ఇమ్యునోమాడ్యులేటరీ మెటబొలైట్స్ అనేవి ట్యూమర్ మైక్రోఎన్విరాన్‌మెంట్ (TME) యొక్క ముఖ్య లక్షణం, కానీ కొన్ని మినహాయింపులు తప్ప, వాటి గుర్తింపు చాలా వరకు తెలియదు. ఇక్కడ, మేము హై-గ్రేడ్ సెరస్ కార్సినోమా (HGSC) ఉన్న రోగుల కణితులు మరియు ఆసైటిస్ నుండి కణితులు మరియు T కణాలను విశ్లేషించి, ఈ విభిన్న TME విభాగాల మెటబొలోమ్‌ను వెల్లడించాము. ఆసైటిస్ మరియు కణితి కణాలలో విస్తృతమైన మెటబొలైట్ వ్యత్యాసాలు ఉన్నాయి. ఆసైటిస్‌తో పోలిస్తే, కణితిలోకి చొచ్చుకుపోయిన T కణాలలో 1-మిథైల్‌నికోటినమైడ్ (MNA) గణనీయంగా అధికంగా ఉంది. T కణాలలో MNA స్థాయి పెరిగినప్పటికీ, నికోటినమైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫెరేస్ (S-అడెనోసిల్‌మిథియోనిన్ నుండి నికోటినమైడ్‌కు మిథైల్ సమూహాల బదిలీని ఉత్ప్రేరకపరిచే ఒక ఎంజైమ్) యొక్క వ్యక్తీకరణ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు మరియు కణితి కణాలకు మాత్రమే పరిమితమైంది. క్రియాత్మకంగా, MNA, కణితి పెరుగుదలను ప్రోత్సహించే సైటోకైన్ అయిన ట్యూమర్ నెక్రోసిస్ ఫ్యాక్టర్ ఆల్ఫాను స్రవించేలా T కణాలను ప్రేరేపిస్తుంది. అందువల్ల, TME నుండి లభించే MNA, T కణాల రోగనిరోధక నియంత్రణకు దోహదపడుతుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు ఒక సంభావ్య ఇమ్యునోథెరపీ లక్ష్యంగా నిలుస్తుంది.
కణితి-ఉత్పన్న జీవక్రియలు కణితి-వ్యతిరేక రోగనిరోధక శక్తిపై తీవ్రమైన నిరోధక ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటాయి మరియు అవి వ్యాధి పురోగతికి కీలక చోదక శక్తిగా కూడా పనిచేస్తాయని ఎక్కువ ఆధారాలు చూపిస్తున్నాయి (1). వార్‌బర్గ్ ప్రభావంతో పాటు, ఇటీవలి పరిశోధనలు కణితి కణాల జీవక్రియ స్థితిని మరియు కణితి సూక్ష్మ పర్యావరణం (TME) యొక్క రోగనిరోధక స్థితితో దాని సంబంధాన్ని వర్గీకరించడం ప్రారంభించాయి. ఎలుక నమూనాలు మరియు మానవ T కణాలపై చేసిన అధ్యయనాలు గ్లూటమైన్ జీవక్రియ (2), ఆక్సీకరణ జీవక్రియ (3) మరియు గ్లూకోజ్ జీవక్రియ (4) వివిధ రోగనిరోధక కణ ఉప సమూహాలపై స్వతంత్రంగా పనిచేయగలవని చూపించాయి. ఈ మార్గాలలో అనేక జీవక్రియలు T కణాల కణితి-వ్యతిరేక పనితీరును నిరోధిస్తాయి. కోఎంజైమ్ టెట్రాహైడ్రోబయోప్టెరిన్ (BH4) యొక్క నిరోధం T కణాల విస్తరణను దెబ్బతీస్తుందని మరియు శరీరంలో BH4 పెరుగుదల CD4 మరియు CD8 ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించే కణితి-వ్యతిరేక రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను పెంచుతుందని నిరూపించబడింది. అదనంగా, కైనూరెనిన్ యొక్క రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేసే ప్రభావాన్ని BH4 ఇవ్వడం ద్వారా రక్షించవచ్చు (5). ఐసోసిట్రేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (IDH) మ్యూటెంట్ గ్లియోబ్లాస్టోమాలో, ఎనాంటియోమెటాబోలిక్ (R)-2-హైడ్రాక్సీగ్లుటారేట్ (R-2-HG) స్రావం T కణాల క్రియాశీలత, విస్తరణ మరియు సైటోలైసిస్ కార్యకలాపాలను నిరోధిస్తుంది (6). ఇటీవల, గ్లైకోలైసిస్ యొక్క ఉప-ఉత్పత్తి అయిన మిథైల్‌గ్లైయాక్సాల్, మైలాయిడ్ మూలం యొక్క సప్రెసర్ కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడుతుందని మరియు మిథైల్‌గ్లైయాక్సాల్ యొక్క T కణ బదిలీ ఎఫెక్టర్ T కణాల పనితీరును నిరోధించగలదని చూపబడింది. చికిత్సలో, మిథైల్‌గ్లైయాక్సాల్ యొక్క తటస్థీకరణ మైలాయిడ్-ఉత్పన్న సప్రెసర్ కణాల (MDSC) కార్యకలాపాలను అధిగమించగలదు మరియు మౌస్ నమూనాలలో చెక్‌పాయింట్ బ్లాకేడ్ థెరపీని సినర్జిస్టిక్‌గా మెరుగుపరుస్తుంది (7). ఈ అధ్యయనాలు సమిష్టిగా T కణాల పనితీరు మరియు కార్యకలాపాలను నియంత్రించడంలో TME-ఉత్పన్న మెటాబోలైట్‌ల కీలక పాత్రను నొక్కి చెబుతున్నాయి.
అండాశయ క్యాన్సర్‌లో T కణాల పనితీరు లోపం గురించి విస్తృతంగా నివేదించబడింది (8). ఇది పాక్షికంగా హైపోక్సియా మరియు అసాధారణ కణితి వాస్కులేచర్‌లో అంతర్లీనంగా ఉండే జీవక్రియ లక్షణాల వల్ల జరుగుతుంది (9), దీని ఫలితంగా గ్లూకోజ్ మరియు ట్రిప్టోఫాన్ లాక్టిక్ ఆమ్లం మరియు కైనూరెనిన్ వంటి ఉప-ఉత్పత్తులుగా మార్చబడతాయి. అధిక ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ లాక్టేట్ ఇంటర్‌ఫెరాన్-γ (IFN-γ) ఉత్పత్తిని తగ్గిస్తుంది మరియు మైలోసప్రెసివ్ ఉప సమూహాల భేదాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది (10, 11). ట్రిప్టోఫాన్ వినియోగం నేరుగా T కణాల విస్తరణను నిరోధిస్తుంది మరియు T కణ గ్రాహక సిగ్నలింగ్‌ను నిరోధిస్తుంది (12-14). ఈ పరిశీలనలు ఉన్నప్పటికీ, రోగనిరోధక జీవక్రియకు సంబంధించిన చాలా పరిశోధనలు ఆప్టిమైజ్ చేసిన మీడియాను ఉపయోగించి ఇన్ విట్రో T కణ కల్చర్‌లో నిర్వహించబడ్డాయి, లేదా ఇన్ వివోలో హోమోలోగస్ మౌస్ నమూనాలకు పరిమితం చేయబడ్డాయి, ఈ రెండూ మానవ క్యాన్సర్‌ల వైవిధ్యతను మరియు శారీరక స్థూల మరియు సూక్ష్మ వాతావరణాన్ని పూర్తిగా ప్రతిబింబించవు.
అండాశయ క్యాన్సర్ యొక్క ఒక సాధారణ లక్షణం పెరిటోనియల్ వ్యాప్తి మరియు అసైటిస్ కనిపించడం. అసైటిస్‌లో కణ ద్రవం పేరుకుపోవడం అనేది వ్యాధి ముదిరిన దశకు మరియు పేలవమైన రోగ నిరూపణకు సంబంధించినది (15). నివేదికల ప్రకారం, ఈ ప్రత్యేక భాగం హైపాక్సిక్‌గా ఉంటుంది, వాస్కులర్ ఎండోథెలియల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (VEGF) మరియు ఇండోలమైన్ 2,3-డైఆక్సిజనేస్ (IDO) అధిక స్థాయిలో ఉంటాయి, మరియు T రెగ్యులేటరీ కణాలు మరియు మైలాయిడ్ ఇన్హిబిటరీ కణాలచే చొచ్చుకుపోబడుతుంది (15-18). అసైటిస్ యొక్క జీవక్రియ వాతావరణం కణితి యొక్క జీవక్రియ వాతావరణానికి భిన్నంగా ఉండవచ్చు, కాబట్టి పెరిటోనియల్ ప్రదేశంలో T కణాల రీప్రోగ్రామింగ్ అస్పష్టంగా ఉంది. అదనంగా, అసైటిస్ మరియు కణితి వాతావరణంలో ఉండే జీవక్రియల మధ్య ఉన్న కీలకమైన తేడాలు మరియు వైవిధ్యం రోగనిరోధక కణాల చొచ్చుకుపోవడాన్ని మరియు కణితులపై వాటి పనితీరును అడ్డుకోవచ్చు, మరియు దీనిపై మరింత పరిశోధన అవసరం.
ఈ సమస్యలను పరిష్కరించడానికి, మేము వివిధ రకాల కణాలను (CD4+ మరియు CD8+ T కణాలతో సహా) అలాగే కణితుల లోపల మరియు వాటి మధ్య అధ్యయనం చేయడానికి ఒక సున్నితమైన కణ విభజన మరియు లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ టాండెమ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS/MS) పద్ధతిని రూపొందించాము. దీని జీవక్రియ ఉత్పన్నాలు రోగి యొక్క అదే ఉదరంలో నీరు (అసైటిస్) మరియు కణితి వాతావరణంలోని కణాల అంతటా విస్తరించి ఉంటాయి. ఈ కీలక కణ సమూహాల జీవక్రియ స్థితి యొక్క అత్యంత స్పష్టమైన చిత్రాన్ని అందించడానికి, మేము ఈ పద్ధతిని హై-డైమెన్షనల్ ఫ్లో సైటోమెట్రీ మరియు సింగిల్-సెల్ RNA సీక్వెన్సింగ్ (scRNA-seq)తో కలిపి ఉపయోగిస్తాము. ఈ పద్ధతి కణితి T కణాలలో 1-మిథైల్‌నికోటినమైడ్ (MNA) స్థాయిలో గణనీయమైన పెరుగుదలను వెల్లడించింది, మరియు ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలు T కణాల పనితీరుపై MNA యొక్క ఇమ్యునోమాడ్యులేటరీ ప్రభావం ఇంతకు ముందు తెలియనిదని చూపించాయి. సాధారణంగా, ఈ పద్ధతి కణితులు మరియు రోగనిరోధక కణాల మధ్య పరస్పర జీవక్రియ చర్యలను వెల్లడిస్తుంది, మరియు రోగనిరోధక నియంత్రణ జీవక్రియ ఉత్పన్నాలపై ప్రత్యేకమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది, ఇది T కణ-ఆధారిత అండాశయ క్యాన్సర్ ఇమ్యునోథెరపీ చికిత్సా అవకాశాలకు ఉపయోగకరంగా ఉండవచ్చు.
మేము గ్లూకోజ్ గ్రహణాన్ని [2-(N-(7-నైట్రోఫెనైల్-2-ఆక్సా-1,3-డయాజా-4-యల్)అమైనో)-2-డీఆక్సీగ్లూకోజ్ (2-NBDG)] మరియు మైటోకాండ్రియల్ కార్యాచరణను [మైటోట్రాకర్ డీప్ రెడ్ (MT DR)] (7, 19, 20) ఏకకాలంలో లెక్కించడానికి అధిక-పరిమాణ ఫ్లో సైటోమెట్రీని ఉపయోగించాము, ఇవి రోగనిరోధక కణాలు మరియు కణితి కణ సమూహాలను వేరుచేసే సాధారణ గుర్తులు (పట్టిక S2 మరియు చిత్రం S1A). ఈ విశ్లేషణలో T కణాలతో పోలిస్తే, ఆసైట్స్ మరియు కణితి కణాలు అధిక గ్లూకోజ్ గ్రహణ స్థాయిలను కలిగి ఉన్నాయని, కానీ మైటోకాండ్రియల్ కార్యాచరణలో చిన్న తేడాలు ఉన్నాయని తేలింది. కణితి కణాల [CD45-EpCAM (EpCAM)+] సగటు గ్లూకోజ్ గ్రహణం T కణాల కంటే మూడు నుండి నాలుగు రెట్లు ఎక్కువగా ఉంది, మరియు CD4 + T కణాల సగటు గ్లూకోజ్ గ్రహణం CD8 + T కణాల కంటే 1.2 రెట్లు ఎక్కువగా ఉంది, ఇది ఒకే TMEలో కూడా ట్యూమర్ ఇన్ఫిల్ట్రేటింగ్ లింఫోసైట్‌లకు (TIL) విభిన్న జీవక్రియ అవసరాలు ఉన్నాయని సూచిస్తుంది (చిత్రం 1A). దీనికి విరుద్ధంగా, కణితి కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలత CD4 + T కణాల మాదిరిగానే ఉంటుంది, మరియు ఈ రెండు రకాల కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలత CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది (పటం 1B). సాధారణంగా, ఈ ఫలితాలు జీవక్రియ స్థాయిని వెల్లడిస్తాయి. కణితి కణాల జీవక్రియ క్రియాశీలత CD4 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది, మరియు CD4 + T కణాల జీవక్రియ క్రియాశీలత CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది. వివిధ కణ రకాలలో ఈ ప్రభావాలు ఉన్నప్పటికీ, కణితిలతో పోలిస్తే ఆసైటిస్‌లో CD4 + మరియు CD8 + T కణాల జీవక్రియ స్థితిలో లేదా వాటి సాపేక్ష నిష్పత్తులలో స్థిరమైన వ్యత్యాసం లేదు (పటం 1C). దీనికి విరుద్ధంగా, CD45-కణ భాగంలో, ఆసైటిస్‌తో పోలిస్తే కణితిలో EpCAM+ కణాల నిష్పత్తి పెరిగింది (పటం 1D). మేము EpCAM+ మరియు EpCAM- కణ భాగాల మధ్య స్పష్టమైన జీవక్రియ వ్యత్యాసాన్ని కూడా గమనించాము. EpCAM+ (కణితి) కణాలు EpCAM- కణాల కంటే అధిక గ్లూకోజ్ గ్రహణాన్ని మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలతను కలిగి ఉంటాయి, ఇది TMEలోని కణితి కణాలలో ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌ల జీవక్రియ క్రియాశీలత కంటే చాలా ఎక్కువ (పటం 1, E మరియు F).
