Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ CSS కి పరిమిత మద్దతును కలిగి ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయండి). ఈలోగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను ప్రదర్శిస్తాము.
సకశేరుకాల మాదిరిగా కాకుండా, కీటకాలలో పురుష-పక్షపాత లైంగిక స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లు లేవని విస్తృతంగా భావిస్తారు. అనోఫిలిస్ గాంబియేలో, ఎక్డిసోన్ స్టెరాయిడ్ 20-హైడ్రాక్సీఎక్డిసోన్ (20E) ఆడవారిచే సంశ్లేషణ చేయబడినప్పుడు గుడ్డు అభివృద్ధిని నియంత్రించడానికి మరియు మగవారిచే లైంగికంగా బదిలీ చేయబడినప్పుడు సంభోగం వక్రీభవన కాలాన్ని ప్రేరేపించడానికి పరిణామం చెందినట్లు కనిపిస్తుంది3. గుడ్డు అభివృద్ధి మరియు సంభోగం ముఖ్యమైన పునరుత్పత్తి లక్షణాలు కాబట్టి, ఆడ అనోఫిలిస్ దోమలు ఈ హార్మోన్ల సంకేతాలను ఎలా ఏకీకృతం చేస్తాయో అర్థం చేసుకోవడం కొత్త మలేరియా నియంత్రణ కార్యక్రమాల రూపకల్పనను సులభతరం చేస్తుంది. ఇక్కడ, ఈ పునరుత్పత్తి విధులు ఎక్డిస్టెరాయిడ్-యాక్టివేటింగ్/నిష్క్రియం చేసే ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట నెట్‌వర్క్ ద్వారా విభిన్న సెక్స్ స్టెరాయిడ్‌ల ద్వారా నియంత్రించబడతాయని మేము వెల్లడిస్తాము. లైంగిక బదిలీ మరియు డీఫాస్ఫోరైలేషన్ ద్వారా క్రియాశీలత తర్వాత స్త్రీ లైంగిక గ్రహణశక్తిని మూసివేయడం ద్వారా తల్లిదండ్రులను రక్షించే మగ-నిర్దిష్ట ఆక్సిడైజ్డ్ ఎక్డిసోన్, 3-డీహైడ్రో-20E (3D20E)ని మేము గుర్తించాము. ముఖ్యంగా, 3D20E బదిలీ ప్లాస్మోడియం సంక్రమణ సమయంలో గుడ్డు అభివృద్ధిని నిర్వహించే పునరుత్పత్తి జన్యువుల వ్యక్తీకరణను కూడా ప్రేరేపించింది, ఇది సోకిన ఆడవారి ఆరోగ్యాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. స్త్రీ-ఉత్పన్నం 20E లైంగిక ప్రతిస్పందనను కలిగించదు, కానీ 20E-నిరోధక కైనేస్‌లను నిరోధించిన తర్వాత సంభోగం చేసే వ్యక్తులు గుడ్లు పెట్టడానికి అనుమతిస్తుంది. ఈ పురుష-నిర్దిష్ట క్రిమి స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ యొక్క గుర్తింపు మరియు స్త్రీ లైంగిక గ్రహణశక్తి, సంతానోత్పత్తి మరియు ప్లాస్మోడియంతో పరస్పర చర్యను నియంత్రించడంలో దాని పాత్ర మలేరియా-వ్యాప్తి చేసే దోమల పునరుత్పత్తి విజయాన్ని తగ్గించే సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది.
మానవ మలేరియా పరాన్నజీవుల ఏకైక వాహకం అయిన అనాఫిలిస్ దోమలలో విస్తృతమైన పురుగుమందుల నిరోధకత కారణంగా మలేరియా కేసులు మరియు మరణాలు మళ్లీ పెరుగుతున్నాయి4. ఈ దోమల సంభోగ జీవశాస్త్రం నవల మలేరియా నియంత్రణ జోక్యాలకు ప్రత్యేకంగా ఆకర్షణీయమైన లక్ష్యం ఎందుకంటే ఆడవారు ఒకసారి మాత్రమే సంభోగం చేస్తారు5; ఈ ఒకే సంభోగ సంఘటనను శుభ్రపరచడం వల్ల పొలంలో దోమల జనాభాను తగ్గించడానికి గొప్ప సామర్థ్యం ఉంటుంది.
