ విశ్లేషణ అండాశయ TME లో జీవక్రియల పాత్రపై మరిన్ని అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది. మొదట, ఫ్లో సైటోమెట్రీని ఉపయోగించి, కణితులు మరియు CD4 + T కణాల మధ్య మైటోకాన్డ్రియల్ చర్యలో ఎటువంటి తేడా లేదని మేము నిర్ధారించాము. అయితే, LC-MS/MS విశ్లేషణ ఈ జనాభాలో జీవక్రియల సమృద్ధిలో గణనీయమైన మార్పులను వెల్లడించింది, TIL జీవక్రియ మరియు దాని మొత్తం జీవక్రియ కార్యకలాపాల గురించి తీర్మానాలకు జాగ్రత్తగా వివరణ అవసరమని సూచిస్తుంది. రెండవది, MNA అనేది కణితులు కాకుండా అస్సైట్స్‌లోని CD45-కణాలు మరియు T కణాల మధ్య అత్యధిక వ్యత్యాసంతో జీవక్రియ. అందువల్ల, కంపార్టమెంటలైజేషన్ మరియు కణితి స్థానం TIL జీవక్రియపై విభిన్న ప్రభావాలను కలిగి ఉండవచ్చు, ఇది ఇచ్చిన సూక్ష్మ వాతావరణంలో సాధ్యమయ్యే వైవిధ్యతను హైలైట్ చేస్తుంది. మూడవదిగా, MNA-ఉత్పత్తి చేసే ఎంజైమ్ NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణ ప్రధానంగా CAF కి పరిమితం చేయబడింది, ఇది కణితి కణాలు కొంతవరకు, కానీ గుర్తించదగిన MNA స్థాయిలు కణితి-ఉత్పన్న T కణాలలో గమనించబడతాయి. అండాశయ CAF లో NNMT యొక్క అతిగా వ్యక్తీకరణ తెలిసిన క్యాన్సర్-ప్రోత్సాహక ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది, పాక్షికంగా CAF జీవక్రియ, కణితి దండయాత్ర మరియు మెటాస్టాసిస్ (27) యొక్క ప్రచారం కారణంగా. TIL యొక్క మొత్తం స్థాయి మధ్యస్థంగా ఉన్నప్పటికీ, CAFలో NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణ క్యాన్సర్ జీనోమ్ అట్లాస్ (TCGA) మెసెన్‌చైమల్ సబ్టైప్‌తో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, ఇది పేలవమైన రోగ నిరూపణతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది (27, 46, 47). చివరగా, MNA క్షీణతకు కారణమైన AOX1 ఎంజైమ్ యొక్క వ్యక్తీకరణ కూడా CAF జనాభాకు పరిమితం చేయబడింది, ఇది T కణాలు MNAని జీవక్రియ చేసే సామర్థ్యాన్ని కలిగి లేవని సూచిస్తుంది. ఈ అన్వేషణను ధృవీకరించడానికి మరింత కృషి అవసరం అయినప్పటికీ, T కణాలలో అధిక స్థాయి MNA రోగనిరోధక శక్తిని తగ్గించే CAF సూక్ష్మ పర్యావరణం ఉనికిని సూచిస్తుందనే ఆలోచనకు ఈ ఫలితాలు మద్దతు ఇస్తున్నాయి.
MNA ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌ల యొక్క తక్కువ వ్యక్తీకరణ స్థాయి మరియు MNA జీవక్రియలో పాల్గొన్న కీలక ప్రోటీన్‌ల గుర్తించలేని స్థాయిల దృష్ట్యా, T కణాలలో MNA ఉనికి ఊహించనిది. NNMT లేదా AOX1 రెండింటినీ scRNA-seq విశ్లేషణ మరియు రెండు స్వతంత్ర సమూహాల లక్ష్య qPCR ద్వారా గుర్తించలేము. ఈ ఫలితాలు MNA T కణాల ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడలేదని, కానీ చుట్టుపక్కల TME నుండి గ్రహించబడిందని సూచిస్తున్నాయి. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలు T కణాలు బాహ్య MNAని కూడబెట్టుకుంటాయని చూపిస్తున్నాయి.
మా ఇన్ విట్రో అధ్యయనాలు బాహ్య MNA T కణాలలో TNFα యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుందని మరియు TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 యొక్క బంధాన్ని పెంచుతుందని చూపించాయి. TNFα యాంటీ-ట్యూమర్ మరియు యాంటీ-ట్యూమర్ ఫంక్షన్‌లను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, అండాశయ క్యాన్సర్‌లో, TNFα అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదలను ప్రోత్సహిస్తుంది (31-33). అండాశయ కణితి కణ సంస్కృతిలో TNFα యొక్క తటస్థీకరణ లేదా మౌస్ నమూనాలలో TNFα సిగ్నల్‌ను తొలగించడం వలన TNFα-మధ్యవర్తిత్వ శోథ సైటోకిన్ ఉత్పత్తి మెరుగుపడుతుంది మరియు కణితి పెరుగుదలను నిరోధిస్తుంది (32, 35). అందువల్ల, ఈ సందర్భంలో, TME-ఉత్పన్నమైన MNA ఆటోక్రిన్ లూప్ ద్వారా TNFα-ఆధారిత యంత్రాంగం ద్వారా ప్రో-ఇన్‌ఫ్లమేటరీ మెటాబోలైట్‌గా పనిచేస్తుంది, తద్వారా అండాశయ క్యాన్సర్ సంభవించడం మరియు వ్యాప్తి చెందడాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది (31). ఈ అవకాశం ఆధారంగా, అండాశయ క్యాన్సర్‌కు సంభావ్య చికిత్సా ఏజెంట్‌గా TNFα దిగ్బంధనను అధ్యయనం చేస్తున్నారు (37, 48, 49). అదనంగా, MNA అండాశయ కణితి కణాలకు CAR-T కణాల సైటోటాక్సిసిటీని బలహీనపరుస్తుంది, MNA-మధ్యవర్తిత్వ రోగనిరోధక అణచివేతకు మరింత ఆధారాలను అందిస్తుంది. సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు కణితులు మరియు CAF కణాలు MNA ను ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ TME లోకి స్రవించే నమూనాను సూచిస్తున్నాయి. (i) TNF- ప్రేరిత అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదల ఉద్దీపన మరియు (ii) MNA- ప్రేరిత T సెల్ సైటోటాక్సిక్ కార్యకలాపాల నిరోధం ద్వారా, ఇది ద్వంద్వ కణితి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉండవచ్చు (మూర్తి 5D).