(A మరియు B) గ్లూకోజ్ గ్రహణం (2-NBDG) యొక్క మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత (MFI) (A) మరియు CD4 + T కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య (మైటోట్రాకర్ ముదురు ఎరుపు) (B) ప్రతినిధి గ్రాఫ్‌లు (ఎడమ) మరియు పట్టిక రూపంలో ఉన్న డేటా (కుడి), ఆసైటిస్ మరియు కణితి నుండి CD8 + T కణాలు మరియు EpCAM + CD45-కణితి కణాలు. (C) ఆసైటిస్ మరియు కణితిలో CD4 + మరియు CD8 + కణాల (CD3 + T కణాల) నిష్పత్తి. (D) ఆసైటిస్ మరియు కణితిలో EpCAM + కణితి కణాల నిష్పత్తి (CD45−). (E మరియు F) EpCAM + CD45-కణితి మరియు EpCAM-CD45-మాట్రిక్స్ గ్లూకోజ్ గ్రహణం (2-NBDG) (E) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ చర్య (మైటోట్రాకర్ ముదురు ఎరుపు) (F) ప్రతినిధి గ్రాఫ్‌లు (ఎడమ) మరియు పట్టిక రూపంలో ఉన్న డేటా (కుడి) ఆసైటిస్ మరియు కణితి కణాలు. (G) ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా CD25, CD137 మరియు PD1 వ్యక్తీకరణ యొక్క ప్రతినిధి గ్రాఫ్‌లు. (H మరియు I) CD4 + T కణాలపై (H) మరియు CD8 + T కణాలపై (I) CD25, CD137 మరియు PD1 వ్యక్తీకరణ. (J మరియు K) CCR7 మరియు CD45RO వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా నాణ్యమైన, సెంట్రల్ మెమరీ (Tcm), ఎఫెక్టర్ (Teff) మరియు ఎఫెక్టర్ మెమరీ (Tem) ఫినోటైప్‌లు. ఆసైటిస్ మరియు కణితులలోని CD4 + T కణాల (J) మరియు CD8 + T కణాల (K) యొక్క ప్రతినిధి చిత్రాలు (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి). జత చేసిన t-పరీక్ష ద్వారా నిర్ణయించబడిన P విలువలు (*P<0.05, **P<0.01 మరియు ***P<0.001). ఈ గీత సరిపోలిన రోగులను (n = 6) సూచిస్తుంది. FMO, ఫ్లోరోసెన్స్ మైనస్ వన్; MFI, మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత.
మరింత విశ్లేషణలో, అధికంగా పరిష్కరించబడిన T సెల్ ఫినోటైపిక్ స్థితి మధ్య ఇతర ముఖ్యమైన తేడాలు వెల్లడయ్యాయి. కణితులలో యాక్టివేట్ చేయబడిన (మూర్తి 1, G నుండి I) మరియు ఎఫెక్టర్ మెమరీ (మూర్తి 1, J మరియు K) కణాలు ఆసైటిస్ (CD3 + T కణాల నిష్పత్తి) కంటే చాలా ఎక్కువగా ఉన్నాయి. అదేవిధంగా, యాక్టివేషన్ మార్కర్లు (CD25 మరియు CD137) మరియు క్షీణత మార్కర్లు [ప్రోగ్రామ్డ్ సెల్ డెత్ ప్రోటీన్ 1 (PD1)] యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా ఫినోటైప్‌ను విశ్లేషించినప్పుడు, ఈ జనాభా యొక్క జీవక్రియ లక్షణాలు భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ (మూర్తి S1, B నుండి E), నాణ్యమైన, ఎఫెక్టర్ లేదా మెమరీ ఉపసమితుల మధ్య స్థిరంగా ఎటువంటి ముఖ్యమైన జీవక్రియ తేడాలు గమనించబడలేదు (మూర్తి S1, F నుండి I). సెల్ ఫినోటైప్‌లను స్వయంచాలకంగా కేటాయించడానికి మెషిన్ లెర్నింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించడం ద్వారా ఈ ఫలితాలు నిర్ధారించబడ్డాయి (21), ఇది రోగి యొక్క ఆసైటిస్‌లో పెద్ద సంఖ్యలో ఎముక మజ్జ కణాలు (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ఉన్నట్లు మరింతగా వెల్లడించింది (మూర్తి S2A). గుర్తించబడిన అన్ని కణ రకాలలో, ఈ మైలాయిడ్ కణ సమూహం అత్యధిక గ్లూకోజ్ గ్రహణాన్ని మరియు మైటోకాండ్రియల్ కార్యాచరణను చూపించింది (పటం S2, B నుండి G). ఈ ఫలితాలు HGSC రోగులలోని ఆస్కైట్స్ మరియు కణితులలో కనిపించే బహుళ కణ రకాల మధ్య ఉన్న బలమైన జీవక్రియ వ్యత్యాసాలను స్పష్టం చేస్తున్నాయి.
TIL యొక్క మెటాబోనామిక్ లక్షణాలను అర్థం చేసుకోవడంలో ప్రధాన సవాలు ఏమిటంటే, కణితుల నుండి తగినంత స్వచ్ఛత, నాణ్యత మరియు పరిమాణంలో T కణ నమూనాలను వేరుచేయవలసిన అవసరం. ఫ్లో సైటోమెట్రీ ఆధారిత సార్టింగ్ మరియు బీడ్ ఎన్రిచ్‌మెంట్ పద్ధతులు సెల్యులార్ మెటబోలైట్ ప్రొఫైల్‌లలో మార్పులకు దారితీయవచ్చని ఇటీవలి అధ్యయనాలు చూపించాయి (22-24). ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, LC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషణకు ముందు శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించబడిన మానవ అండాశయ క్యాన్సర్ నుండి TILను వేరుచేయడానికి మరియు వేరుచేయడానికి మేము బీడ్ ఎన్రిచ్‌మెంట్ పద్ధతిని ఆప్టిమైజ్ చేసాము (మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్ చూడండి; చిత్రం 2A). మెటబోలైట్ మార్పులపై ఈ ప్రోటోకాల్ యొక్క మొత్తం ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, పైన పేర్కొన్న బీడ్ సెపరేషన్ దశ తర్వాత ఆరోగ్యకరమైన దాతలచే ఉత్తేజితమైన T కణాల మెటబోలైట్ ప్రొఫైల్‌లను, బీడ్ సెపరేషన్ చేయకుండా ఐస్‌పై ఉంచిన కణాలతో పోల్చాము. ఈ నాణ్యత నియంత్రణ విశ్లేషణలో ఈ రెండు పరిస్థితుల మధ్య అధిక సహసంబంధం (r = 0.77) ఉందని మరియు 86 మెటబోలైట్‌ల సమూహం యొక్క సాంకేతిక పునరావృతత అధిక పునరావృతతను కలిగి ఉందని కనుగొనబడింది (చిత్రం 2B). అందువల్ల, ఈ పద్ధతులు కణ రకం సుసంపన్నతకు గురవుతున్న కణాలలో ఖచ్చితమైన మెటబొలైట్ విశ్లేషణను నిర్వహించగలవు, తద్వారా HGSCలో నిర్దిష్ట మెటబొలైట్‌లను గుర్తించడానికి మొట్టమొదటి అధిక-రిజల్యూషన్ వేదికను అందిస్తాయి, దీనివల్ల ప్రజలు కణ విశిష్టత లైంగిక జీవక్రియ కార్యక్రమంపై లోతైన అవగాహన పొందగలుగుతారు.
(A) మాగ్నెటిక్ బీడ్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. LC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషణకు ముందు, కణాలు వరుసగా మూడు రౌండ్ల మాగ్నెటిక్ బీడ్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్‌కు గురవుతాయి లేదా ఐస్‌పై ఉంచబడతాయి. (B) మెటబొలైట్‌ల సమృద్ధిపై ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ రకం యొక్క ప్రభావం. ప్రతి ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ రకానికి మూడు కొలతల సగటు ± SE. బూడిద రంగు గీత 1:1 సంబంధాన్ని సూచిస్తుంది. అక్షం లేబుల్‌లో పునరావృత కొలతల ఇంట్రా-క్లాస్ కోరిలేషన్ (ICC) చూపబడింది. NAD, నికోటినమైడ్ అడెనైన్ డైన్యూక్లియోటైడ్. (C) రోగి మెటబొలైట్ విశ్లేషణ యొక్క వర్క్‌ఫ్లో యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. రోగుల నుండి అస్సైట్స్ లేదా కణితులు సేకరించి క్రయోప్రిజర్వ్ చేయబడతాయి. ప్రతి నమూనాలోని ఒక చిన్న భాగాన్ని ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు, అయితే మిగిలిన నమూనాలు CD4+, CD8+ మరియు CD45- కణాల కోసం మూడు రౌండ్ల ఎన్‌రిచ్‌మెంట్‌కు గురయ్యాయి. ఈ కణ భాగాలను LC-MS/MS ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. (D) ప్రామాణికీకరించిన మెటబొలైట్ సమృద్ధి యొక్క హీట్ మ్యాప్. డెండ్రోగ్రామ్ నమూనాల మధ్య యూక్లిడియన్ దూరాల యొక్క వార్డ్ క్లస్టరింగ్‌ను సూచిస్తుంది. (E) నమూనా మెటబొలైట్ మ్యాప్ యొక్క ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (PCA), ప్రతి నమూనా యొక్క మూడు ప్రతిరూపాలను చూపుతుంది, ఒకే రోగి నుండి వచ్చిన నమూనాలు ఒక గీతతో అనుసంధానించబడ్డాయి. (F) రోగిపై ఆధారపడిన నమూనా యొక్క మెటబొలైట్ ప్రొఫైల్ యొక్క PCA (అంటే, పాక్షిక రిడండెన్సీని ఉపయోగించి); నమూనా రకం కాన్వెక్స్ హల్ ద్వారా పరిమితం చేయబడింది. PC1, ప్రధాన భాగం 1; PC2, ప్రధాన భాగం 2.
తరువాత, ఆరుగురు HGSC రోగుల ప్రాథమిక ఆస్కైట్స్ మరియు కణితులలోని CD4+, CD8+ మరియు CD45- కణ భాగాలలో 99 జీవక్రియలను విశ్లేషించడానికి మేము ఈ సుసంపన్నత పద్ధతిని వర్తింపజేసాము (పటం 2C, పటం S3A మరియు పట్టిక S3 మరియు S4). ఆసక్తి ఉన్న జనాభా, జీవకణాల యొక్క అసలు పెద్ద నమూనాలో 2% నుండి 70% వరకు ఉంటుంది, మరియు రోగుల మధ్య కణాల నిష్పత్తి చాలా తేడాగా ఉంటుంది. బీడ్స్‌ను వేరు చేసిన తర్వాత, సుసంపన్నమైన ఆసక్తి ఉన్న భాగం (CD4+, CD8+ లేదా CD45-) సగటున నమూనాలోని అన్ని జీవకణాలలో 85% కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది. ఈ సుసంపన్నత పద్ధతి మానవ కణితి కణజాల జీవక్రియ నుండి కణ జనాభాను విశ్లేషించడానికి మాకు వీలు కల్పిస్తుంది, ఇది పెద్ద నమూనాల నుండి చేయడం అసాధ్యం. ఈ ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి, బాగా వర్గీకరించబడిన ఈ రెండు రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేసే జీవక్రియలైన ఎల్-కైనూరెనిన్ మరియు అడెనోసిన్ కణితి టి కణాలు లేదా కణితి కణాలలో పెరిగాయని మేము నిర్ధారించాము (పటం S3, B మరియు C). అందువల్ల, రోగి కణజాలాలలో జీవశాస్త్రపరంగా ముఖ్యమైన జీవక్రియా ఉత్పత్తులను కనుగొనడంలో మా కణ విభజన మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ సాంకేతికత యొక్క విశ్వసనీయత మరియు సామర్థ్యాన్ని ఈ ఫలితాలు ప్రదర్శిస్తాయి.