పురుషుల నుండి అధిక-టైటర్ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లను పొందిన తర్వాత మహిళలు లైంగికంగా అసమర్థులవుతారు. తదుపరి సంభోగంలో ఇబ్బందులకు కారణమయ్యే కారకం 20-హైడ్రాక్సీఎక్డిసోన్ (20E) అని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది లార్వా దశలో కరిగే చక్రాన్ని నియంత్రించే స్టెరాయిడ్ హార్మోన్. 20Eని సంశ్లేషణ చేయడానికి మరియు బదిలీ చేయడానికి మగవారి సామర్థ్యం ప్రత్యేకంగా అనోఫిలిస్ జాతులలో అభివృద్ధి చెందింది, ఇవి సబ్‌జినస్ సెల్లియా7లో భాగమయ్యాయి, ఇది ఆఫ్రికాలో పంపిణీ చేయబడింది మరియు అనోఫిలిస్ గాంబియేతో సహా మలేరియా యొక్క అత్యంత ప్రమాదకరమైన వెక్టర్‌లను కలిగి ఉంది. ఇది ప్రత్యేకంగా గమనించదగినది ఎందుకంటే ఈ జాతులలో ఆడవారు ప్రతి రక్త భోజనం తర్వాత కూడా 20Eని ఉత్పత్తి చేస్తారు మరియు 20E ఓజెనిసిస్ చక్రాన్ని నడిపిస్తుంది (రిఫరెన్స్ 8 చూడండి). అయితే, ఆడవారు తమ స్వంత సంభోగ సామర్థ్యాన్ని రాజీ పడకుండా ఎక్డిసోన్ యొక్క రెండు వేర్వేరు వనరుల నుండి (మగ బదిలీ మరియు రక్త దాణా ప్రేరణ) సంకేతాలను ఏకీకృతం చేసే విధానం గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు. వాస్తవానికి, ఆడవారు ఉత్పత్తి చేసే 20E లైంగిక అసహనాన్ని ప్రేరేపిస్తే, ఇది కన్య-తినిపించే వ్యక్తులలో వంధ్యత్వానికి దారితీస్తుంది, ఈ దోమలలో చాలా సాధారణ ప్రవర్తన5.
దీనికి గల వివరణ ఏమిటంటే, A. గాంబియే మగ జీవులు సవరించిన పురుష-నిర్దిష్ట ఎక్డిసోన్‌ను బదిలీ చేస్తాయి, ఇది స్త్రీ పునరుత్పత్తి మార్గంలో సిగ్నలింగ్ క్యాస్కేడ్‌ను సక్రియం చేస్తుంది, ఫలితంగా సంభోగం అస్థిరత ఏర్పడుతుంది. అయితే, సకశేరుకాలు ఈస్ట్రోజెన్ మరియు ఆండ్రోజెన్ వంటి బహుళ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లను కలిగి ఉన్నప్పటికీ (రిఫరెన్స్ 9లో సమీక్షించబడింది), మనకు తెలిసినంతవరకు, కీటకాలలో ఆండ్రోజెనిక్-పక్షపాత స్టెరాయిడ్లు గుర్తించబడలేదు.
లైంగికంగా పరిణతి చెందిన A. గాంబియే యొక్క మగ పురుష అనుబంధ గ్రంథి (MAG)లో స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ల సంగ్రహణను నిర్ణయించడానికి మేము బయలుదేరాము, సాధ్యమయ్యే సవరించే స్టెరాయిడ్ల కోసం వెతుకుతున్నాము. గతంలో ఉపయోగించిన తక్కువ నిర్దిష్ట పద్ధతి కంటే టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (HPLC-MS/MS)తో కలిపి అధిక పనితీరు గల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీని ఉపయోగించి, ఈ కణజాలంలో ఎక్డిసోన్ (E) మరియు 20Eని గుర్తించాము, ఇది మునుపటి ఫలితాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. అయితే, నమూనా 3-డీహైడ్రో-20E-22-ఫాస్ఫేట్ (3D20E22P)12 (మూర్తి 1) సూత్రానికి అనుగుణంగా ఆక్సిడైజ్డ్ ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ స్టెరాయిడ్‌లచే ఆధిపత్యం చెలాయించింది. ఇతర రూపాల్లో 3-డీహైడ్రో-20E (3D20E) మరియు 20E-22-ఫాస్ఫేట్ (20E22P) ఉన్నాయి. 3D20E22P యొక్క HPLC-MS/MS సిగ్నల్ తీవ్రత దాని డీఫాస్ఫోరైలేటెడ్ రూపం, 3D20E కంటే రెండు ఆర్డర్‌లు ఎక్కువగా ఉంది మరియు E మరియు 20E కంటే మూడు ఆర్డర్‌లు ఎక్కువగా ఉంది (మూర్తి 1).శరీరంలోని ఇతర భాగాలలో మరియు దిగువ పునరుత్పత్తి మార్గంలో (LRT; విస్తరించిన డేటా Fig. 1a) ఉన్నప్పటికీ. కొత్తగా మూసివేయబడిన (<1 రోజు వయస్సు) మగ మరియు ఆడవారిలో కూడా మేము ఎక్డిస్టెరాయిడ్‌లను విశ్లేషించాము మరియు MAGలో మాత్రమే 3D20E మరియు 3D20E22Pని గుర్తించాము; E, 20E మరియు 20E22P రెండు లింగాలలోనూ ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా Fig. 1b). ఈ డేటా A. గాంబియే వయోజన మగవారు తమ MAGలలో ఆడవారిచే సంశ్లేషణ చేయబడని సవరించే హార్మోన్ల అధిక టైటర్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తారని సూచిస్తుంది.