ముగింపులో, వేగవంతమైన కణ సుసంపన్నం, సింగిల్-సెల్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు జీవక్రియ ప్రొఫైలింగ్ కలయికను వర్తింపజేయడం ద్వారా, ఈ అధ్యయనం HGSC రోగులలో కణితులు మరియు అసైట్స్ కణాల మధ్య భారీ ఇమ్యునోమెటబోలోమిక్ వ్యత్యాసాలను వెల్లడించింది. ఈ సమగ్ర విశ్లేషణ T కణాల మధ్య గ్లూకోజ్ తీసుకోవడం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలలో తేడాలు ఉన్నాయని చూపించింది మరియు MNA ను నాన్-సెల్ అటానమస్ ఇమ్యూన్ రెగ్యులేటరీ మెటాబోలైట్‌గా గుర్తించింది. ఈ డేటా TME మానవ క్యాన్సర్లలో T సెల్ జీవక్రియను ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందనే దానిపై ప్రభావం చూపుతుంది. T కణాలు మరియు క్యాన్సర్ కణాల మధ్య పోషకాల కోసం ప్రత్యక్ష పోటీ నివేదించబడినప్పటికీ, జీవక్రియలు కణితి పురోగతిని ప్రోత్సహించడానికి మరియు ఎండోజెనస్ రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను అణచివేయడానికి పరోక్ష నియంత్రకాలుగా కూడా పనిచేస్తాయి. ఈ నియంత్రణ జీవక్రియల యొక్క క్రియాత్మక పాత్ర యొక్క మరింత వివరణ యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను పెంచడానికి ప్రత్యామ్నాయ వ్యూహాలను తెరవవచ్చు.
కెనడియన్ టిష్యూ రిపోజిటరీ నెట్‌వర్క్ ధృవీకరించిన BC క్యాన్సర్ ట్యూమర్ టిష్యూ రిపోజిటరీ ద్వారా రోగి నమూనాలు మరియు క్లినికల్ డేటాను పొందారు. BC క్యాన్సర్ రీసెర్చ్ ఎథిక్స్ కమిటీ మరియు బ్రిటిష్ కొలంబియా విశ్వవిద్యాలయం (H07-00463) ఆమోదించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, అన్ని రోగుల నమూనాలు మరియు క్లినికల్ డేటా సమాచారంతో కూడిన లిఖిత సమ్మతిని పొందాయి లేదా అధికారికంగా వారి సమ్మతిని వదులుకున్నాయి. నమూనాలను సర్టిఫైడ్ బయోబ్యాంక్ (BRC-00290)లో నిల్వ చేస్తారు. వివరణాత్మక రోగి లక్షణాలు పట్టికలు S1 మరియు S5లో చూపబడ్డాయి. క్రయోప్రెజర్వేషన్ కోసం, రోగి కణితి నమూనాను యాంత్రికంగా కుళ్ళిపోయి, ఆపై ఒకే కణ సస్పెన్షన్ పొందడానికి 100-మైక్రాన్ ఫిల్టర్ ద్వారా నెట్టడానికి స్కాల్పెల్ ఉపయోగించబడుతుంది. కణాలను గుళికలుగా చేసి సూపర్‌నాటెంట్‌ను తొలగించడానికి రోగి యొక్క అసిట్‌లను 1500 rpm వద్ద 10 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. కణితి మరియు అస్సైట్స్ నుండి పొందిన కణాలను 50% వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన మానవ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్), 40% RPMI-1640 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 10% డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్‌లో క్రయోప్రెజర్డ్ చేశారు. ఈ సంరక్షించబడిన సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌లను కరిగించి, క్రింద వివరించిన జీవక్రియ మరియు జీవక్రియ నిర్ధారణ కోసం ఉపయోగించారు.
పూర్తి మాధ్యమంలో 0.22 μm ఫిల్టర్ చేయబడిన 50:50 అనుబంధ RPMI 1640: AimV ఉంటుంది. RPMI 1640 + 2.05 mM l-గ్లుటామైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) 10% వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన మానవ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్), 12.5 mM హెప్స్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్), 2 mM l-గ్లుటామైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఫిషర్ సైంటిఫిక్, 1 x పెన్సిలిన్ స్ట్రెప్టోమైసిన్ (పెన్‌స్ట్రెప్) ద్రావణం (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 50 μMB-మెర్కాప్టోఇథనాల్‌తో అనుబంధించబడింది. AimV (ఇన్విట్రోజెన్) 20 mM హెప్స్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 2 mM l-గ్లుటామైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)తో అనుబంధించబడింది. ఫ్లో సైటోమీటర్ స్టెయినింగ్ బఫర్ 0.22μm ఫిల్టర్ చేయబడిన ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS; ఇన్విట్రోజెన్)ను 3% వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన AB మానవ సీరం (సిగ్మా)తో అనుబంధించబడింది. సెల్ ఎన్‌రిచ్మెంట్ బఫర్ 0.22μm ఫిల్టర్ చేసిన PBSతో కూడి ఉంటుంది మరియు 0.5% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ హ్యూమన్ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)తో అనుబంధంగా ఉంటుంది.