మా విశ్లేషణలో రోగులలో మరియు రోగుల మధ్య కణ రకాలలో బలమైన జీవక్రియ విభజన ఉన్నట్లు కూడా వెల్లడైంది (పటం 2D మరియు పటం S4A). ముఖ్యంగా, ఇతర రోగులతో పోలిస్తే, రోగి 70 విభిన్న జీవక్రియ లక్షణాలను చూపించారు (పటం 2E మరియు పటం S4B), ఇది రోగుల మధ్య గణనీయమైన జీవక్రియ వైవిధ్యం ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది. గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, ఇతర రోగులతో (1.2 నుండి 2 లీటర్లు; పట్టిక S1) పోలిస్తే, రోగి 70లో సేకరించిన మొత్తం ఆసైటిస్ పరిమాణం (80 ml) తక్కువగా ఉంది. ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (principal component analysis) సమయంలో రోగుల మధ్య వైవిధ్యం యొక్క నియంత్రణ (ఉదాహరణకు, పాక్షిక రిడండెన్సీ విశ్లేషణను ఉపయోగించి) కణ రకాల మధ్య స్థిరమైన మార్పులను చూపుతుంది, మరియు కణ రకాలు మరియు/లేదా సూక్ష్మ పర్యావరణం జీవక్రియ ప్రొఫైల్ ప్రకారం స్పష్టంగా సమూహపరచబడ్డాయి (పటం 2F). ఏక జీవక్రియల విశ్లేషణ ఈ ప్రభావాలను నొక్కి చెప్పింది మరియు కణ రకాలు మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణం మధ్య గణనీయమైన తేడాలను వెల్లడించింది. గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, గమనించిన అత్యంత తీవ్రమైన వ్యత్యాసం MNA, ఇది సాధారణంగా CD45- కణాలలో మరియు కణితిలోకి చొచ్చుకుపోయే CD4+ మరియు CD8+ కణాలలో సమృద్ధిగా ఉంటుంది (పటం 3A). CD4+ కణాల విషయంలో, ఈ ప్రభావం చాలా స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది, మరియు CD8+ కణాలలోని MNA కూడా పరిసరాలచే బలంగా ప్రభావితమవుతున్నట్లు కనిపిస్తుంది. అయితే, ఇది అంత ముఖ్యం కాదు, ఎందుకంటే ఆరుగురు రోగులలో ముగ్గురిని మాత్రమే ట్యూమర్ CD8+ స్కోర్‌ల కోసం మూల్యాంకనం చేయగలిగాము. MNAతో పాటు, ఆసైటిస్ మరియు కణితులలోని వివిధ రకాల కణాలలో, TILలో సరిగా వర్గీకరించబడని ఇతర మెటబొలైట్‌లు కూడా విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్నాయి (మూర్తులు S3 మరియు S4). అందువల్ల, ఈ డేటా తదుపరి పరిశోధన కోసం ఆశాజనకమైన ఇమ్యునోమాడ్యులేటరీ మెటబొలైట్‌ల సమితిని వెల్లడిస్తుంది.
(A) ఆసైట్స్ మరియు కణితి నుండి CD4+, CD8+ మరియు CD45- కణాలలో MNA యొక్క సాధారణీకరించిన కంటెంట్. బాక్స్ ప్లాట్ మధ్యస్థాన్ని (లైన్), ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధిని (ఫ్రేమ్ హింజ్) మరియు ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధికి 1.5 రెట్ల వరకు డేటా పరిధిని (ఫ్రేమ్ విస్కర్) చూపుతుంది. పేషెంట్ మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించినట్లుగా, P విలువను (*P<0.05 మరియు **P<0.01) నిర్ణయించడానికి రోగి యొక్క లిమ్మా విలువను ఉపయోగించండి. (B) MNA జీవక్రియ యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (60). జీవక్రియ ఉత్పన్నాలు: S-అడెనోసిల్-1-మెథియోనిన్; SAH, S-అడెనోసిన్-1-హోమోసిస్టీన్; NA, నికోటినమైడ్; MNA, 1-మిథైల్‌నికోటినమైడ్; 2-PY, 1-మిథైల్-2-పైరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్; 4-PY, 1-మిథైల్-4-పైరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్; NR, నికోటినమైడ్ రైబోస్; NMN, నికోటినమైడ్ మోనోన్యూక్లియోటైడ్. ఎంజైములు (ఆకుపచ్చ): NNMT, నికోటినామైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫరేస్; SIRT, సిర్టూయిన్స్; NAMPT, నికోటినామైడ్ ఫాస్ఫోరైబోసిల్ ట్రాన్స్‌ఫరేస్; AOX1, ఆల్డిహైడ్ ఆక్సిడేస్ 1; NRK, నికోటినామైడ్ రైబోసైడ్ కైనేస్; NMNAT, నికోటినామైడ్ మోనో న్యూక్లియోటైడ్ అడెనైలేట్ ట్రాన్స్‌ఫరేస్; Pnp1, ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్. (C) ఆసైట్స్ (బూడిద రంగు) మరియు కణితి (ఎరుపు; n = 3 రోగులు) యొక్క scRNA-seq యొక్క t-SNE. (D) scRNA-seq ఉపయోగించి గుర్తించిన వివిధ కణ సమూహాలలో NNMT వ్యక్తీకరణ. (E) SK-OV-3, మానవ పిండ మూత్రపిండ (HEK) 293T, T కణాలు మరియు MNA-చికిత్స పొందిన T కణాలలో NNMT మరియు AOX1 వ్యక్తీకరణ. మడతపెట్టిన వ్యక్తీకరణ SK-OV-3కి సాపేక్షంగా చూపబడింది. SEMతో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 6 ఆరోగ్యవంతమైన దాతలు). 35 కంటే ఎక్కువ ఉన్న Ct విలువలు గుర్తించలేనివిగా (UD) పరిగణించబడతాయి. (F) SK-OV-3, HEK293T, T కణాలు మరియు 8mM MNAతో చికిత్స పొందిన T కణాలలో SLC22A1 మరియు SLC22A2 యొక్క వ్యక్తీకరణ. మడతపెట్టిన వ్యక్తీకరణ SK-OV-3కి సాపేక్షంగా చూపబడింది. SEMతో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 6 ఆరోగ్యవంతమైన దాతలు). 35 కంటే ఎక్కువ ఉన్న Ct విలువలు గుర్తించలేనివిగా (UD) పరిగణించబడతాయి. (G) MNAతో 72 గంటల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత ఉత్తేజిత ఆరోగ్యవంతమైన దాత T కణాలలో కణ MNA కంటెంట్. SEMతో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 4 ఆరోగ్యవంతమైన దాతలు).
నికోటినామైడ్ N-మిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫెరేస్ (NNMT; పటం 3B) ద్వారా S-అడెనోసిల్-1-మిథియోనిన్ (SAM) నుండి మిథైల్ సమూహాన్ని నికోటినామైడ్ (NA)కు బదిలీ చేయడం ద్వారా MNA ఉత్పత్తి అవుతుంది. NNMT వివిధ రకాల మానవ క్యాన్సర్లలో అధికంగా వ్యక్తమవుతుంది మరియు ఇది కణాల వృద్ధి, వ్యాప్తి మరియు మెటాస్టాసిస్‌తో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది (25-27). TMEలోని T కణాలలో MNA యొక్క మూలాన్ని మరింత బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము ముగ్గురు HGSC రోగుల ఆసైటిస్ మరియు కణితులలోని వివిధ కణ రకాలలో NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణను వర్గీకరించడానికి scRNA-seqను ఉపయోగించాము (పట్టిక S5). సుమారు 6,500 కణాల విశ్లేషణలో, ఆసైటిస్ మరియు కణితి వాతావరణాలలో, NNMT వ్యక్తీకరణ ఊహించిన ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ మరియు కణితి కణ సమూహాలకు మాత్రమే పరిమితమైందని తేలింది (పటం 3, C మరియు D). PTPRC (CD45 +)ను వ్యక్తపరిచే ఏ సమూహంలోనూ స్పష్టమైన NNMT వ్యక్తీకరణ లేదని గమనించడం ముఖ్యం (పటం 3D మరియు పటం S5A), ఇది మెటబొలైట్ స్పెక్ట్రమ్‌లో గుర్తించబడిన MNA T కణాలలోకి ప్రవేశపెట్టబడిందని సూచిస్తుంది. ఆల్డిహైడ్ ఆక్సిడేస్ 1 (AOX1) యొక్క వ్యక్తీకరణ MNAను 1-మిథైల్-2-పైరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్ (2-PYR) లేదా 1-మిథైల్-4-పైరిడోన్-5-కార్బాక్సమైడ్ (4-PYR)గా మారుస్తుంది; చిత్రం 3B) ఇది COL1A1ను వ్యక్తీకరించే ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌ల జనాభాకు కూడా పరిమితం చేయబడింది (చిత్రం S5A), ఇవన్నీ కలిసి T కణాలకు సంప్రదాయ MNA జీవక్రియ సామర్థ్యం లేదని సూచిస్తున్నాయి. ఈ MNA-సంబంధిత జన్యువుల వ్యక్తీకరణ నమూనా HGSC రోగుల నుండి వచ్చిన ఆసైటిస్ నుండి రెండవ స్వతంత్ర కణ డేటా సెట్‌ను ఉపయోగించి ధృవీకరించబడింది (చిత్రం S5B; n = 6) (16). అదనంగా, MNAతో చికిత్స పొందిన ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాల పరిమాణాత్మక పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (qPCR) విశ్లేషణలో, నియంత్రణ SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణాలతో పోలిస్తే, NNMT లేదా AOX1 దాదాపుగా వ్యక్తీకరించబడలేదని తేలింది (చిత్రం 3E). ఈ ఊహించని ఫలితాలు TMEలోని ప్రక్కనే ఉన్న T కణాలలోకి ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు లేదా కణితుల నుండి MNA స్రవించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
కరిగే క్యారియర్ 22 (SLC22) కుటుంబం (SLC22A1, SLC22A2 మరియు SLC22A3) ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ఆర్గానిక్ కాటయాన్ ట్రాన్స్‌పోర్టర్స్ 1 నుండి 3 (OCT1, OCT2 మరియు OCT3) కుటుంబం అభ్యర్థులలో ఉన్నప్పటికీ, MNA యొక్క సంభావ్య ట్రాన్స్‌పోర్టర్లు ఇంకా నిర్వచించబడలేదు (28). ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాల నుండి mRNA యొక్క QPCR, SLC22A1 యొక్క తక్కువ వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను కానీ SLC22A2 యొక్క గుర్తించలేని స్థాయిలను చూపించింది, ఇది గతంలో సాహిత్యంలో నివేదించబడిందని నిర్ధారించింది (చిత్రం 3F) (29). దీనికి విరుద్ధంగా, SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణ శ్రేణి రెండు ట్రాన్స్‌పోర్టర్లను అధిక స్థాయిలో వ్యక్తీకరించింది (చిత్రం 3F).
బాహ్య MNAను శోషించుకునే సామర్థ్యం T కణాలకు ఉందో లేదో పరీక్షించడానికి, ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలను వివిధ గాఢతలలో MNA సమక్షంలో 72 గంటల పాటు కల్చర్ చేశారు. బాహ్య MNA లేనప్పుడు, కణాలలో MNA పరిమాణాన్ని గుర్తించలేము (పటం 3G). అయితే, బాహ్య MNAతో చికిత్స పొందిన ఉత్తేజిత T కణాలు, 6 mM MNA వరకు, కణాలలో MNA పరిమాణంలో మోతాదుపై ఆధారపడిన పెరుగుదలను చూపించాయి (పటం 3G). ఈ ఫలితం, ట్రాన్స్‌పోర్టర్ వ్యక్తీకరణ తక్కువ స్థాయిలో ఉన్నప్పటికీ మరియు కణాంతర్గత MNA జీవక్రియకు బాధ్యత వహించే ప్రధాన ఎంజైమ్ లేనప్పటికీ, TIL కణాలు ఇప్పటికీ MNAను గ్రహించగలవని సూచిస్తుంది.
రోగుల T కణాలలో జీవక్రియల వర్ణపటం మరియు ఇన్ విట్రో MNA శోషణ ప్రయోగాలు, క్యాన్సర్-సంబంధిత ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు (CAF) MNAను స్రవిస్తాయని మరియు కణితి కణాలు TIL యొక్క ఫినోటైప్ మరియు పనితీరును నియంత్రించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి. T కణాలపై MNA ప్రభావాన్ని నిర్ధారించడానికి, ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలను MNA సమక్షంలో లేదా దాని లేకపోవడంతో ఇన్ విట్రోలో ఉత్తేజపరిచారు, మరియు వాటి ప్రసరణ మరియు సైటోకైన్ ఉత్పత్తిని మూల్యాంకనం చేశారు. అత్యధిక మోతాదులో MNAను జోడించిన 7 రోజుల తర్వాత, జనాభా రెట్టింపు సంఖ్య మధ్యస్తంగా తగ్గింది, అయితే అన్ని మోతాదులలో చైతన్యం కొనసాగింది (పటం 4A). అదనంగా, బాహ్య MNA చికిత్స ట్యూమర్ నెక్రోసిస్ ఫ్యాక్టర్-α (TNFα)ను వ్యక్తపరిచే CD4 + మరియు CD8 + T కణాల నిష్పత్తిలో పెరుగుదలకు దారితీసింది (పటం 4B). దీనికి విరుద్ధంగా, CD4 + T కణాలలో IFN-γ యొక్క అంతర్గత కణ ఉత్పత్తి గణనీయంగా తగ్గింది, కానీ CD8 + T కణాలలో తగ్గలేదు, మరియు ఇంటర్లూకిన్ 2 (IL-2)లో గణనీయమైన మార్పు లేదు (పటం 4, C మరియు D). అందువల్ల, ఈ MNA-చికిత్స పొందిన T కణ సంస్కృతుల నుండి వచ్చిన సూపర్నాటెంట్ల ఎంజైమ్-లింక్డ్ ఇమ్యునోసార్బెంట్ అస్సే (ELISA)లో TNFαలో గణనీయమైన పెరుగుదల, IFN-γలో తగ్గుదల, మరియు IL-2లో ఎటువంటి మార్పు లేదని తేలింది (పటం 4, E నుండి G). IFN-γలో తగ్గుదల, T కణాల యొక్క కణితి-వ్యతిరేక చర్యను నిరోధించడంలో MNA పాత్ర పోషిస్తుందని సూచిస్తుంది. T కణ-మధ్యవర్తిత్వ సైటోటాక్సిసిటీపై MNA ప్రభావాన్ని అనుకరించడానికి, ఫోలేట్ రిసెప్టర్ αను లక్ష్యంగా చేసుకున్న కైమెరిక్ యాంటిజెన్ రిసెప్టర్ T (FRα-CAR-T) కణాలు మరియు గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) ద్వారా నియంత్రించబడే CAR-T (GFP) కణాలను ఆరోగ్యకరమైన దాత యొక్క పెరిఫెరల్ బ్లడ్ మోనోన్యూక్లియర్ కణాల (PBMC) నుండి ఉత్పత్తి చేశారు. CAR-T కణాలను MNA సమక్షంలో 24 గంటల పాటు కల్చర్ చేసి, ఆపై ఫోలేట్ రిసెప్టర్ αను వ్యక్తపరిచే మానవ SK-OV-3 అండాశయ కణితి కణాలతో 10:1 ఎఫెక్టర్ టు టార్గెట్ నిష్పత్తిలో కో-కల్చర్ చేశారు. MNA చికిత్స ఫలితంగా FRα-CAR-T కణాల సంహారక చర్యలో గణనీయమైన తగ్గుదల కనిపించింది, ఇది అడెనోసిన్‌తో చికిత్స పొందిన FRα-CAR-T కణాల మాదిరిగానే ఉంది (పటం 4H).