MAG మరియు ఆడ LRT (కర్ణికలు, సెమినల్ వెసికిల్స్ మరియు పరోవేరియంతో సహా) 4 రోజుల (4 రోజుల) వర్జిన్ మగవారి నుండి మరియు వర్జిన్ మరియు జతకట్టిన ఆడవారి నుండి (0.5, 3, మరియు 12 hpm) విచ్ఛేదనం చేయబడ్డాయి. ఈ కణజాలాలలోని ఎక్డిసోన్‌ను HPLC-MS/MS (సగటు ± సెమ్; జతచేయని t-పరీక్ష, రెండు-వైపుల, తప్పుడు ఆవిష్కరణ రేటు (FDR) సరిదిద్దబడింది; NS, ముఖ్యమైనది కాదు; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.035; 12 గంటలు vs. 3 గంటలు, P = 0.0015; 12 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.030. 3D20E22P: 3 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.25; 12 గంటలు vs. 3 గంటలు, P = 0.0032; 12 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.015). డేటా మూడు జీవ ప్రతిరూపాల నుండి తీసుకోబడింది. ఆసక్తి ఉన్న ప్రతి ఎక్డిసోన్ యొక్క గరిష్ట ప్రాంతాన్ని దోమల సంఖ్య ద్వారా లెక్కించి సాధారణీకరించారు. ఎక్డిసోన్ ఈ క్రింది విధంగా రంగు ద్వారా సూచించబడుతుంది: E, ఆకుపచ్చ; 20E, నారింజ; 20E22P, ఊదా; 3D20E, నీలం; 3D20E22P, గులాబీ. ఇన్సెట్ తక్కువ ఎక్డిసోన్ స్థాయిలను చూపించడానికి y-అక్షంపై స్కేల్‌ను పెంచుతుంది.
సంభోగం సమయంలో 3D20E22P మరియు 3D20E బదిలీ చేయబడుతున్నాయా లేదా అని పరిశోధించడానికి, మేము సంభోగం తర్వాత వివిధ సమయ బిందువులలో ఆడ LRTలను విచ్ఛేదనం చేసాము. కన్యలలో ఎక్డిసోన్ కనుగొనబడనప్పటికీ, సంభోగం తర్వాత వెంటనే LRTలో గణనీయమైన మొత్తంలో 3D20E22P (0.5 h పోస్ట్-మేటింగ్, hpm) కనిపించడం గమనించాము, కాలక్రమేణా తగ్గుతోంది, అయితే 3D20E స్థాయిలు గణనీయంగా పెరిగాయి (Fig. 1). రసాయనికంగా సంభోగం చేయబడిన 3D20Eని ప్రమాణంగా ఉపయోగించి, సంభోగం LRTలలో ఈ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ స్థాయిలు 20E కంటే కనీసం 100 రెట్లు ఎక్కువగా ఉన్నాయని మేము నిర్ధారించాము (విస్తరించిన డేటా టేబుల్ 1). అందువల్ల, సంభోగం సమయంలో ఆడ LRTకి బదిలీ చేయబడిన ప్రధాన మగ ఎక్డిసోన్ 3D20E22P, మరియు దాని డీఫాస్ఫోరైలేటెడ్ రూపం, 3D20E, సంభోగం తర్వాత కొద్దిసేపటికే చాలా సమృద్ధిగా మారుతుంది. ఇది ఆడ సంభోగం తర్వాత జీవశాస్త్రంలో తరువాతి ఎక్డిసోన్‌కు ముఖ్యమైన పాత్రను సూచిస్తుంది.