37°C పూర్తి మాధ్యమంలో, కణాలను 10 nM MT DR మరియు 100 μM 2-NBDG తో 30 నిమిషాలు మరక చేశారు. తరువాత, కణాలను 4°C వద్ద 15 నిమిషాలు వయబిలిటీ డై eF506 తో మరక చేశారు. FC బ్లాక్ (eBioscience) మరియు బ్రిలియంట్ స్టెయిన్ బఫర్ (BD బయోసైన్సెస్) లోని కణాలను తిరిగి అమర్చండి, ఫ్లో సైటోమీటర్ స్టెయినింగ్ బఫర్‌లో (తయారీదారు సూచనల ప్రకారం) కరిగించండి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు పొదిగించండి. 4°C వద్ద ఫ్లో సైటోమెట్రీ స్టెయినింగ్ బఫర్‌లో 20 నిమిషాలు యాంటీబాడీల సమితితో (టేబుల్ S2) కణాలను మరక చేయండి. విశ్లేషణకు ముందు ఫ్లో సైటోమెట్రీ స్టెయినింగ్ బఫర్ (సైటెక్ అరోరా; 3L-16V-14B-8R కాన్ఫిగరేషన్) లోని కణాలను తిరిగి అమర్చండి. సెల్ కౌంట్ డేటాను విశ్లేషించడానికి స్పెక్ట్రోఫ్లో మరియు ఫ్లోజో V10 ని ఉపయోగించండి మరియు డేటాను సృష్టించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8 ని ఉపయోగించండి. 2-NBDG మరియు MT DR యొక్క మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత (MFI) లాగ్-నార్మలైజ్ చేయబడింది, ఆపై సరిపోలిన రోగులను లెక్కించడానికి గణాంక విశ్లేషణ కోసం జత చేసిన t పరీక్షను ఉపయోగించారు. విశ్లేషణ నుండి 40 కంటే తక్కువ సంఘటనలు ఉన్న అన్ని జనాభాను తొలగించండి; గణాంక విశ్లేషణ మరియు డేటా విజువలైజేషన్ చేసే ముందు ఏదైనా ప్రతికూల విలువలకు 1 యొక్క MFI విలువను నమోదు చేయండి.
పైన పేర్కొన్న ప్రాసెస్ ప్యానెల్ యొక్క మాన్యువల్ గేటింగ్ వ్యూహాన్ని పూర్తి చేయడానికి, FlowJoలో చనిపోయిన కణాలను తొలగించిన తర్వాత జనాభాకు కణాలను స్వయంచాలకంగా కేటాయించడానికి మేము ఆకార పరిమితి చెట్టు (FAUST) (21) ద్వారా పూర్తి ఉల్లేఖనాన్ని ఉపయోగించాము. తప్పుగా కేటాయించబడినట్లు కనిపించే జనాభాను (PD1+ని PD1-ట్యూమర్ కణాలతో కలపడం) మరియు నిలుపుకున్న జనాభాను విలీనం చేయడానికి మేము అవుట్‌పుట్‌ను మాన్యువల్‌గా నిర్వహిస్తాము. ప్రతి నమూనాలో మొత్తం 11 జనాభాకు సగటున 2% కంటే ఎక్కువ కణాలు ఉంటాయి.
ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తుల నుండి PBMCని వేరు చేయడానికి ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ఉపయోగించబడింది (STEMCELL టెక్నాలజీస్). తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, CD8 + T కణాలను CD8 మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెన్యి) ఉపయోగించి PBMC నుండి వేరుచేసి, TransAct (మిల్టెన్యి) ఉపయోగించి 2 వారాల పాటు పూర్తి మాధ్యమంలో విస్తరించారు. IL-7 (10 ng/ml; పెప్రోటెక్) కలిగిన పూర్తి మాధ్యమంలో కణాలు 5 రోజులు నిలబడటానికి అనుమతించబడ్డాయి, ఆపై TransActతో తిరిగి ప్రేరేపించబడ్డాయి. 7వ రోజు, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, మానవ CD45 మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెన్యి)ని వరుసగా మూడు రౌండ్లలో కణాలను సుసంపన్నం చేయడానికి ఉపయోగించారు. ఫ్లో సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ కోసం కణాలను ఆల్కోట్ చేశారు (పైన వివరించిన విధంగా), మరియు LC-MS/MS విశ్లేషణ కోసం ఒక మిలియన్ కణాలను మూడుసార్లు ఆల్కోట్ చేశారు. క్రింద వివరించిన విధంగా నమూనాలను LC-MS/MS ద్వారా ప్రాసెస్ చేశారు. 1,000 అయాన్ సంఖ్యతో తప్పిపోయిన మెటాబోలైట్ విలువను మేము అంచనా వేసాము. ప్రతి నమూనా మొత్తం అయాన్ సంఖ్య (TIC) ద్వారా సాధారణీకరించబడుతుంది, విశ్లేషణకు ముందు MetaboAnalystRలో లాగరిథమిక్‌గా మార్చబడుతుంది మరియు స్వయంచాలకంగా సాధారణీకరించబడుతుంది.
ప్రతి రోగి యొక్క సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌ను కరిగించి, 40 μm ఫిల్టర్ ద్వారా పూర్తి మాధ్యమంలోకి ఫిల్టర్ చేశారు (పైన వివరించిన విధంగా). తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెని) ఉపయోగించి మాగ్నెటిక్ బీడ్ సెపరేషన్ ద్వారా వరుసగా మూడు రౌండ్ల పాజిటివ్ సెలక్షన్‌ను CD8+, CD4+ మరియు CD45- కణాల (మంచుపై) నమూనాలను సుసంపన్నం చేయడానికి ఉపయోగించారు. సంక్షిప్తంగా, కణాలను సెల్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ బఫర్‌లో (పైన వివరించిన విధంగా) తిరిగి అమర్చి లెక్కించారు. కణాలను 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు మానవ CD8 పూసలు, మానవ CD4 పూసలు లేదా మానవ CD45 పూసలు (మిల్టెని)తో పొదిగించి, ఆపై సెల్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ బఫర్‌తో కడుగుతారు. నమూనాను LS కాలమ్ (మిల్టెని) గుండా పంపుతారు మరియు సానుకూల మరియు ప్రతికూల భిన్నాలను సేకరిస్తారు. వ్యవధిని తగ్గించడానికి మరియు సెల్ రికవరీ దశను పెంచడానికి, CD8-భిన్నాన్ని CD4+ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ యొక్క రెండవ రౌండ్ కోసం ఉపయోగిస్తారు మరియు CD4-భిన్నాన్ని తదుపరి CD45-ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కోసం ఉపయోగిస్తారు. విభజన ప్రక్రియ అంతటా ద్రావణాన్ని మంచు మీద ఉంచండి.