(A) 7వ రోజున కల్చర్ నుండి నేరుగా మొత్తం సజీవ కణాల సంఖ్య మరియు జనాభా రెట్టింపు (PD). బార్ గ్రాఫ్ ఆరుగురు ఆరోగ్యవంతమైన దాతల సగటు + SEM ను సూచిస్తుంది. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి వచ్చిన డేటాను సూచిస్తుంది. (B నుండి D వరకు) T కణాలను వాటి సంబంధిత MNA గాఢతలలో 7 రోజుల పాటు ఉత్తేజపరిచేందుకు CD3/CD28 మరియు IL-2 ఉపయోగించబడ్డాయి. విశ్లేషణకు ముందు, కణాలను గోల్జీస్టాప్‌తో PMA/అయోనోమైసిన్‌తో 4 గంటల పాటు ప్రేరేపించారు. T కణాలలో TNFα (B) వ్యక్తీకరణ. సజీవ కణాలలో TNFα వ్యక్తీకరణ యొక్క ఉదాహరణ చిత్రం (ఎడమ) మరియు పట్టిక డేటా (కుడి). T కణాలలో IFN-γ (C) మరియు IL-2 (D) వ్యక్తీకరణ. సైటోకైన్‌ల వ్యక్తీకరణను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా కొలవబడింది. బార్ గ్రాఫ్ సగటు (n = 6 ఆరోగ్యవంతమైన దాతలు) + SEM ను సూచిస్తుంది. P విలువను నిర్ధారించడానికి వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ మరియు రిపీటెడ్ మెజర్స్ (*P<0.05 మరియు **P<0.01) ఉపయోగించండి. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి వచ్చిన డేటాను సూచిస్తుంది. (E నుండి G వరకు) T కణాలను వాటి సంబంధిత MNA గాఢతలలో 7 రోజుల పాటు ఉత్తేజపరిచేందుకు CD3/CD28 మరియు IL-2 లను ఉపయోగించారు. PMA/అయోనోమైసిన్ ఉత్తేజానికి ముందు మరియు 4 గంటల తర్వాత మాధ్యమాన్ని సేకరించారు. TNFα (E), IFN-γ (F) మరియు IL-2 (G) ల గాఢతలను ELISA ద్వారా కొలిచారు. బార్ గ్రాఫ్ సగటును (n = 5 ఆరోగ్యవంతమైన దాతలు) + SEM ను సూచిస్తుంది. వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ మరియు పునరావృత కొలతలను ఉపయోగించి P విలువను నిర్ధారించారు (*P<0.05). చుక్కల గీత డిటెక్షన్ యొక్క డిటెక్షన్ పరిమితిని సూచిస్తుంది. (H) కణ లైసిస్ పరీక్ష. FRα-CAR-T లేదా GFP-CAR-T కణాలను 24 గంటల పాటు అడెనోసిన్ (250μM) లేదా MNA (10 mM) తో సర్దుబాటు చేశారు, లేదా చికిత్స చేయకుండా వదిలేశారు (Ctrl). SK-OV-3 కణాల నాశన శాతాన్ని కొలిచారు. వెల్చ్ t పరీక్ష ద్వారా P విలువను నిర్ధారించారు (*P<0.5 మరియు **P<0.01).
MNA-ఆధారిత TNFα వ్యక్తీకరణ నియంత్రణ యొక్క యాంత్రిక అవగాహనను పొందడానికి, MNA-చికిత్స పొందిన T కణాల యొక్క TNFα mRNAలో మార్పులను అంచనా వేశారు (పటం 5A). MNAతో చికిత్స పొందిన ఆరోగ్యకరమైన దాత T కణాలు TNFα ట్రాన్స్క్రిప్షన్ స్థాయిలలో రెండు రెట్లు పెరుగుదలను చూపించాయి, ఇది MNA TNFα ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణపై ఆధారపడి ఉందని సూచిస్తుంది. ఈ సాధ్యమయ్యే నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని పరిశోధించడానికి, TNFαను నియంత్రించే రెండు తెలిసిన ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలు, అవి యాక్టివేటెడ్ T సెల్ న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ (NFAT) మరియు స్పెసిఫిక్ ప్రోటీన్ 1 (Sp1), ప్రాక్సిమల్ TNFα ప్రమోటర్‌కు MNA బైండింగ్‌కు ప్రతిస్పందనగా అంచనా వేయబడ్డాయి (30). TNFα ప్రమోటర్‌లో 6 గుర్తించబడిన NFAT బైండింగ్ సైట్‌లు మరియు 2 Sp1 బైండింగ్ సైట్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి ఒక సైట్‌లో అతివ్యాప్తి చెందుతాయి [5'క్యాప్ నుండి -55 బేస్ పెయిర్స్ (bp)] (30). క్రోమాటిన్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (ChIP) ప్రకారం, MNAతో చికిత్స చేసినప్పుడు, TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 బైండింగ్ మూడు రెట్లు పెరిగింది. NFAT చేరిక కూడా పెరిగింది మరియు ప్రాముఖ్యతను సంతరించుకుంది (పటం 5B). ఈ డేటా ప్రకారం, MNA అనేది Sp1 ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ద్వారా TNFα యొక్క వ్యక్తీకరణను, మరియు కొంతవరకు NFAT యొక్క వ్యక్తీకరణను నియంత్రిస్తుంది.
(A) MNA లేకుండా కల్చర్ చేయబడిన T కణాలతో పోలిస్తే, MNAతో చికిత్స పొందిన T కణాలలో TNFα వ్యక్తీకరణలో రెట్లు మార్పు. SEMతో వ్యక్తీకరణ నమూనా చూపబడింది (n = 5 ఆరోగ్యకరమైన దాతలు). కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి వచ్చిన డేటాను సూచిస్తుంది. (B) NFAT మరియు Sp1లను కలిపి (Ctrl) మరియు 4 గంటల పాటు PMA/అయోనోమైసిన్ స్టిమ్యులేషన్ తర్వాత 8 mM MNAతో లేదా లేకుండా చికిత్స పొందిన T కణాల యొక్క TNFα ప్రమోటర్. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ కోసం ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ G (IgG) మరియు H3లను వరుసగా నెగటివ్ మరియు పాజిటివ్ కంట్రోల్స్‌గా ఉపయోగించారు. ChIP యొక్క పరిమాణీకరణ ప్రకారం, కంట్రోల్‌తో పోలిస్తే MNA-చికిత్స పొందిన కణాలలో TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 మరియు NFATల బంధనం అనేక రెట్లు పెరిగినట్లు తేలింది. కనీసం n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి వచ్చిన డేటాను సూచిస్తుంది. మల్టిపుల్ t-టెస్ట్‌ల ద్వారా P విలువ నిర్ధారించబడింది (*** P <0.01). (C) HGSC యొక్క అస్సైటిస్‌తో పోలిస్తే, కణితిలో T కణాలు (నాన్-సైటోటాక్సిక్) TNF యొక్క పెరిగిన వ్యక్తీకరణను చూపించాయి. రంగులు వేర్వేరు రోగులను సూచిస్తాయి. ప్రదర్శించబడిన కణాలు యాదృచ్ఛికంగా 300 వరకు నమూనా చేయబడ్డాయి మరియు ఓవర్‌డ్రాయింగ్‌ను పరిమితం చేయడానికి జిట్టర్ చేయబడ్డాయి (** Padj = 0.0076). (D) అండాశయ క్యాన్సర్ కోసం MNA యొక్క ప్రతిపాదిత నమూనా. MNA అనేది TMEలోని కణితి కణాలు మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో ఉత్పత్తి అవుతుంది మరియు T కణాలచే గ్రహించబడుతుంది. MNA, TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 యొక్క బంధాన్ని పెంచుతుంది, ఇది TNFα ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు TNFα సైటోకైన్ ఉత్పత్తి పెరగడానికి దారితీస్తుంది. MNA, IFN-γలో తగ్గుదలకు కూడా కారణమవుతుంది. T కణాల పనితీరును నిరోధించడం వలన చంపే సామర్థ్యం తగ్గి, కణితి పెరుగుదల వేగవంతమవుతుంది.
నివేదికల ప్రకారం, TNFα ముందు మరియు వెనుక-ఆధారిత కణితి నిరోధక మరియు కణితి నిరోధక ప్రభావాలను కలిగి ఉంది, కానీ అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదల మరియు మెటాస్టాసిస్‌ను ప్రోత్సహించడంలో దీనికి ఒక ప్రసిద్ధ పాత్ర ఉంది (31-33). నివేదికల ప్రకారం, అండాశయ క్యాన్సర్ ఉన్న రోగులలో అసైటిస్ మరియు కణితి కణజాలాలలో TNFα సాంద్రత నిరపాయమైన కణజాలాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది (34-36). యంత్రాంగం పరంగా, TNFα తెల్ల రక్త కణాల క్రియాశీలత, పనితీరు మరియు విస్తరణను నియంత్రించగలదు మరియు క్యాన్సర్ కణాల ఫినోటైప్‌ను మార్చగలదు (37, 38). ఈ పరిశోధనలకు అనుగుణంగా, డిఫరెన్షియల్ జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణలో అసైటిస్‌తో పోలిస్తే కణితి కణజాలాలలోని T కణాలలో TNF గణనీయంగా అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడిందని తేలింది (చిత్రం 5C). TNF వ్యక్తీకరణలో పెరుగుదల నాన్-సైటోటాక్సిక్ ఫినోటైప్ ఉన్న T కణ సమూహాలలో మాత్రమే స్పష్టంగా కనిపించింది (చిత్రం S5A). సారాంశంలో, ఈ డేటా HGSCలో MNA ద్వంద్వ రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేసే మరియు కణితిని ప్రోత్సహించే ప్రభావాలను కలిగి ఉందనే అభిప్రాయానికి మద్దతు ఇస్తుంది.