కస్టమ్-బిల్ట్ బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ పైప్‌లైన్‌ని ఉపయోగించి కొత్త RNA సీక్వెన్సింగ్ (RNA-seq) డేటాసెట్ (Fig. 2a)ని రూపొందించిన తర్వాత, మేము ఎక్డిసోన్ కినేస్ (EcK), ఎక్డిసోన్ ఆక్సిడేస్ (EO) మరియు ఎక్డిసోన్ ఎన్‌కోడింగ్ 20E-మోడిఫైడ్ ఫాస్ఫేటేస్ జన్యువు కోసం శోధించాము. EPP) పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో వ్యక్తీకరించబడింది. మేము ఒక అభ్యర్థి EPP జన్యువు మరియు రెండు సంభావ్య EcK జన్యువులను (EcK1 మరియు EcK2) గుర్తించాము, కానీ మంచి అభ్యర్థి EO జన్యువును కనుగొనలేకపోయాము. ముఖ్యంగా, గాంబియన్ MAGలలో వ్యక్తిగత EPP జన్యువులు అధిక స్థాయిలో (98.9వ శాతం) వ్యక్తీకరించబడ్డాయి కానీ స్త్రీ LRTలలో కాదు (Fig. 2b), ఈ స్త్రీ కణజాలంలో 3D20E22P యొక్క డీఫాస్ఫోరైలేషన్ సంభవించినందున మా అంచనాలకు విరుద్ధంగా. అందువల్ల, సంభోగం సమయంలో మగ EPP బదిలీ చేయబడవచ్చని మేము నమ్ముతున్నాము. వాస్తవానికి, సంభోగం తర్వాత స్త్రీ ప్రోటీన్‌ను మాస్క్ చేయడానికి మేము ఇన్ వివో స్టేబుల్ ఐసోటోప్ లేబులింగ్‌ను ఉపయోగించాము, స్త్రీ కర్ణికలో MS ద్వారా గుర్తించబడిన ఎంజైమ్ (Fig. 2c మరియు అనుబంధ పట్టిక 1). MAG మరియు జతకట్టిన (కానీ కన్య కాదు) ఆడ LRT లలో EPP ఉనికిని నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి కూడా నిర్ధారించారు (Fig. 2d).
a, EcKలు, EOలు మరియు EPPలను ఎన్కోడింగ్ చేసే జన్యువుల కోసం ప్రతి లింగం యొక్క పునరుత్పత్తి కణజాలాలను శోధించడానికి అనుకూల-నిర్మిత బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ పైప్‌లైన్. బాణాల పక్కన ఉన్న సంఖ్యలు ప్రతి దశలో పురుష మరియు స్త్రీ అభ్యర్థుల సంఖ్యను సూచిస్తాయి. ఈ విశ్లేషణ పురుషులలో వ్యక్తీకరించబడిన ఒక EPP జన్యువు (EPP) మరియు ఒక EcK జన్యువు (EcK1) మరియు రెండు లింగాలలో వ్యక్తీకరించబడిన కానీ అభ్యర్థి EO జన్యువును ఇవ్వని ఒక EcK జన్యువు (EcK2)ను గుర్తించింది.b, వర్జిన్ (V) మరియు సంభోగం (M) అనోఫిలెస్ గాంబియే మరియు అనోఫిలెస్ అల్బికాన్స్ కణజాలాలలో అభ్యర్థి జన్యు వ్యక్తీకరణను పోల్చిన హీట్‌మ్యాప్.Spca, ఫలదీకరణం; MAGలు, పురుషులలో అనుబంధ గ్రంథులు; శరీరంలోని ఇతర భాగాలు, రొమ్ములు, రెక్కలు, కాళ్ళు, కొవ్వు శరీరాలు మరియు రెండు లింగాలలో అంతర్గత అవయవాలు మరియు స్త్రీలలో