మెటాబోలైట్ విశ్లేషణ కోసం నమూనాలను సిద్ధం చేయడానికి, కణాలను ఒకసారి ఐస్-కోల్డ్ సాల్ట్ ద్రావణంతో కడిగి, ప్రతి నమూనాకు 1 మి.లీ. 80% మిథనాల్ జోడించారు, తరువాత వోర్టెక్స్ చేసి ద్రవ నైట్రోజన్‌లో స్తంభింపజేశారు. నమూనాలను మూడు ఫ్రీజ్-థా సైకిల్స్‌కు గురిచేసి 14,000 rpm వద్ద 15 నిమిషాలు 4°C వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. మెటాబోలైట్‌లను కలిగి ఉన్న సూపర్‌నాటెంట్ ఎండిపోయే వరకు ఆవిరైపోతుంది. మెటాబోలైట్‌లను 50 μl 0.03% ఫార్మిక్ ఆమ్లంలో తిరిగి కరిగించి, కలపడానికి వోర్టెక్స్ చేసి, ఆపై శిధిలాలను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.
పైన వివరించిన విధంగా జీవక్రియలను సంగ్రహించండి. జీవక్రియ పరిశోధన కోసం సూపర్‌నాటెంట్‌ను అధిక పనితీరు గల ద్రవ క్రోమాటోగ్రఫీ బాటిల్‌కు బదిలీ చేయండి. బ్యాచ్ ప్రభావాలను నివారించడానికి ప్రతి నమూనాను ఒకే సంఖ్యలో కణాలతో చికిత్స చేయడానికి యాదృచ్ఛిక చికిత్స ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించండి. AB SCIEX QTRAP 5500 ట్రిపుల్ క్వాడ్రూపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (50)లో గతంలో ప్రచురించబడిన గ్లోబల్ జీవక్రియల గుణాత్మక అంచనాను మేము నిర్వహించాము. మల్టీక్వాంట్ వెర్షన్ 2.1 సాఫ్ట్‌వేర్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ SCIEX) ఉపయోగించి క్రోమాటోగ్రాఫిక్ విశ్లేషణ మరియు పీక్ ఏరియా ఇంటిగ్రేషన్ నిర్వహించబడ్డాయి.
తప్పిపోయిన మెటాబోలైట్ విలువను అంచనా వేయడానికి 1000 అయాన్ కౌంట్ ఉపయోగించబడింది మరియు ప్రతి నమూనా యొక్క TIC నమూనా ప్రాసెసింగ్ నుండి వాయిద్య విశ్లేషణ ద్వారా ప్రవేశపెట్టబడిన మార్పులను సరిచేయడానికి ప్రతి కనుగొనబడిన మెటాబోలైట్ యొక్క సాధారణీకరించిన పీక్ ప్రాంతాన్ని లెక్కించడానికి ఉపయోగించబడింది. TIC సాధారణీకరించబడిన తర్వాత, MetaboAnalystR(51) (డిఫాల్ట్ పరామితి) లాగరిథమిక్ మార్పిడి మరియు ఆటోమేటిక్ నార్మ్ లైన్ స్కేలింగ్ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది. నమూనా రకాల మధ్య జీవక్రియ వ్యత్యాసాల అన్వేషణాత్మక విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మేము వీగన్ R ప్యాకేజీతో PCAని ఉపయోగించాము మరియు రోగులను విశ్లేషించడానికి పాక్షిక రిడెండెన్సీ విశ్లేషణను ఉపయోగించాము. నమూనాల మధ్య యూక్లిడియన్ దూరాన్ని క్లస్టర్ చేయడానికి హీట్ మ్యాప్ డెండ్రోగ్రామ్‌ను నిర్మించడానికి వార్డ్ పద్ధతిని ఉపయోగించండి. మొత్తం సెల్ రకం మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణంలో విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న జీవక్రియలను గుర్తించడానికి మేము ప్రామాణిక మెటాబోలైట్ సమృద్ధిపై లిమ్మా (52)ని ఉపయోగించాము. వివరణను సరళీకృతం చేయడానికి, మోడల్‌ను పేర్కొనడానికి మేము గ్రూప్ మీన్ పరామితిని ఉపయోగిస్తాము మరియు సూక్ష్మ వాతావరణంలోని సెల్ రకాలను ప్రతి సమూహంగా పరిగణిస్తాము (n = 6 సమూహాలు); ప్రాముఖ్యత పరీక్ష కోసం, మేము ప్రతి మెటాబోలైట్‌కు మూడుసార్లు కొలతలు చేసాము. తప్పుడు ప్రతిరూపణను నివారించడానికి, రోగిని లిమ్మా డిజైన్‌లో అడ్డంకిగా చేర్చారు. వివిధ రోగుల మధ్య జీవక్రియలలో తేడాలను తనిఖీ చేయడానికి, రోగులతో సహా లిమ్మా మోడల్‌ను స్థిరమైన మార్గంలో సర్దుబాటు చేసాము. సెల్ రకం మరియు పాడ్జ్ <0.05 (బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ కరెక్షన్) యొక్క సూక్ష్మ పర్యావరణం మధ్య ముందుగా పేర్కొన్న వ్యత్యాసం యొక్క ప్రాముఖ్యతను మేము నివేదిస్తాము.