ఫ్లో సైటోమెట్రీ ఆధారిత ఫ్లోరోసెంట్ లేబులింగ్, TIL జీవక్రియను అధ్యయనం చేయడానికి ప్రధాన పద్ధతిగా మారింది. ఈ అధ్యయనాలు పరిధీయ రక్త లింఫోసైట్లు లేదా ద్వితీయ శోషరస అవయవాల నుండి వచ్చే T కణాలతో పోలిస్తే, ఎలుక మరియు మానవ TIL లకు గ్లూకోజ్‌ను గ్రహించే ధోరణి ఎక్కువగా ఉందని (4, 39) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పనితీరు క్రమంగా క్షీణిస్తుందని (19, 40) చూపించాయి. ఈ అధ్యయనంలో మేము ఇలాంటి ఫలితాలనే గమనించినప్పటికీ, ఒకే శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించబడిన కణితి కణజాలం నుండి కణితి కణాలు మరియు TIL ల జీవక్రియను పోల్చడమే ఇక్కడ కీలకమైన అభివృద్ధి. ఈ మునుపటి నివేదికలలో కొన్నింటికి అనుగుణంగా, ఆసైట్స్ మరియు కణితుల నుండి వచ్చే కణితి (CD45-EpCAM +) కణాలు CD8 + మరియు CD4 + T కణాల కంటే ఎక్కువ గ్లూకోజ్‌ను గ్రహిస్తాయి, ఇది కణితి కణాల అధిక గ్లూకోజ్ గ్రహణాన్ని T కణాలతో పోల్చవచ్చనే విషయాన్ని బలపరుస్తుంది. T కణాల పోటీ అనే భావన. TME. అయితే, కణితి కణాల మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలత CD8 + T కణాల కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది, కానీ మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలత CD4 + T కణాల మాదిరిగానే ఉంటుంది. ఈ ఫలితాలు కణితి కణాలకు ఆక్సీకరణ జీవక్రియ ముఖ్యమైనది అనే కొత్త అంశాన్ని బలపరుస్తాయి (41, 42). CD8 + T కణాలు CD4 + T కణాల కంటే ఆక్సీకరణ పనిచేయకపోవడానికి ఎక్కువగా గురయ్యే అవకాశం ఉందని, లేదా CD4 + T కణాలు మైటోకాండ్రియల్ కార్యకలాపాలను నిర్వహించడానికి గ్లూకోజ్ కాకుండా ఇతర కార్బన్ వనరులను ఉపయోగించవచ్చని కూడా వారు సూచిస్తున్నారు (43, 44). అసైటిస్‌లో CD4 + T ఎఫెక్టార్స్, T ఎఫెక్టార్ మెమరీ మరియు T సెంట్రల్ మెమరీ కణాల మధ్య గ్లూకోజ్ గ్రహణంలో లేదా మైటోకాండ్రియల్ కార్యకలాపాలలో మేము ఎటువంటి తేడాను గమనించలేదని గమనించాలి. అదేవిధంగా, కణితులలో CD8 + T కణాల భేద స్థితికి గ్లూకోజ్ గ్రహణంలో మార్పులతో ఎటువంటి సంబంధం లేదు, ఇది ఇన్ విట్రోలో పెంచిన T కణాలు మరియు ఇన్ వివోలో మానవ TIL మధ్య గణనీయమైన వ్యత్యాసాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది (22). ఈ పరిశీలనలు నిష్పక్షపాత ఆటోమేటిక్ సెల్ పాపులేషన్ కేటాయింపును ఉపయోగించడం ద్వారా కూడా నిర్ధారించబడ్డాయి, ఇది కణితి కణాల కంటే అధిక గ్లూకోజ్ గ్రహణం మరియు మైటోకాండ్రియల్ కార్యకలాపాలు కలిగిన CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + కణాలు ప్రబలంగా ఉన్నాయని కానీ జీవక్రియ చురుకైన కణ జనాభాను కలిగి ఉన్నాయని మరింతగా వెల్లడించింది. ఈ జనాభా scRNA-seq విశ్లేషణలో గుర్తించబడిన మైలోయిడ్ సప్రెసర్ కణాలు లేదా ప్లాస్మాసైటాయిడ్ డెండ్రిటిక్ కణాల యొక్క ఊహాజనిత ఉపజనాభాను సూచిస్తుంది. ఈ రెండూ మానవ అండాశయ కణితులలో నివేదించబడినప్పటికీ [45], ఈ మైలోయిడ్ ఉపజనాభాను వివరించడానికి ఇంకా తదుపరి పని అవసరం.
ఫ్లో సైటోమెట్రీ-ఆధారిత పద్ధతులు కణ రకాల మధ్య గ్లూకోజ్ మరియు ఆక్సిడేటివ్ జీవక్రియలో సాధారణ వ్యత్యాసాలను స్పష్టం చేయగలిగినప్పటికీ, TMEలో మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియ కోసం గ్లూకోజ్ లేదా ఇతర కార్బన్ వనరుల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఖచ్చితమైన జీవక్రియ ఉత్పన్నాలు ఇంకా నిర్ధారించబడలేదు. ఇచ్చిన TIL ఉపసమితికి జీవక్రియ ఉత్పన్నాల ఉనికి లేదా లేకపోవడాన్ని కేటాయించడానికి, తొలగించబడిన కణజాలం నుండి కణ జనాభాను శుద్ధి చేయడం అవసరం. అందువల్ల, మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కలిపి మా కణ సుసంపన్నత పద్ధతి, సరిపోలే రోగి నమూనాలలో T కణాలు మరియు కణితి కణ జనాభాలలో విభిన్నంగా సుసంపన్నమైన జీవక్రియ ఉత్పన్నాలపై అంతర్దృష్టులను అందించగలదు. ఈ పద్ధతికి ఫ్లోరోసెన్స్-యాక్టివేటెడ్ సెల్ సార్టింగ్ కంటే ప్రయోజనాలు ఉన్నప్పటికీ, కొన్ని జీవక్రియ ఉత్పన్నాల లైబ్రరీలు అంతర్గత స్థిరత్వం మరియు/లేదా వేగవంతమైన టర్నోవర్ రేటు (22) కారణంగా ప్రభావితం కావచ్చు. అయినప్పటికీ, మా పద్ధతి రెండు గుర్తింపు పొందిన ఇమ్యునోసప్రెసివ్ జీవక్రియ ఉత్పన్నాలైన అడెనోసిన్ మరియు కైనూరెనిన్‌లను గుర్తించగలిగింది, ఎందుకంటే అవి నమూనా రకాల మధ్య చాలా తేడాగా ఉంటాయి.
కణితులు మరియు TIL ఉపరకాలపై మా మెటాబోనోమిక్ విశ్లేషణ అండాశయ TMEలో జీవక్రియల పాత్రపై మరిన్ని అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది. మొదట, ఫ్లో సైటోమెట్రీని ఉపయోగించి, కణితులు మరియు CD4 + T కణాల మధ్య మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలలో ఎటువంటి తేడా లేదని మేము నిర్ధారించాము. అయితే, LC-MS/MS విశ్లేషణ ఈ జనాభా మధ్య జీవక్రియల సమృద్ధిలో గణనీయమైన మార్పులను వెల్లడించింది, ఇది TIL జీవక్రియ మరియు దాని మొత్తం జీవక్రియ కార్యకలాపాల గురించి నిర్ధారణలకు జాగ్రత్తగా వివరణ అవసరమని సూచిస్తుంది. రెండవది, MNA అనేది CD45-కణాలు మరియు అస్సైట్స్‌లోని T కణాల మధ్య అత్యధిక వ్యత్యాసం ఉన్న జీవక్రియ, కణితులలో కాదు. అందువల్ల, కంపార్ట్‌మెంటలైజేషన్ మరియు కణితి స్థానం TIL జీవక్రియపై విభిన్న ప్రభావాలను కలిగి ఉండవచ్చు, ఇది ఇచ్చిన సూక్ష్మ వాతావరణంలో సాధ్యమయ్యే భిన్నత్వాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది. మూడవది, MNA-ఉత్పత్తి చేసే ఎంజైమ్ NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణ ప్రధానంగా CAFకి పరిమితం చేయబడింది, ఇది తక్కువ స్థాయిలో కణితి కణాలు, కానీ కణితి-ఉత్పన్న T కణాలలో గుర్తించదగిన MNA స్థాయిలు గమనించబడ్డాయి. అండాశయ CAFలో NNMT యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణకు క్యాన్సర్‌ను ప్రోత్సహించే ప్రభావం ఉందని తెలిసింది, ఇది పాక్షికంగా CAF జీవక్రియ, కణితి దాడి మరియు మెటాస్టాసిస్ (27) ప్రోత్సాహం కారణంగా ఉంది. TIL యొక్క మొత్తం స్థాయి మితంగా ఉన్నప్పటికీ, CAFలో NNMT యొక్క వ్యక్తీకరణ క్యాన్సర్ జీనోమ్ అట్లాస్ (TCGA) మెసెన్కైమల్ ఉపరకంతో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, ఇది పేలవమైన రోగ నిరూపణతో ముడిపడి ఉంటుంది (27, 46, 47). చివరగా, MNA క్షీణతకు బాధ్యత వహించే AOX1 అనే ఎంజైమ్ యొక్క వ్యక్తీకరణ కూడా CAF జనాభాకు మాత్రమే పరిమితం చేయబడింది, ఇది T కణాలకు MNAను జీవక్రియ చేసే సామర్థ్యం లేదని సూచిస్తుంది. ఈ ఫలితాలు ఈ ఆలోచనకు మద్దతు ఇస్తున్నాయి, ఈ విషయాన్ని ధృవీకరించడానికి మరింత పని అవసరం అయినప్పటికీ, T కణాలలో అధిక స్థాయి MNA ఉండటం అనేది రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేసే CAF సూక్ష్మ వాతావరణం యొక్క ఉనికిని సూచిస్తుంది.
MNA ట్రాన్స్‌పోర్టర్ల తక్కువ వ్యక్తీకరణ స్థాయి మరియు MNA జీవక్రియలో పాల్గొనే కీలక ప్రోటీన్ల గుర్తించలేని స్థాయిలను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, T కణాలలో MNA ఉనికి అనూహ్యమైనది. రెండు స్వతంత్ర సమూహాల scRNA-seq విశ్లేషణ మరియు లక్షిత qPCR ద్వారా NNMT గానీ, AOX1 గానీ గుర్తించబడలేదు. ఈ ఫలితాలు MNA T కణాలచే సంశ్లేషణ చేయబడదని, కానీ చుట్టుపక్కల ఉన్న TME నుండి శోషించబడుతుందని సూచిస్తున్నాయి. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలు T కణాలు బాహ్య MNAను పోగుచేసుకోవడానికి మొగ్గు చూపుతాయని చూపిస్తున్నాయి.
మా ఇన్ విట్రో అధ్యయనాలు బాహ్య MNA, T కణాలలో TNFα యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుందని మరియు TNFα ప్రమోటర్‌కు Sp1 యొక్క బంధాన్ని పెంచుతుందని చూపించాయి. TNFαకు కణితి నిరోధక మరియు కణితి-వ్యతిరేక విధులు రెండూ ఉన్నప్పటికీ, అండాశయ క్యాన్సర్‌లో, TNFα అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదలను ప్రోత్సహించగలదు (31-33). అండాశయ కణితి కణ సంస్కృతిలో TNFα యొక్క తటస్థీకరణ లేదా మౌస్ నమూనాలలో TNFα సిగ్నల్ యొక్క తొలగింపు, TNFα-మధ్యవర్తిత్వ శోథ సైటోకైన్ ఉత్పత్తిని మెరుగుపరచగలదు మరియు కణితి పెరుగుదలను నిరోధించగలదు (32, 35). అందువల్ల, ఈ సందర్భంలో, TME-ఉత్పన్న MNA, ఆటోక్రైన్ లూప్ ద్వారా TNFα-ఆధారిత యంత్రాంగం ద్వారా శోథ-అనుకూల జీవక్రియగా పనిచేయగలదు, తద్వారా అండాశయ క్యాన్సర్ సంభవించడాన్ని మరియు వ్యాప్తిని ప్రోత్సహిస్తుంది (31). ఈ అవకాశం ఆధారంగా, అండాశయ క్యాన్సర్‌కు సంభావ్య చికిత్సా ఏజెంట్‌గా TNFα నిరోధాన్ని అధ్యయనం చేస్తున్నారు (37, 48, 49). అదనంగా, MNA అండాశయ కణితి కణాలకు CAR-T కణాల సైటోటాక్సిసిటీని బలహీనపరుస్తుంది, ఇది MNA-మధ్యవర్తిత్వ రోగనిరోధక అణచివేతకు మరింత సాక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది. సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు కణితులు మరియు CAF కణాలు MNAను కణబాహ్య TMEలోకి స్రవిస్తాయనే నమూనాను సూచిస్తున్నాయి. (i) TNF- ప్రేరిత అండాశయ క్యాన్సర్ పెరుగుదల ఉద్దీపన మరియు (ii) MNA- ప్రేరిత T కణ సైటోటాక్సిక్ క్రియాశీలత నిరోధం ద్వారా, ఇది కణితిపై ద్వంద్వ ప్రభావాన్ని కలిగి ఉండవచ్చు (పటం 5D).
ముగింపుగా, వేగవంతమైన కణ సుసంపన్నత, సింగిల్-సెల్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు మెటబాలిక్ ప్రొఫైలింగ్‌ల కలయికను ఉపయోగించడం ద్వారా, ఈ అధ్యయనం HGSC రోగులలోని కణితులు మరియు ఆస్కైట్స్ కణాల మధ్య ఉన్న భారీ ఇమ్యునోమెటబొలోమిక్ వ్యత్యాసాలను వెల్లడించింది. ఈ సమగ్ర విశ్లేషణ, T కణాల మధ్య గ్లూకోజ్ గ్రహణంలో మరియు మైటోకాండ్రియల్ కార్యకలాపాలలో వ్యత్యాసాలు ఉన్నాయని చూపించింది, మరియు MNAను ఒక నాన్-సెల్ అటానమస్ ఇమ్యూన్ రెగ్యులేటరీ మెటబొలైట్‌గా గుర్తించింది. మానవ క్యాన్సర్లలో TME, T కణాల జీవక్రియను ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందనే దానిపై ఈ డేటా ప్రభావం చూపుతుంది. T కణాలు మరియు క్యాన్సర్ కణాల మధ్య పోషకాల కోసం ప్రత్యక్ష పోటీ ఉన్నట్లు నివేదించబడినప్పటికీ, మెటబొలైట్‌లు పరోక్ష నియంత్రకాలుగా పనిచేసి కణితి పురోగతిని ప్రోత్సహించగలవు మరియు బహుశా అంతర్గత రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను అణచివేయగలవు. ఈ నియంత్రణ మెటబొలైట్‌ల క్రియాత్మక పాత్రపై మరింత వివరణ, కణితి-వ్యతిరేక రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను మెరుగుపరచడానికి ప్రత్యామ్నాయ వ్యూహాలను అందించవచ్చు.