అండాశయాలు. గాంబియాలోని MAG మరియు అట్రియా రెండింటిలోనూ EcK2 ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడింది, అయితే EPP MAG.cలో మాత్రమే కనుగొనబడింది, 3, 12 మరియు 24 hpm వద్ద పురుష స్ఖలన సమూహాన్ని స్త్రీ అట్రియాలోకి మార్చడం యొక్క ప్రోటోమిక్ విశ్లేషణ, ఇది 67 అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను చూపిస్తుంది. అన్ని ప్రోటీన్‌లను లేబుల్ చేయడానికి (మరియు ముసుగు చేయడానికి) 15N కలిగిన ఆహారంలో ఆడవారిని పెంచారు. ట్యాగ్ చేయని మగవారిని ట్యాగ్ చేయబడిన ఆడవారితో జత చేశారు మరియు ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ కోసం ఆడ LRTలను 3, 12 మరియు 24 hpm వద్ద విచ్ఛేదనం చేశారు (స్ఖలన ప్రోటీన్ల పూర్తి జాబితా కోసం అనుబంధ పట్టిక 1 చూడండి). ఈ కణజాలాల ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ ద్వారా కన్య పురుషుల MAGలో ఇన్సెట్, EPP, Eck1 మరియు EcK2 కనుగొనబడ్డాయి.d, EPP జతచేయబడిన ఆడవారి MAG మరియు LRTలో వెస్ట్రన్ బ్లాట్ ద్వారా కనుగొనబడింది, కానీ కన్య స్త్రీలు లేదా పురుషులు లేదా మిగిలిన స్త్రీలలో కాదు. శరీరం. పొరలను ఏకకాలంలో యాంటీ-ఆక్టిన్ (లోడింగ్ కంట్రోల్) మరియు యాంటీ-EPP యాంటీబాడీలతో పరిశీలించారు. అన్ని పురుషులు కన్యలే. జెల్ సోర్స్ డేటా కోసం అనుబంధ చిత్రం 1 చూడండి. ఇలాంటి ఫలితాలతో వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌లను రెండుసార్లు ప్రదర్శించారు.
MAG నుండి వేరుచేయబడిన 3D20E22P తో HPLC-MS/MS ద్వారా EPP యొక్క ఎక్డిస్టెరాయిడ్ ఫాస్ఫోఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణను పొదిగిన తర్వాత ధృవీకరించారు (విస్తరించిన డేటా Fig. 2a). ఇంకా, మేము RNA-మధ్యవర్తిత్వ జోక్యం (RNAi) ద్వారా EPPని నిశ్శబ్దం చేసినప్పుడు, ఈ మగవారి పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో ఫాస్ఫేటేస్ చర్యలో బలమైన తగ్గింపును మేము గుర్తించాము (Fig. 3a), మరియు EPP-నిశ్శబ్ద పురుషులతో జతకట్టిన ఆడవారు పాక్షిక జన్యు నిశ్శబ్దం ఉన్నప్పటికీ డీఫాస్ఫోరైలేటెడ్ 3D20E (Fig. 3b) యొక్క తక్కువ నిష్పత్తిని చూపించారు (విస్తరించిన డేటా Fig. 2b,c). దీనికి విరుద్ధంగా, అదే దోమలలో 20E22P/20E నిష్పత్తిలో గణనీయమైన మార్పులను మేము గుర్తించలేదు, ఇది ఎంజైమ్ 3D20E22P (Fig. 3b) కు ప్రత్యేకమైనదని సూచించవచ్చు.