మిల్టెని డెడ్ సెల్ రిమూవల్ కిట్ (> 80% వయబిలిటీ) ఉపయోగించి వైజరీ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ తర్వాత, 10x 5′జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించి మొత్తం లైవ్ ఫ్రోజెన్ అసైట్స్ మరియు ట్యూమర్ శాంపిల్స్‌పై సింగిల్-సెల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ సీక్వెన్సింగ్ నిర్వహించబడింది. మ్యాచింగ్ ట్యూమర్లు మరియు అసైట్స్ ఉన్న ఐదు కేసులను విశ్లేషించారు, అయితే ఒక ట్యూమర్ నమూనా నుండి తక్కువ వయబిలిటీ దాని చేరికను నిరోధించింది. రోగుల బహుళ ఎంపికలను సాధించడానికి, మేము 10x క్రోమియం కంట్రోలర్ యొక్క లేన్‌లలో ప్రతి రోగి యొక్క నమూనాలను కలిపి, అసైట్స్ మరియు ట్యూమర్ సైట్‌లను విడిగా విశ్లేషించాము. సీక్వెన్సింగ్ తర్వాత [ఇల్యూమినా హైసెక్ 4000 28×98 బిపి జత చేసిన ముగింపు (PE), క్యూబెక్ జీనోమ్; కణితి మరియు అసిటిస్ కోసం సగటున కణానికి 73,488 మరియు 41,378 రీడ్‌లు]], మేము CellSNP మరియు Vireo (53) లను ఉపయోగించాము (సెల్‌ఎస్‌ఎన్‌పి ఆధారంగా GRCh38 అందించిన సాధారణ మానవ SNP (VCF) దాత గుర్తింపును కేటాయించింది. రోగి యొక్క జన్యురూప స్థితి (IBS) యొక్క దగ్గరి గుర్తింపు (IBS)ని అంచనా వేయడానికి మేము SNPRelateని ఉపయోగిస్తాము, కేటాయించబడని కణాలు మరియు డ్యూప్లెక్స్‌లుగా గుర్తించబడిన కణాలు మరియు అస్సైట్స్ మరియు ట్యూమర్ నమూనాల మధ్య సరిపోలే దాతలను మినహాయించి (54). ఈ పని ఆధారంగా, దిగువ విశ్లేషణ కోసం కణితి మరియు అసిట్స్‌లో సమృద్ధిగా కణ ప్రాతినిధ్యంతో మూడు కేసులను మేము నిలుపుకున్నాము. స్కాటర్ (55) మరియు స్క్రాన్ (56) బయోకండక్టర్ ప్యాకేజింగ్‌లో ద్రవ్యరాశి వడపోత దశను నిర్వహించిన తర్వాత, ఇది విశ్లేషణ కోసం 6975 కణాలను (వరుసగా కణితి మరియు అసిట్స్ నుండి 2792 మరియు 4183 కణాలు) ఇచ్చింది. మేము భాగస్వామ్య సమీప పొరుగు నెట్‌వర్క్ (SNN) యొక్క ఇగ్రాఫ్ (57) లౌవైన్ క్లస్టరింగ్‌ను ఉపయోగిస్తాము. వ్యక్తీకరణ ద్వారా క్లస్టర్ కణాలకు జాకార్డ్ దూరం ఆధారంగా. మార్కర్ జన్యు వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా పుటేటివ్ సెల్ రకాలకు క్లస్టర్‌లను మాన్యువల్‌గా ఉల్లేఖించారు మరియు t-SNEతో దృశ్యమానం చేశారు. సైటోటాక్సిక్ T కణాలు CD8A మరియు GZMA యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా నిర్వచించబడ్డాయి, తక్కువ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణతో సబ్‌క్లస్టర్‌లను మినహాయించాయి. ఇజార్ మరియు ఇతరుల (16) ప్రచురించిన డేటాను మేము యాక్సెస్ చేసాము, వాటి t-SNE ఎంబెడ్డింగ్‌తో సహా, రోగనిరోధక కణ గుర్తులు మరియు NNMT వ్యక్తీకరణ మధ్య వ్యక్తీకరణ అతివ్యాప్తిని నియంత్రించవచ్చు.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తులు (STEMCELL టెక్నాలజీస్) నుండి PBMC వేరు చేయబడ్డాయి. CD3 + కణాలు CD3 పూసలు (మిల్టెని) ఉపయోగించి PBMC నుండి వేరు చేయబడ్డాయి. MNA సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో, CD3+ కణాలు ప్లేట్-బౌండ్ CD3 (5μg/ml), కరిగే CD28 (3μg/ml) మరియు IL-2 (300 U/ml; ప్రోలూకిన్) తో సక్రియం చేయబడ్డాయి. విస్తరణ చివరి రోజున, వయబిలిటీ (ఫిక్సబుల్ వయబిలిటీ డై eFluor450, eBioscience) మరియు ప్రొలిఫరేషన్ (123కౌంట్ eBeads, Thermo Fisher Scientific) ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా మూల్యాంకనం చేయబడ్డాయి. గోల్గిస్టాప్‌తో PMA (20 ng/ml) మరియు అయానోమైసిన్ (1μg/ml) ఉన్న కణాలను 4 గంటల పాటు ఉత్తేజపరచడం ద్వారా ఎఫెక్టర్ పనితీరును అంచనా వేయండి మరియు CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) మరియు TNFα-ఫ్లోరోసెసిన్ ఐసోథియోసైనేట్ (FITC) (MAb11, BD) లను పర్యవేక్షించండి. 4 గంటల పాటు PMA (20 ng/ml) మరియు అయానోమైసిన్ (1μg/ml) తో qPCR మరియు ChIP కణాలను ఉత్తేజపరచండి. ELISA సూపర్‌నాటెంట్‌ను PMA (20 ng/ml) మరియు అయానోమైసిన్ (1 μg/ml) తో ఉద్దీపనకు ముందు మరియు తరువాత 4 గంటల పాటు సేకరించారు.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ఉపయోగించి RNA ను వేరుచేయడానికి తయారీదారు ప్రోటోకాల్‌ను అనుసరించండి. నమూనాను సజాతీయపరచడానికి QIAshredder (QIAGEN) ను ఉపయోగించండి. పరిపూరక DNA (cDNA) ను సంశ్లేషణ చేయడానికి అధిక-సామర్థ్య RNA నుండి cDNA కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ను ఉపయోగించండి. జన్యు వ్యక్తీకరణను (తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం) ఈ క్రింది ప్రోబ్‌లతో లెక్కించడానికి TaqMan Rapid Advanced Master Mix (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ను ఉపయోగించండి: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [గ్లైసెరాల్డిహైడ్-3-ఫాస్ఫేట్ ఆఫ్ హైడ్రోజన్ (GAPDH)] మరియు Hs01010726_m1 (SLC22A2). మైక్రోఆంప్ ఆప్టికల్ ఫిల్మ్‌తో మైక్రోఆంప్ ఫాస్ట్ ఆప్టికల్ 96-వెల్ రియాక్షన్ ప్లేట్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్)లోని స్టెప్‌వన్‌ప్లస్ రియల్-టైమ్ పిసిఆర్ సిస్టమ్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్) (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్) పై నమూనాలను అమలు చేశారు. 35 కంటే ఎక్కువ ఉన్న ఏదైనా సిటి విలువ డిటెక్షన్ థ్రెషోల్డ్ పైన ఉన్నట్లు పరిగణించబడుతుంది మరియు గుర్తించలేనిదిగా గుర్తించబడుతుంది.