కెనడియన్ టిష్యూ రిపోజిటరీ నెట్‌వర్క్ ద్వారా ధృవీకరించబడిన BC క్యాన్సర్ ట్యూమర్ టిష్యూ రిపోజిటరీ నుండి రోగి నమూనాలు మరియు క్లినికల్ డేటా పొందబడ్డాయి. BC క్యాన్సర్ రీసెర్చ్ ఎథిక్స్ కమిటీ మరియు యూనివర్సిటీ ఆఫ్ బ్రిటిష్ కొలంబియా (H07-00463) ఆమోదించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, రోగులందరి నమూనాలు మరియు క్లినికల్ డేటా కోసం సమాచారంతో కూడిన వ్రాతపూర్వక సమ్మతిని పొందారు లేదా వారి సమ్మతిని అధికారికంగా వదులుకున్నారు. ఈ నమూనాలు ధృవీకరించబడిన బయోబ్యాంక్ (BRC-00290)లో నిల్వ చేయబడ్డాయి. రోగి యొక్క వివరణాత్మక లక్షణాలు పట్టికలు S1 మరియు S5లో చూపబడ్డాయి. క్రయోప్రిజర్వేషన్ కోసం, రోగి యొక్క ట్యూమర్ నమూనాను యాంత్రికంగా విచ్ఛిన్నం చేయడానికి స్కాల్పెల్‌ను ఉపయోగించి, ఆపై దానిని 100-మైక్రాన్ ఫిల్టర్ గుండా నెట్టి సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌ను పొందారు. కణాలను పెల్లెట్ చేయడానికి మరియు సూపర్‌నాటెంట్‌ను తొలగించడానికి రోగి యొక్క అస్సైటిస్‌ను 4°C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 1500 rpm వేగంతో సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. కణితి మరియు ఆస్కైట్స్ నుండి పొందిన కణాలను 50% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ హ్యూమన్ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్), 40% RPMI-1640 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 10% డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్‌లో క్రయోప్రిజర్వ్ చేశారు. ఈ విధంగా భద్రపరిచిన సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌లను కరిగించి, క్రింద వివరించిన మెటాబోలోమిక్స్ మరియు మెటాబోలైట్ నిర్ధారణ కోసం ఉపయోగించారు.
పూర్తి మాధ్యమం 0.22 μm ఫిల్టర్ చేయబడిన 50:50 సప్లిమెంటెడ్ RPMI 1640: AimVని కలిగి ఉంటుంది. RPMI 1640 + 2.05 mM l-గ్లూటమైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)కు 10% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ హ్యూమన్ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్), 12.5 mM హెపెస్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్), 2 mM l-గ్లూటమైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్), 1 x పెన్సిలిన్ స్ట్రెప్టోమైసిన్ (పెన్‌స్ట్రెప్) ద్రావణం (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 50 μMB-మెర్కాప్టోఇథనాల్‌లను సప్లిమెంట్ చేశారు. AimV (ఇన్విట్రోజెన్)కు 20 mM హెపెస్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 2 mM l-గ్లూటమైన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)లను సప్లిమెంట్ చేశారు. ఫ్లో సైటోమీటర్ స్టెయినింగ్ బఫర్‌లో 0.22 μm ఫిల్టర్ చేసిన ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS; ఇన్విట్రోజెన్) మరియు దానికి అనుబంధంగా 3% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ AB హ్యూమన్ సీరం (సిగ్మా) ఉన్నాయి. సెల్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ బఫర్ 0.22 μm ఫిల్టర్ చేసిన PBSతో కూడి ఉంటుంది మరియు దానికి అనుబంధంగా 0.5% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ హ్యూమన్ AB సీరం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉంటుంది.
37°C పూర్తి మాధ్యమంలో, కణాలను 10 nM MT DR మరియు 100 μM 2-NBDG తో 30 నిమిషాల పాటు స్టెయిన్ చేశారు. తరువాత, కణాలను 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు వయబిలిటీ డై eF506 తో స్టెయిన్ చేశారు. కణాలను FC బ్లాక్ (eBioscience) మరియు బ్రిలియంట్ స్టెయిన్ బఫర్ (BD Biosciences) లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, ఫ్లో సైటోమీటర్ స్టెయినింగ్ బఫర్‌లో (తయారీదారు సూచనల ప్రకారం) పలుచగా చేసి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. కణాలను 4°C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు ఫ్లో సైటోమెట్రీ స్టెయినింగ్ బఫర్‌లో (పట్టిక S2) ఒక సెట్ యాంటీబాడీలతో స్టెయిన్ చేయండి. విశ్లేషణకు ముందు కణాలను ఫ్లో సైటోమెట్రీ స్టెయినింగ్ బఫర్ (సైటెక్ అరోరా; 3L-16V-14B-8R కాన్ఫిగరేషన్) లో తిరిగి సస్పెండ్ చేయండి. కణాల సంఖ్య డేటాను విశ్లేషించడానికి స్పెక్ట్రోఫ్లో మరియు ఫ్లోజో V10 లను, మరియు డేటాను రూపొందించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8 ను ఉపయోగించండి. 2-NBDG మరియు MT DR యొక్క మధ్యస్థ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత (MFI) లాగ్-సాధారణీకరించబడింది, ఆపై సరిపోలిన రోగులను పరిగణనలోకి తీసుకోవడానికి గణాంక విశ్లేషణ కోసం జత చేసిన t పరీక్షను ఉపయోగించారు. విశ్లేషణ నుండి 40 కంటే తక్కువ సంఘటనలు ఉన్న అన్ని జనాభాలను తొలగించండి; గణాంక విశ్లేషణ మరియు డేటా విజువలైజేషన్ చేయడానికి ముందు ఏదైనా ప్రతికూల విలువల కోసం MFI విలువను 1గా నమోదు చేయండి.
పైన పేర్కొన్న ప్రాసెస్ ప్యానెల్ యొక్క మాన్యువల్ గేటింగ్ వ్యూహానికి అనుబంధంగా, FlowJoలో చనిపోయిన కణాలను తొలగించిన తర్వాత కణాలను జనాభాకు స్వయంచాలకంగా కేటాయించడానికి మేము ఆకార పరిమితి వృక్షం (FAUST) (21) ద్వారా పూర్తి ఉల్లేఖనాన్ని ఉపయోగించాము. తప్పుగా కేటాయించబడినట్లు కనిపించే జనాభాలను (PD1+ మరియు PD1- కణితి కణాలను కలపడం) మరియు నిలుపుకున్న జనాభాలను విలీనం చేయడానికి మేము అవుట్‌పుట్‌ను మాన్యువల్‌గా నిర్వహిస్తాము. ప్రతి నమూనాలో సగటున 2% కంటే ఎక్కువ కణాలు ఉంటాయి, మొత్తం 11 జనాభాలు.
ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తుల (స్టెమ్‌సెల్ టెక్నాలజీస్) నుండి PBMCని వేరు చేయడానికి ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్‌ను ఉపయోగించారు. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, CD8 మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించి PBMC నుండి CD8 + T కణాలను వేరుచేసి, ట్రాన్స్‌యాక్ట్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించి 2 వారాల పాటు కంప్లీట్ మీడియంలో వృద్ధి చేశారు. ఆ కణాలను IL-7 (10 ng/ml; పెప్రోటెక్) కలిగిన కంప్లీట్ మీడియంలో 5 రోజుల పాటు నిలవ ఉంచి, ఆ తర్వాత ట్రాన్స్‌యాక్ట్‌తో తిరిగి ఉత్తేజపరిచారు. 7వ రోజున, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, వరుసగా మూడు దశలలో కణాలను సుసంపన్నం చేయడానికి హ్యూమన్ CD45 మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించారు. ఫ్లో సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ కోసం (పైన వివరించిన విధంగా) కణాలను అలిక్వోట్ చేశారు, మరియు LC-MS/MS విశ్లేషణ కోసం పది లక్షల కణాలను మూడుసార్లు అలిక్వోట్ చేశారు. నమూనాలను కింద వివరించిన విధంగా LC-MS/MS ద్వారా ప్రాసెస్ చేశారు. మేము 1,000 అయాన్ సంఖ్యతో లోపించిన మెటబొలైట్ విలువను అంచనా వేశాము. విశ్లేషణకు ముందు, ప్రతి నమూనా మొత్తం అయాన్ సంఖ్య (TIC) ద్వారా సాధారణీకరించబడి, లాగరిథమిక్‌గా మార్చబడి, MetaboAnalystRలో స్వయంచాలకంగా సాధారణీకరించబడుతుంది.
ప్రతి రోగి యొక్క సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌ను కరిగించి, 40 μm ఫిల్టర్ ద్వారా పూర్తి మీడియంలోకి (పైన వివరించిన విధంగా) ఫిల్టర్ చేశారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, CD8+, CD4+ మరియు CD45- కణాల కోసం నమూనాలను సుసంపన్నం చేయడానికి (ఐస్‌పై) మైక్రోబీడ్స్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించి మాగ్నెటిక్ బీడ్ సెపరేషన్ ద్వారా వరుసగా మూడు రౌండ్ల పాజిటివ్ సెలెక్షన్‌ను ఉపయోగించారు. క్లుప్తంగా, కణాలను సెల్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ బఫర్‌లో (పైన వివరించిన విధంగా) తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, లెక్కించారు. కణాలను హ్యూమన్ CD8 బీడ్స్, హ్యూమన్ CD4 బీడ్స్ లేదా హ్యూమన్ CD45 బీడ్స్ (మిల్టెనీ)తో 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై సెల్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ బఫర్‌తో కడిగారు. నమూనాను LS కాలమ్ (మిల్టెనీ) గుండా పంపించి, పాజిటివ్ మరియు నెగటివ్ ఫ్రాక్షన్‌లను సేకరించారు. సమయాన్ని తగ్గించడానికి మరియు కణాల రికవరీ దశను గరిష్ఠంగా పెంచడానికి, CD8-ఫ్రాక్షన్‌ను రెండవ రౌండ్ CD4+ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కోసం మరియు CD4-ఫ్రాక్షన్‌ను తదుపరి CD45-ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కోసం ఉపయోగించారు. వేరుచేసే ప్రక్రియ అంతటా ద్రావణాన్ని మంచు మీద ఉంచండి.
మెటబొలైట్ విశ్లేషణ కోసం నమూనాలను సిద్ధం చేయడానికి, కణాలను అతి శీతల ఉప్పు ద్రావణంతో ఒకసారి కడిగి, ప్రతి నమూనాకు 1 మి.లీ 80% మెథనాల్‌ను జోడించి, ఆపై వోర్టెక్స్ చేసి, ద్రవ నైట్రోజన్‌లో తక్షణమే గడ్డకట్టించారు. నమూనాలను మూడు ఫ్రీజ్-థా సైకిళ్లకు గురిచేసి, 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 14,000 rpm వేగంతో సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. మెటబొలైట్‌లను కలిగి ఉన్న సూపర్నాటెంట్‌ను పొడిగా అయ్యే వరకు ఆవిరి చేశారు. మెటబొలైట్‌లను 50 μl 0.03% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌లో తిరిగి కరిగించి, కలపడానికి వోర్టెక్స్ చేసి, ఆపై వ్యర్థాలను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.
పైన వివరించిన విధంగా జీవక్రియలను సంగ్రహించండి. జీవక్రియల పరిశోధన కోసం సూపర్నాటెంట్‌ను హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ బాటిల్‌కు బదిలీ చేయండి. బ్యాచ్ ప్రభావాలను నివారించడానికి ప్రతి నమూనాను సమాన సంఖ్యలో కణాలతో చికిత్స చేయడానికి యాదృచ్ఛిక చికిత్స ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించండి. మేము AB SCIEX QTRAP 5500 ట్రిపుల్ క్వాడ్రుపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (50)లో గతంలో ప్రచురించిన గ్లోబల్ జీవక్రియల గుణాత్మక అంచనాను నిర్వహించాము. మల్టీక్వాంట్ వెర్షన్ 2.1 సాఫ్ట్‌వేర్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ SCIEX) ఉపయోగించి క్రోమాటోగ్రాఫిక్ విశ్లేషణ మరియు పీక్ ఏరియా ఇంటిగ్రేషన్ నిర్వహించబడ్డాయి.
తప్పిపోయిన మెటబొలైట్ విలువను అంచనా వేయడానికి 1000 అయాన్ గణనను ఉపయోగించారు, మరియు నమూనా ప్రాసెసింగ్ నుండి వాయిద్య విశ్లేషణ ద్వారా ప్రవేశపెట్టిన మార్పులను సరిచేయడానికి గుర్తించబడిన ప్రతి మెటబొలైట్ యొక్క సాధారణీకరించిన శిఖర ప్రాంతాన్ని లెక్కించడానికి ప్రతి నమూనా యొక్క TIC ఉపయోగించబడింది. TIC సాధారణీకరించబడిన తర్వాత, లాగరిథమిక్ మార్పిడి మరియు ఆటోమేటిక్ నార్మ్ లైన్ స్కేలింగ్ కోసం MetaboAnalystR(51) (డిఫాల్ట్ పరామితి) ఉపయోగించబడుతుంది. నమూనా రకాల మధ్య మెటబొలోమ్ వ్యత్యాసాల యొక్క అన్వేషణాత్మక విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మేము వేగన్ R ప్యాకేజీతో PCAని ఉపయోగించాము మరియు రోగులను విశ్లేషించడానికి పాక్షిక రిడండెన్సీ విశ్లేషణను ఉపయోగించాము. నమూనాల మధ్య యూక్లిడియన్ దూరాన్ని క్లస్టర్ చేయడానికి హీట్ మ్యాప్ డెండ్రోగ్రామ్‌ను నిర్మించడానికి వార్డ్ పద్ధతిని ఉపయోగించండి. మొత్తం కణ రకం మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణం అంతటా విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న మెటబొలైట్‌లను గుర్తించడానికి మేము ప్రామాణికీకరించిన మెటబొలైట్ సమృద్ధిపై లిమ్మా (52)ని ఉపయోగించాము. వివరణను సులభతరం చేయడానికి, మేము మోడల్‌ను పేర్కొనడానికి గ్రూప్ మీన్ పరామితిని ఉపయోగిస్తాము మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణంలోని కణ రకాలను ప్రతి సమూహంగా (n = 6 సమూహాలు) పరిగణిస్తాము; ప్రాముఖ్యత పరీక్ష కోసం, మేము ప్రతి మెటబొలైట్‌కు మూడు పునరావృత కొలతలను నిర్వహించాము. తప్పుడు ప్రతిరూపణను నివారించడానికి, లిమ్మా డిజైన్‌లో రోగిని ఒక అడ్డంకిగా చేర్చాము. వేర్వేరు రోగుల మధ్య మెటబొలైట్‌లలోని తేడాలను తనిఖీ చేయడానికి, మేము రోగులను ఒక స్థిరమైన పద్ధతిలో చేర్చి లిమ్మా మోడల్‌ను సర్దుబాటు చేసాము. కణ రకం మరియు సూక్ష్మ పర్యావరణం మధ్య ముందుగా నిర్దేశించిన కాంట్రాస్ట్ యొక్క ప్రాముఖ్యతను Padj <0.05 (బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సవరణ)గా మేము నివేదిస్తున్నాము.