గతంలో వివరించిన విధంగా ChIPని నిర్వహించండి (58). సంక్షిప్తంగా, కణాలను ఫార్మాల్డిహైడ్‌తో చికిత్స చేసి (తుది సాంద్రత 1.42%) గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు పొదిగించారు. 10 నిమిషాలు మంచు మీద అనుబంధ వాపు బఫర్ (25 mM హెపెస్, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl మరియు 0.1% NP-40)ని ఉపయోగించండి, ఆపై వివరించిన విధంగా ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చండి (58). అప్పుడు నమూనాను ఈ క్రింది చక్రాలతో సోనికేట్ చేశారు: 10 చక్రాలు (20 1-సెకండ్ పల్స్‌లు) మరియు 40 సెకన్ల స్టాటిక్ సమయం. ChIP-గ్రేడ్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ G (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 1μl), హిస్టోన్ H3 (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 3μl), NFAT (ఇన్విట్రోజెన్; 3μl) మరియు SP1 (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 3μl) యాంటీబాడీలను రాత్రిపూట 4°CC షేక్ వద్ద నమూనాతో ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రోటీన్ A పూసలను (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) 4°C వద్ద నమూనాతో 1 గంట పాటు సున్నితంగా కదిలించి, ఇంక్యుబేట్ చేయండి, ఆపై DNA ని సుసంపన్నం చేయడానికి చెలెక్స్ పూసలను (బయో-రాడ్) ఉపయోగించండి మరియు ప్రోటీన్ జీర్ణక్రియ కోసం ప్రోటీనేస్ K (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించండి. TNFα ప్రమోటర్ PCR ద్వారా గుర్తించబడింది: ఫార్వర్డ్, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; దీనికి విరుద్ధంగా, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ఉత్పత్తి). చిత్రాలను ఇమేజ్ ల్యాబ్ (బయో-రాడ్) రూపొందించింది మరియు ఇమేజ్‌జే సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించి లెక్కించబడింది.
పైన వివరించిన విధంగా సెల్ కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించారు. మానవ TNFα ELISA కిట్ (ఇన్విట్రోజెన్), మానవ IL-2 ELISA కిట్ (ఇన్విట్రోజెన్) మరియు మానవ IFN-γ ELISA కిట్ (Abcam) తయారీదారు విధానాల ప్రకారం ఈ నిర్ధారణ జరిగింది. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, TNFα మరియు IL-2 లను గుర్తించడానికి సూపర్‌నాటెంట్‌ను 1:100 నిష్పత్తిలో మరియు IFN-γ లను గుర్తించడానికి 1:3 నిష్పత్తిలో కరిగించారు. 450 nm వద్ద శోషణను కొలవడానికి EnVision 2104 మల్టీలేబుల్ రీడర్ (పెర్కిన్ఎల్మర్) ఉపయోగించండి.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తులు (STEMCELL టెక్నాలజీస్) నుండి PBMCని వేరు చేశారు. CD3 పూసలు (మిల్టెని) ఉపయోగించి CD3 + కణాలను PBMC నుండి వేరు చేశారు. MNA సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో, CD3+ కణాలను ప్లేట్-బౌండ్ CD3 (5μg/ml), కరిగే CD28 (3μg/ml) మరియు IL-2 (300 U/ml; ప్రోలుకిన్) తో 3 రోజుల పాటు సక్రియం చేశారు. 3 రోజుల తర్వాత, కణాలను సేకరించి 0.9% సెలైన్‌తో కడిగి, గుళికను స్నాప్ ఫ్రీజ్ చేశారు. 123కౌంట్ eBeads ఉపయోగించి ఫ్లో సైటోమెట్రీ (సైటెక్ అరోరా; 3L-16V-14B-8R కాన్ఫిగరేషన్) ద్వారా సెల్ కౌంట్‌ను నిర్వహించారు.