మిల్టెనీ డెడ్ సెల్ రిమూవల్ కిట్ (>80% వయబిలిటీ) ఉపయోగించి జీవశక్తిని పెంచిన తర్వాత, 10x 5′జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి మొత్తం లైవ్ ఫ్రోజెన్ ఆసైటిస్ మరియు ట్యూమర్ నమూనాలపై సింగిల్-సెల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ సీక్వెన్సింగ్ నిర్వహించబడింది. సరిపోలిన కణితులు మరియు ఆసైటిస్ ఉన్న ఐదు కేసులను విశ్లేషించారు, అయితే ఒక ట్యూమర్ నమూనా యొక్క తక్కువ వయబిలిటీ కారణంగా దానిని చేర్చలేదు. రోగుల యొక్క బహుళ ఎంపికలను సాధించడానికి, మేము 10x క్రోమియం కంట్రోలర్ యొక్క లేన్‌లలో ప్రతి రోగి యొక్క నమూనాలను కలిపి, ఆసైటిస్ మరియు ట్యూమర్ ప్రదేశాలను విడివిడిగా విశ్లేషించాము. సీక్వెన్సింగ్ తర్వాత [ఇల్యూమినా హైసీక్ 4000 28×98 bp పెయిర్డ్ ఎండ్ (PE), క్యూబెక్ జీనోమ్; కణితి మరియు ఆస్కైట్స్ కోసం వరుసగా ప్రతి కణానికి సగటున 73,488 మరియు 41,378 రీడ్‌లు]], మేము CellSNP మరియు Vireo (53) లను ఉపయోగించాము (CellSNP ఆధారంగా GRCh38 అందించిన సాధారణ మానవ SNP (VCF)కి దాత గుర్తింపు కేటాయించబడింది. కేటాయించబడని కణాలు మరియు డ్యూప్లెక్స్‌లుగా గుర్తించబడిన కణాలను మరియు ఆస్కైట్స్ మరియు కణితి నమూనాల మధ్య సరిపోలే దాతలను మినహాయించి, రోగి యొక్క జన్యురూప స్థితి (IBS) యొక్క దగ్గరి గుర్తింపు (IBS)ని ఊహించడానికి మేము SNPRelateని ఉపయోగిస్తాము (54). ఈ పని ఆధారంగా, తదుపరి విశ్లేషణ కోసం కణితి మరియు ఆస్కైట్స్‌లో సమృద్ధిగా కణ ప్రాతినిధ్యం ఉన్న మూడు కేసులను మేము నిలుపుకున్నాము. scatter (55) మరియు scran (56) BioConductor ప్యాకేజింగ్‌లో మాస్ ఫిల్ట్రేషన్ దశను నిర్వహించిన తర్వాత, ఇది విశ్లేషణ కోసం 6975 కణాలను (వరుసగా కణితి మరియు ఆస్కైట్స్ నుండి 2792 మరియు 4183 కణాలు) అందించింది. జాకార్డ్ దూరం ఆధారంగా షేర్డ్ నియరెస్ట్ నైబర్ నెట్‌వర్క్ (SNN) యొక్క igraph (57) లూవైన్ క్లస్టరింగ్‌ను మేము ఉపయోగిస్తాము వ్యక్తీకరణ ద్వారా కణాలను క్లస్టర్ చేయండి. మార్కర్ జన్యు వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా క్లస్టర్‌లు ఊహాజనిత కణ రకాలుగా మాన్యువల్‌గా వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి మరియు t-SNEతో దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి. తక్కువ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ ఉన్న ఉప-క్లస్టర్‌లను మినహాయించి, CD8A మరియు GZMA వ్యక్తీకరణ ద్వారా సైటోటాక్సిక్ T కణాలు నిర్వచించబడ్డాయి. మేము ఇజార్ మరియు ఇతరుల (16) ప్రచురించిన డేటాను యాక్సెస్ చేసాము, వారి t-SNE ఎంబెడింగ్‌తో సహా, రోగనిరోధక కణ మార్కర్లు మరియు NNMT వ్యక్తీకరణ మధ్య వ్యక్తీకరణ అతివ్యాప్తిని నియంత్రించవచ్చు.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తుల (స్టెమ్‌సెల్ టెక్నాలజీస్) నుండి పిబిఎంసిలను వేరు చేశారు. సిడి3 బీడ్స్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించి పిబిఎంసిల నుండి సిడి3+ కణాలను వేరు చేశారు. ఎంఎన్ఏ సమక్షంలో లేదా దాని లేనప్పుడు, ప్లేట్-బౌండ్ సిడి3 (5μg/ml), కరిగే సిడి28 (3μg/ml) మరియు ఐఎల్-2 (300 U/ml; ప్రోల్యూకిన్) లతో సిడి3+ కణాలను ఉత్తేజపరిచారు. విస్తరణ యొక్క చివరి రోజున, ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా జీవశక్తి (ఫిక్సబుల్ వయబిలిటీ డై ఇఫ్లోర్450, ఇబయోసైన్స్) మరియు ప్రొలిఫరేషన్ (123కౌంట్ ఇబీడ్స్, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లను మూల్యాంకనం చేశారు. గోల్జీస్టాప్‌తో 4 గంటల పాటు PMA (20 ng/ml) మరియు అయోనోమైసిన్ (1μg/ml) తో కణాలను ఉత్తేజపరచడం ద్వారా ఎఫెక్టర్ ఫంక్షన్‌ను మూల్యాంకనం చేయండి మరియు CD8-PerCP (RPA-T8, బయోలెజెండ్), CD4-AF700 (RPA-T4, బయోలెజెండ్) మరియు TNFα-ఫ్లోరోసెయిన్ ఐసోథయోసయనేట్ (FITC) (MAb11, BD) లను పర్యవేక్షించండి. qPCR మరియు ChIP కణాలను PMA (20 ng/ml) మరియు అయోనోమైసిన్ (1μg/ml) తో 4 గంటల పాటు ఉత్తేజపరచండి. PMA (20 ng/ml) మరియు అయోనోమైసిన్ (1 μg/ml) తో 4 గంటల పాటు ఉత్తేజపరచడానికి ముందు మరియు తరువాత ELISA సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించారు.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ఉపయోగించి RNAను వేరు చేయడానికి తయారీదారు ప్రోటోకాల్‌ను అనుసరించండి. నమూనాను సజాతీయీకరించడానికి QIAshredder (QIAGEN) ఉపయోగించండి. కాంప్లిమెంటరీ DNA (cDNA)ను సంశ్లేషణ చేయడానికి అధిక-సామర్థ్యం గల RNA to cDNA కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించండి. కింది ప్రోబ్‌లతో (తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం) జన్యు వ్యక్తీకరణను పరిమాణీకరించడానికి TaqMan Rapid Advanced Master Mix (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించండి: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [గ్లిసరాల్డిహైడ్-3-ఫాస్ఫేట్ ఆఫ్ హైడ్రోజన్ (GAPDH)] మరియు Hs01010726_m1 (SLC22A2). నమూనాలను మైక్రోఆంప్ ఆప్టికల్ ఫిల్మ్‌తో కూడిన మైక్రోఆంప్ ఫాస్ట్ ఆప్టికల్ 96-వెల్ రియాక్షన్ ప్లేట్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్)లో స్టెప్ వన్‌ప్లస్ రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్) పై రన్ చేశారు. 35ను మించిన ఏదైనా Ct విలువ డిటెక్షన్ థ్రెషోల్డ్ కంటే ఎక్కువగా పరిగణించబడుతుంది మరియు గుర్తించలేనిదిగా గుర్తించబడుతుంది.
గతంలో వివరించిన విధంగా (58) ChIP ను నిర్వహించండి. క్లుప్తంగా, కణాలను ఫార్మాల్డిహైడ్ (తుది గాఢత 1.42%) తో ట్రీట్ చేసి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. సప్లిమెంటెడ్ స్వెల్లింగ్ బఫర్ (25 mM హెపెస్, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl మరియు 0.1% NP-40) ను ఐస్ మీద 10 నిమిషాలు ఉపయోగించండి, ఆపై వివరించిన విధంగా (58) ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ బఫర్‌లో తిరిగి సస్పెండ్ చేయండి. ఆ తర్వాత నమూనాను ఈ క్రింది సైకిల్స్‌తో సోనికేట్ చేశారు: 10 సైకిల్స్ (20 1-సెకన్ పల్స్‌లు) మరియు 40 సెకన్ల స్టాటిక్ సమయం. ChIP-గ్రేడ్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ G (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 1μl), హిస్టోన్ H3 (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 3μl), NFAT (ఇన్విట్రోజెన్; 3μl) మరియు SP1 (సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ; 3μl) యాంటీబాడీలను నమూనాతో 4°CC వద్ద రాత్రంతా షేక్ చేస్తూ ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రోటీన్ A బీడ్స్‌ను (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) నమూనాతో కలిపి 4°C వద్ద ఒక గంట పాటు నెమ్మదిగా కదిలిస్తూ ఇంక్యుబేట్ చేయండి, ఆ తర్వాత DNAను సుసంపన్నం చేయడానికి చెలెక్స్ బీడ్స్‌ను (బయో-రాడ్) మరియు ప్రోటీన్ డైజెషన్ కోసం ప్రోటీనేస్ K (థర్మో ఫిషర్) ను ఉపయోగించండి. TNFα ప్రమోటర్‌ను PCR ద్వారా గుర్తించారు: ఫార్వర్డ్, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; దీనికి విరుద్ధంగా, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ఉత్పత్తి). చిత్రాలను ఇమేజ్ ల్యాబ్ (బయో-రాడ్) ద్వారా రూపొందించి, ఇమేజ్‌జె సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి పరిమాణీకరించారు.
పైన వివరించిన విధంగా కణ కల్చర్ సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించారు. హ్యూమన్ TNFα ELISA కిట్ (ఇన్విట్రోజెన్), హ్యూమన్ IL-2 ELISA కిట్ (ఇన్విట్రోజెన్) మరియు హ్యూమన్ IFN-γ ELISA కిట్ (అబ్‌కామ్) తయారీదారుల విధానాల ప్రకారం నిర్ధారణను నిర్వహించారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, TNFα మరియు IL-2 లను గుర్తించడానికి సూపర్నాటెంట్‌ను 1:100 నిష్పత్తిలో, మరియు IFN-γ ను గుర్తించడానికి 1:3 నిష్పత్తిలో పలుచబరిచారు. 450 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను కొలవడానికి ఎన్‌విజన్ 2104 మల్టీలేబుల్ రీడర్ (పెర్కిన్‌ఎల్‌మర్)ను ఉపయోగించండి.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ల్యూకోసైట్ సెపరేషన్ ఉత్పత్తుల (స్టెమ్‌సెల్ టెక్నాలజీస్) నుండి పిబిఎంసిలను వేరు చేశారు. సిడి3 బీడ్స్ (మిల్టెనీ) ఉపయోగించి పిబిఎంసిల నుండి సిడి3+ కణాలను వేరు చేశారు. ఎంఎన్ఏ సమక్షంలో లేదా దాని లేనప్పుడు, సిడి3+ కణాలను ప్లేట్-బౌండ్ సిడి3 (5μg/ml), కరిగే సిడి28 (3μg/ml) మరియు ఐఎల్-2 (300 U/ml; ప్రోల్యూకిన్) తో 3 రోజుల పాటు ఉత్తేజపరిచారు. 3 రోజుల తర్వాత, కణాలను సేకరించి 0.9% సెలైన్‌తో కడిగారు, మరియు పెల్లెట్‌ను వెంటనే గడ్డకట్టించారు. 123కౌంట్ ఇ-బీడ్స్‌ను ఉపయోగించి ఫ్లో సైటోమెట్రీ (సైటెక్ అరోరా; 3L-16V-14B-8R కాన్ఫిగరేషన్) ద్వారా కణాల సంఖ్యను లెక్కించారు.
పైన వివరించిన విధంగా జీవక్రియలను సంగ్రహించండి. ఎండిన సారాన్ని 4000 సెల్ ఈక్వివలెంట్స్/μl గాఢత వద్ద పునఃసంయోజనం చేయబడింది. రివర్స్డ్-ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (1290 ఇన్ఫినిటీ II, అజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, శాంటా క్లారా, CA) మరియు CORTECS T3 కాలమ్ (2.1×150 mm, కణ పరిమాణం 1.6-μm, రంధ్ర పరిమాణం 120-Å; #186008500, వాటర్స్) ద్వారా నమూనాను విశ్లేషించండి. పోలార్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (6470, అజిలెంట్), దీనిలో ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణం పాజిటివ్ మోడ్‌లో పనిచేస్తుంది. మొబైల్ ఫేజ్ A అనేది 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం (H2Oలో), మొబైల్ ఫేజ్ B అనేది 90% ఎసిటోనైట్రైల్, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం. LC గ్రేడియంట్ 100% A కోసం 0 నుండి 2 నిమిషాలు, 99% B కోసం 2 నుండి 7.1 నిమిషాలు, మరియు 99% B కోసం 7.1 నుండి 8 నిమిషాలు ఉంటుంది. ఆ తర్వాత, మొబైల్ ఫేజ్ A తో కాలమ్‌ను 0.6 ml/min ప్రవాహ రేటుతో 3 నిమిషాల పాటు తిరిగి సమతుల్యం చేయండి. ప్రవాహ రేటు 0.4ml/min, మరియు కాలమ్ ఛాంబర్‌ను 50°C కి వేడి చేస్తారు. రిటెన్షన్ టైమ్ (RT) మరియు పరివర్తనను (RT = 0.882 నిమిషాలు, పరివర్తన 1 = 137→94.1, పరివర్తన 2 = 137→92, పరివర్తన 3 = 137→78) నిర్ధారించడానికి MNA యొక్క స్వచ్ఛమైన రసాయన ప్రమాణాన్ని (M320995, టొరంటో రీసెర్చ్ కెమికల్ కంపెనీ, నార్త్ యార్క్, ఒంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించండి. మూడు పరివర్తనలు సరైన రిటెన్షన్ టైమ్‌లో జరిగినప్పుడు, నిర్దిష్టతను నిర్ధారించడానికి పరిమాణీకరణ కోసం పరివర్తన 1 ఉపయోగించబడుతుంది. MNA (టొరంటో రీసెర్చ్ కెమికల్ కంపెనీ) యొక్క ప్రామాణిక వక్రరేఖను, స్టాక్ ద్రావణం (1 mg/ml) యొక్క ఆరు వరుస పలుచనల ద్వారా రూపొందించారు. దీని ద్వారా వరుసగా 0.1, 1.0, 10 మరియు 100 ng/ml మరియు 1.0 మరియు 10μg/ml ద్రవ ప్రమాణాలను పొందారు. గుర్తింపు పరిమితి 1 ng/ml, మరియు రేఖీయ ప్రతిస్పందన 10 ng/ml మరియు 10μg/ml మధ్య ఉంటుంది. LC/MS విశ్లేషణ కోసం, రెండు మైక్రోలీటర్ల నమూనా మరియు ప్రమాణాన్ని ప్రతి ఇంజెక్షన్‌కు ఉపయోగిస్తారు, మరియు విశ్లేషణ ప్లాట్‌ఫారమ్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి ప్రతి ఎనిమిది ఇంజెక్షన్‌లకు ఒక మిశ్రమ నాణ్యత నియంత్రణ నమూనాను పరీక్షిస్తారు. MNAతో చికిత్స పొందిన అన్ని కణ నమూనాల యొక్క MNA ప్రతిస్పందనలు అస్సే యొక్క రేఖీయ పరిధిలోనే ఉన్నాయి. డేటా విశ్లేషణను మాస్‌హంటర్ క్వాంటిటేటివ్ అనాలిసిస్ సాఫ్ట్‌వేర్ (v9.0, అజిలెంట్) ఉపయోగించి చేశారు.
రెండవ తరం αFR-CAR నిర్మాణం సాంగ్ మరియు ఇతరుల నుండి తీసుకోబడింది (59). క్లుప్తంగా, ఈ నిర్మాణంలో ఈ క్రింది అంశాలు ఉన్నాయి: CD8a లీడర్ సీక్వెన్స్, మానవ αFR-నిర్దిష్ట సింగిల్-చైన్ వేరియబుల్ ఫ్రాగ్మెంట్, CD8a హింజ్ మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రాంతం, CD27 ఇంట్రాసెల్యులార్ డొమైన్ మరియు CD3z ఇంట్రాసెల్యులార్ డొమైన్. పూర్తి CAR సీక్వెన్స్‌ను జెన్‌స్క్రిప్ట్ ద్వారా సంశ్లేషణ చేసి, ఆపై ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి ఉపయోగించే GFP ఎక్స్‌ప్రెషన్ క్యాసెట్‌కు ముందు రెండవ తరం లెంటివైరల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్‌లోకి క్లోన్ చేయబడింది.
HEK293T కణాల ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ ద్వారా లెంటివైరస్ ఉత్పత్తి చేయబడింది [అమెరికన్ టైప్ కల్చర్ కలెక్షన్ (ATCC)]; ఈ కణాలను 10% ఫీటల్ బోవైన్ సీరమ్ (FBS) మరియు 1% పెన్‌స్ట్రెప్ కలిగిన డల్బెక్కోస్ మాడిఫైడ్ ఈగిల్ మీడియంలో పెంచారు, మరియు CAR-GFP వెక్టర్‌ను ఉపయోగించారు. ప్యాకేజింగ్ ప్లాస్మిడ్‌లు (psPAX2 మరియు pMD2.G, యాడ్‌జీన్) లైపోఫెక్షన్ అమైన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)ను ఉపయోగిస్తాయి. ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ జరిగిన 48 మరియు 72 గంటల తర్వాత వైరస్ ఉన్న సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించి, ఫిల్టర్ చేసి, అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా గాఢతను పెంచారు. ట్రాన్స్‌డక్షన్ జరిగే వరకు గాఢత పెంచిన వైరల్ సూపర్నాటెంట్‌ను -80°C వద్ద నిల్వ చేయండి.
ఫికాల్ గ్రేడియంట్ డెన్సిటీ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ఆరోగ్యకరమైన దాత ల్యూకోసైట్ విభజన ఉత్పత్తుల (స్టెమ్‌సెల్ టెక్నాలజీస్) నుండి PBMCలను వేరు చేస్తారు. PBMCల నుండి CD8+ కణాలను వేరు చేయడానికి పాజిటివ్ సెలెక్షన్ CD8 మైక్రోబీడ్స్‌ను (మిల్టెనీ) ఉపయోగిస్తారు. T కణాలను ట్రాన్స్‌యాక్ట్ (మిల్టెనీ) మరియు టెక్స్‌మాక్స్ మీడియంలో [మిల్టెనీ; దీనికి 3% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ హ్యూమన్ సీరం, 1% పెన్‌స్ట్రెప్ మరియు IL-2 (300 U/ml) కలిపారు] ఉత్తేజపరుస్తారు. ఉత్తేజపరిచిన ఇరవై నాలుగు గంటల తర్వాత, T కణాలను లెంటివైరస్‌తో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేశారు (ప్రతి 106 కణాలకు 10 μl గాఢత కలిగిన వైరస్ సూపర్‌నాటెంట్). ట్రాన్స్‌డక్షన్ జరిగిన 1 నుండి 3 రోజుల తర్వాత సైటెక్ అరోరా (FSC (ఫార్వర్డ్ స్కాటర్)/SSC (సైడ్ స్కాటర్), సింగిల్ట్, GFP+) మీద, కనీసం 30% ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శించడానికి కణాల GFP వ్యక్తీకరణను మూల్యాంకనం చేస్తారు.
CAR-T కణాలను ఇమ్యునోకల్ట్ (స్టెమ్‌సెల్ టెక్నాలజీస్; 1% పెన్‌స్ట్రెప్‌తో అనుబంధంగా)లో 24 గంటల పాటు ఈ క్రింది పరిస్థితులలో కల్చర్ చేశారు: చికిత్స చేయనివి, 250 μM అడెనోసిన్ లేదా 10 mM MNAతో చికిత్స చేసినవి. ప్రీట్రీట్‌మెంట్ తర్వాత, CAR-T కణాలను PBSతో కడిగి, 20,000 SK-OV-3 కణాలతో [ATCC; మెక్‌కాయ్ 5A మీడియం (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)లో 10% FBS మరియు 1% పెన్‌స్ట్రెప్‌తో అనుబంధంగా 10: ఎఫెక్టర్ టు టార్గెట్ నిష్పత్తిని అనుబంధ ఇమ్యునోకల్ట్ మీడియంలో మూడుసార్లు విస్తరించారు. SK-OV-3 కణాలు మరియు డిజిటాలిస్ సాపోనిన్ (0.5mg/ml; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)తో లైజ్ చేయబడిన SK-OV-3 కణాలను వరుసగా నెగటివ్ మరియు పాజిటివ్ కంట్రోల్స్‌గా ఉపయోగించారు. 24 గంటల సహ-సాగు తర్వాత, సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించి, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం లాక్టేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (LDH) ను కొలిచారు (LDH గ్లో సైటోటాక్సిసిటీ అస్సే కిట్, ప్రోమెగా). LDH సూపర్నాటెంట్‌ను LDH బఫర్‌లో 1:50 నిష్పత్తిలో పలుచబరిచారు. కింది సూత్రాన్ని ఉపయోగించి కిల్లింగ్ శాతాన్ని కొలిచారు: కిల్లింగ్ శాతం = సవరణ శాతం / గరిష్ట కిల్లింగ్ రేటు x 100%, ఇక్కడ సవరణ శాతం = సహ-సాగు-T కణాలు మాత్రమే, మరియు గరిష్ట కిల్లింగ్ రేటు = పాజిటివ్ కంట్రోల్-నెగటివ్ కంట్రోల్.
టెక్స్ట్ లేదా మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించినట్లుగా, గణాంక విశ్లేషణ కోసం గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8, మైక్రోసాఫ్ట్ ఎక్సెల్ లేదా R v3.6.0ని ఉపయోగించండి. ఒకే రోగి నుండి బహుళ నమూనాలను (ఉదాహరణకు, అసైటిస్ మరియు ట్యూమర్) సేకరించినట్లయితే, మేము పెయిర్డ్ టి టెస్ట్‌ను ఉపయోగిస్తాము లేదా తగిన విధంగా లీనియర్ లేదా జనరలైజ్డ్ మోడల్‌లో రోగిని రాండమ్ ఎఫెక్ట్‌గా చేర్చుతాము. మెటాబోలోమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం, ఇంపార్టెన్స్ టెస్ట్‌ను మూడుసార్లు నిర్వహిస్తారు.
ఈ వ్యాసానికి సంబంధించిన అనుబంధ సమాచారం కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ని చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల క్రింద పంపిణీ చేయబడిన ఒక ఓపెన్ యాక్సెస్ వ్యాసం. ఈ లైసెన్స్ ప్రకారం, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు రచన సరైనదనే ప్రాతిపదిక ఉన్నంత వరకు, దీనిని ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగించడానికి, పంపిణీ చేయడానికి మరియు పునరుత్పత్తి చేయడానికి అనుమతి ఉంది. రిఫరెన్స్.
గమనిక: మీరు ఈ పేజీకి సిఫార్సు చేసే వ్యక్తికి, మీరు ఆ ఇమెయిల్‌ను వారు చూడాలని కోరుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలియజేయడం కోసమే మేము మిమ్మల్ని మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను ఇవ్వమని అడుగుతున్నాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సేకరించము.
మీరు సందర్శకులా కాదా అని పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నివారించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
మారిసా కె. కిల్‌గౌర్ (మారిసా కె. కిల్‌గౌర్), సారా మాక్‌ఫెర్సన్ (సారా మాక్‌ఫెర్సన్), లారెన్ జి. జకారియాస్ (లారెన్ జి. జకారియాస్), అబిగైల్ ఎలి అరిస్ జి. వాట్సన్ (హెచ్. వాట్సన్), జాన్ స్టాగ్ (జాన్ స్టాగ్), బ్రాడ్ హెచ్. నెల్సన్ (జెల్బ్రాడ్ నేల్సన్), ఆర్. (రాల్ఫ్ జె. డిబెరార్డినిస్), రస్సెల్ జి. జోన్స్ (రస్సెల్ జి. జోన్స్), ఫినియాస్ టి. హామిల్టన్ (ఫినియాస్ టి.
MNA అనేది T కణాల రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేయడానికి దోహదపడుతుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు ఒక సంభావ్య ఇమ్యునోథెరపీ లక్ష్యంగా పరిగణించబడుతుంది.
మారిసా కె. కిల్‌గౌర్ (మారిసా కె. కిల్‌గౌర్), సారా మాక్‌ఫెర్సన్ (సారా మాక్‌ఫెర్సన్), లారెన్ జి. జకారియాస్ (లారెన్ జి. జకారియాస్), అబిగైల్ ఎలి అరిస్ జి. వాట్సన్ (హెచ్. వాట్సన్), జాన్ స్టాగ్ (జాన్ స్టాగ్), బ్రాడ్ హెచ్. నెల్సన్ (జెల్బ్రాడ్ నేల్సన్), ఆర్. (రాల్ఫ్ జె. డిబెరార్డినిస్), రస్సెల్ జి. జోన్స్ (రస్సెల్ జి. జోన్స్), ఫినియాస్ టి. హామిల్టన్ (ఫినియాస్ టి.
MNA అనేది T కణాల రోగనిరోధక శక్తిని అణచివేయడానికి దోహదపడుతుంది మరియు మానవ క్యాన్సర్ చికిత్సకు ఒక సంభావ్య ఇమ్యునోథెరపీ లక్ష్యంగా పరిగణించబడుతుంది.
©2021 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.