పైన వివరించిన విధంగా జీవక్రియలను సంగ్రహించండి. ఎండిన సారం 4000 సెల్ సమానమైనవి/μl సాంద్రత వద్ద పునర్నిర్మించబడింది. రివర్స్డ్-ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (1290 ఇన్ఫినిటీ II, ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, శాంటా క్లారా, CA) మరియు CORTECS T3 కాలమ్ (2.1×150 mm, కణ పరిమాణం 1.6-μm, పోర్ పరిమాణం 120-Å; #186008500, వాటర్స్) ద్వారా నమూనాను విశ్లేషించండి. పోలార్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (6470, ఎజిలెంట్), దీనిలో ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ సానుకూల రీతిలో పనిచేస్తుంది. మొబైల్ దశ A 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం (H2O లో), మొబైల్ దశ B 90% అసిటోనిట్రైల్, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం. LC ప్రవణత 100% A కి 0 నుండి 2 నిమిషాలు, 99% B కి 2 నుండి 7.1 నిమిషాలు మరియు 99% B కి 7.1 నుండి 8 నిమిషాలు. తరువాత 3 నిమిషాల పాటు 0.6 ml/min ప్రవాహం రేటుతో మొబైల్ దశ A తో కాలమ్‌ను తిరిగి సమతౌల్యం చేయండి. . ప్రవాహం రేటు 0.4ml/min, మరియు కాలమ్ చాంబర్ 50°C కు వేడి చేయబడుతుంది. నిలుపుదల సమయం (RT) మరియు పరివర్తన (RT = 0.882 నిమిషాలు, పరివర్తన 1 = 137→94.1, పరివర్తన 2 = 137→92, మార్పిడి 3 = 137→78) ను స్థాపించడానికి MNA యొక్క స్వచ్ఛమైన రసాయన ప్రమాణాన్ని (M320995, టొరంటో రీసెర్చ్ కెమికల్ కంపెనీ, నార్త్ యార్క్, ఒంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించండి. మూడు పరివర్తనాలు సరైన నిలుపుదల సమయంలో జరిగినప్పుడు, నిర్దిష్టతను నిర్ధారించడానికి పరివర్తన 1 పరిమాణీకరణ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది. MNA (టొరంటో రీసెర్చ్ కెమికల్ కంపెనీ) యొక్క ప్రామాణిక వక్రత వరుసగా 0.1, 1.0, 10 మరియు 100 ng/ml మరియు 1.0 మరియు 10μg/ml ద్రవ ప్రమాణాలను పొందడానికి స్టాక్ ద్రావణం (1 mg/ml) యొక్క ఆరు సీరియల్ డైల్యూషన్ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడింది. గుర్తింపు పరిమితి 1 ng/ml, మరియు లీనియర్ ప్రతిస్పందన 10 ng/ml మరియు 10μg/ml మధ్య ఉంటుంది. LC/MS విశ్లేషణ కోసం రెండు మైక్రోలీటర్ల నమూనా మరియు ప్రమాణం యొక్క ప్రతి ఇంజెక్షన్ ఉపయోగించబడుతుంది మరియు విశ్లేషణ వేదిక యొక్క స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి ప్రతి ఎనిమిది ఇంజెక్షన్లకు మిశ్రమ నాణ్యత నియంత్రణ నమూనాను అమలు చేస్తారు. అన్ని MNA-చికిత్స చేసిన సెల్ నమూనాల MNA ప్రతిస్పందనలు పరీక్ష యొక్క లీనియర్ పరిధిలో ఉన్నాయి. డేటా విశ్లేషణ MassHunter పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ సాఫ్ట్‌వేర్ (v9.0, Agilent) ఉపయోగించి జరిగింది.
రెండవ తరం αFR-CAR నిర్మాణం సాంగ్ మరియు ఇతరుల నుండి తీసుకోబడింది. (59). సంక్షిప్తంగా, నిర్మాణంలో ఈ క్రింది విషయాలు ఉన్నాయి: CD8a లీడర్ సీక్వెన్స్, హ్యూమన్ αFR-నిర్దిష్ట సింగిల్-చైన్ వేరియబుల్ ఫ్రాగ్మెంట్, CD8a హింజ్ మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రాంతం, CD27 ఇంట్రాసెల్యులర్ డొమైన్ మరియు CD3z ఇంట్రాసెల్యులర్ డొమైన్. పూర్తి CAR శ్రేణిని GenScript ద్వారా సంశ్లేషణ చేశారు, ఆపై ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి ఉపయోగించే GFP ఎక్స్‌ప్రెషన్ క్యాసెట్ యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్‌లో రెండవ తరం లెంటివైరల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్‌లోకి క్లోన్ చేశారు.
లెంటివైరస్ HEK293T కణాల ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ ద్వారా ఉత్పత్తి అవుతుంది [అమెరికన్ టైప్ కల్చర్ కలెక్షన్ (ATCC); 10% ఫీటల్ బోవిన్ సీరం (FBS) మరియు 1% పెన్‌స్ట్రెప్ కలిగిన డల్బెకో యొక్క సవరించిన ఈగిల్ మాధ్యమంలో పెరుగుతుంది మరియు CAR-GFP వెక్టర్‌ను ఉపయోగిస్తుంది మరియు ప్యాకేజింగ్ ప్లాస్మిడ్‌లు (psPAX2 మరియు pMD2.G, యాడ్‌జీన్) లిపోఫెక్షన్ అమైన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)ను ఉపయోగిస్తాయి. వైరస్ కలిగిన సూపర్‌నాటెంట్‌ను ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ తర్వాత 48 మరియు 72 గంటల తర్వాత సేకరించి, ఫిల్టర్ చేసి, అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కేంద్రీకరించారు. ట్రాన్స్‌డక్షన్ వరకు -80°C వద్ద సాంద్రీకృత వైరల్ సూపర్‌నాటెంట్‌ను నిల్వ చేయండి.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ఆరోగ్యకరమైన దాత ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తులు (STEMCELL టెక్నాలజీస్) నుండి PBMC వేరు చేయబడతాయి. PBMC నుండి CD8+ కణాలను వేరు చేయడానికి పాజిటివ్ సెలెక్షన్ CD8 మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెని) ఉపయోగించండి. T కణాలను TransAct (మిల్టెని) తో మరియు TexMACS మాధ్యమంలో ఉత్తేజపరచండి [మిల్టెని; 3% వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన మానవ సీరం, 1% పెన్‌స్ట్రెప్ మరియు IL-2 (300 U/ml) తో అనుబంధించబడింది]. ఉద్దీపన తర్వాత ఇరవై నాలుగు గంటల తర్వాత, T కణాలను లెంటివైరస్ (106 కణాలకు 10 μl సాంద్రీకృత వైరస్ సూపర్‌నాటెంట్) తో ప్రసారం చేశారు. సైటెక్ అరోరా (FSC (ఫార్వర్డ్ స్కాటర్)/SSC (సైడ్ స్కాటర్), సింగ్లెట్, GFP+ పై ట్రాన్స్‌డక్షన్ తర్వాత 1 నుండి 3 రోజులు), కనీసం 30% ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శించడానికి కణాల GFP వ్యక్తీకరణను అంచనా వేయండి.
CAR-T కణాలను ఇమ్యునోకల్ట్ (STEMCELL టెక్నాలజీస్; 1% పెన్‌స్ట్రెప్‌తో అనుబంధంగా)లో 24 గంటల పాటు ఈ క్రింది పరిస్థితులలో కల్చర్ చేశారు: చికిత్స చేయబడలేదు, 250 μM అడెనోసిన్ లేదా 10 mM MNAతో చికిత్స చేయబడింది. ముందస్తు చికిత్స తర్వాత, CAR-T కణాలను PBSతో కడిగి 20,000 SK-OV-3 కణాలతో కలిపారు [ATCC; మెక్‌కాయ్ 5A మాధ్యమంలో (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) 10% FBS మరియు 1% పెన్‌స్ట్రెప్‌తో అనుబంధంగా 10 వద్ద: 1 యొక్క లక్ష్య నిష్పత్తికి ప్రభావకారి అనుబంధ ఇమ్యునోకల్ట్ మాధ్యమంలో ట్రిప్లికేట్‌గా విస్తరించబడింది. SK-OV-3 కణాలు మరియు డిజిటాలిస్ సాపోనిన్ (0.5mg/ml; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)తో లైస్ చేయబడిన SK-OV-3 కణాలు వరుసగా ప్రతికూల మరియు సానుకూల నియంత్రణలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి. 24 గంటల సహ-సాగు తర్వాత, సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించి, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం లాక్టేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (LDH) ను కొలుస్తారు (LDH గ్లో సైటోటాక్సిసిటీ అస్సే కిట్, ప్రోమెగా). LDH సూపర్‌నాటెంట్‌ను LDH బఫర్‌లో 1:50 నిష్పత్తిలో కరిగించారు. చంపే శాతం ఈ క్రింది సూత్రాన్ని ఉపయోగించి కొలుస్తారు: చంపే శాతం = దిద్దుబాటు శాతం / గరిష్ట చంపే రేటు x 100%, ఇక్కడ దిద్దుబాటు శాతం = కో-కల్చర్-T కణాలు మాత్రమే, మరియు గరిష్ట చంపే రేటు = సానుకూల నియంత్రణ-ప్రతికూల నియంత్రణ.
టెక్స్ట్ లేదా మెటీరియల్స్ మరియు పద్ధతులలో వివరించిన విధంగా, గణాంక విశ్లేషణ కోసం గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8, మైక్రోసాఫ్ట్ ఎక్సెల్ లేదా R v3.6.0 ఉపయోగించండి. ఒకే రోగి నుండి బహుళ నమూనాలను (అస్సైట్స్ మరియు ట్యూమర్ వంటివి) సేకరిస్తే, మేము జత చేసిన టి పరీక్షను ఉపయోగిస్తాము లేదా రోగిని సరళ లేదా సాధారణీకరించిన నమూనాలో యాదృచ్ఛిక ప్రభావంగా చేర్చుతాము. జీవక్రియ విశ్లేషణ కోసం, ప్రాముఖ్యత పరీక్షను మూడుసార్లు నిర్వహిస్తారు.
ఈ వ్యాసం కోసం అనుబంధ సామగ్రి కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల ప్రకారం పంపిణీ చేయబడిన ఓపెన్ యాక్సెస్ ఆర్టికల్, ఇది ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగం, పంపిణీ మరియు పునరుత్పత్తిని అనుమతిస్తుంది, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు పని సరైనదే అనే ఆవరణలో. సూచన.
గమనిక: మీరు పేజీకి సిఫార్సు చేసిన వ్యక్తికి మీరు ఇమెయిల్ చూడాలనుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలుసుకోవడానికి మాత్రమే మేము మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను అందించమని అడుగుతాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సంగ్రహించము.
మీరు సందర్శకులో ఉన్నారో లేదో పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నిరోధించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
మారిసా కె. కిల్‌గౌర్ (మారిసా కె. కిల్‌గౌర్), సారా మాక్‌ఫెర్సన్ (సారా మాక్‌ఫెర్సన్), లారెన్ జి. జకారియాస్ (లారెన్ జి. జకారియాస్), అబిగైల్ ఎలి అరిస్ జి. వాట్సన్ (హెచ్. వాట్సన్), జాన్ స్టాగ్ (జాన్ స్టాగ్), బ్రాడ్ హెచ్. నెల్సన్ (జెల్బ్రాడ్ నేల్సన్), ఆర్. (రాల్ఫ్ జె. డిబెరార్డినిస్), రస్సెల్ జి. జోన్స్ (రస్సెల్ జి. జోన్స్), ఫినియాస్ టి. హామిల్టన్ (ఫినియాస్ టి.
MNA T కణాల రోగనిరోధక అణచివేతకు దోహదం చేస్తుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు సంభావ్య రోగనిరోధక చికిత్స లక్ష్యాన్ని సూచిస్తుంది.
మారిసా కె. కిల్‌గౌర్ (మారిసా కె. కిల్‌గౌర్), సారా మాక్‌ఫెర్సన్ (సారా మాక్‌ఫెర్సన్), లారెన్ జి. జకారియాస్ (లారెన్ జి. జకారియాస్), అబిగైల్ ఎలి అరిస్ జి. వాట్సన్ (హెచ్. వాట్సన్), జాన్ స్టాగ్ (జాన్ స్టాగ్), బ్రాడ్ హెచ్. నెల్సన్ (జెల్బ్రాడ్ నేల్సన్), ఆర్. (రాల్ఫ్ జె. డిబెరార్డినిస్), రస్సెల్ జి. జోన్స్ (రస్సెల్ జి. జోన్స్), ఫినియాస్ టి. హామిల్టన్ (ఫినియాస్ టి.
MNA T కణాల రోగనిరోధక అణచివేతకు దోహదం చేస్తుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు సంభావ్య రోగనిరోధక చికిత్స లక్ష్యాన్ని సూచిస్తుంది.
©2021 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.