a, డబుల్-స్ట్రాండెడ్ EPP RNA (dsEPP) లేదా డబుల్-స్ట్రాండెడ్ GFP RNA (dsGFP) నియంత్రణలను ఉపయోగించి EPP సైలెన్సింగ్ చేయడం వల్ల MAGలో ఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణ తగ్గింది. ప్రతి ప్రతిరూపంలో ఇరవై MAG పూల్స్ ఉపయోగించబడ్డాయి (P = 0.0046, జత చేసిన t-పరీక్ష, రెండు-వైపుల), ప్రత్యేక చుక్కల ద్వారా సూచించబడ్డాయి.b, EPP-సైలెన్స్డ్ మగవారితో జత చేసిన ఆడవారు 3 hpm వద్ద డీఫాస్ఫోరైలేటెడ్ 3D20E యొక్క గణనీయంగా తక్కువ నిష్పత్తిని కలిగి ఉన్నారు (P = 0.0043, జత చేయని t-పరీక్ష, రెండు-వైపుల), అయితే 20E స్థాయిలు ప్రభావితం కాలేదు (P = 0.063, జత చేయని). t-పరీక్ష, రెండు వైపులా). 13, 16 మరియు 19 ఆడ జంతువుల మూడు కొలనుల నుండి డేటాను సగటు ± sem గా ప్రదర్శించారు. c, EPP- నిశ్శబ్ద మగ జంతువులతో జతకట్టిన ఆడ జంతువులలో తిరిగి జతకట్టే రేటు గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంటుంది (P = 0.0002, ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు వైపులా). ఆడ జంతువులను మొదట వారి సంభోగ స్థితిని నిర్ధారించుకోవడానికి బలవంతంగా జతకట్టించారు; 2 రోజుల తరువాత, ట్రాన్స్‌జెనిక్ స్పెర్మ్‌ను మోసుకెళ్లే ఇతర మగవారిని సంప్రదించి, ట్రాన్స్‌జీన్ యొక్క పరిమాణాత్మక PCR గుర్తింపు ద్వారా పునఃసంయోగ రేటును అంచనా వేశారు. EPP-నిశ్శబ్ద పురుషులతో జతకట్టిన రక్తం తాగిన ఆడవారిలో సంతానోత్పత్తి గణనీయంగా తగ్గింది (P < 0.0001; మన్-విట్నీ పరీక్ష, రెండు-వైపుల) మరియు కొద్దిగా తగ్గిన అండాల సంఖ్య (P = 0.088, మన్-విట్నీ పరీక్ష, రెండు-వైపుల), అయితే గుడ్ల ఉత్పత్తి రేటు ప్రభావితం కాలేదు (P = 0.94, ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల). అన్ని ప్యానెల్‌లలో, n జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమల నమూనాల సంఖ్యను సూచిస్తుంది.NS, ముఖ్యమైనది కాదు.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
తరువాత, ఆడవారిలో సంభోగం నిరోధకతను ప్రేరేపించడానికి ఎక్డిసోన్ డీఫాస్ఫోరైలేషన్ ముఖ్యమా అని మేము అంచనా వేసాము. ముఖ్యంగా, అదనపు (ట్రాన్స్‌జెనిక్) మగవారికి గురైనప్పుడు (Fig. 3c) నియంత్రణ ఆడవారి కంటే (10.4%) చాలా ఎక్కువ పౌనఃపున్యంతో (44.9%) తిరిగి సంభోగం చేయబడిన EPP-క్షీణించిన మగవారితో సంభోగం చేయబడిన ఆడవారిలో (Fig. 3d, ఎడమ) మేము సంభోగంలో గణనీయమైన తగ్గుదల (Fig. 3d, మధ్యలో) మరియు ఈ ఆడవారు పెట్టే గుడ్ల సంఖ్యలో స్వల్ప తగ్గుదల (Fig. 3d, మధ్యలో) గమనించాము, అయితే ఆడవారు పెట్టే గుడ్ల శాతం (సంభోగం ద్వారా ఆడవారిలో వచ్చే మరొక ప్రతిస్పందన) ప్రభావితం కాలేదు (Fig. 3d, కుడి). 3D20E22P కోసం EPP యొక్క గమనించిన విశిష్టతను బట్టి, ఈ ఫలితాలు సంభోగం సమయంలో బదిలీ చేయబడిన EPP ద్వారా 3D20E యొక్క క్రియాశీలత మరింత సంభోగానికి స్త్రీ గ్రహణశక్తిని ఆపివేయడంలో ముఖ్యమైన పాత్రను కలిగి ఉండవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, ఇది గతంలో 20E యొక్క లైంగిక బదిలీకి ఆపాదించబడిన ప్రవర్తన. అందువల్ల, ఈ పురుష-నిర్దిష్ట హార్మోన్ స్త్రీ సంతానోత్పత్తిని కూడా తీవ్రంగా ప్రభావితం చేస్తుంది.
తరువాత, రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E (Fig. 4a–c) మరియు వాణిజ్యపరంగా లభించే 20E ఉపయోగించి లైంగికంగా పరిణతి చెందిన కన్యలలో ఇంజెక్షన్ ప్రయోగాలలో 20E మరియు 3D20E యొక్క కార్యకలాపాలను పోల్చాము. రెండు సాంద్రతల వద్ద స్త్రీ సంభోగానికి సున్నితత్వాన్ని నిలిపివేయడంలో 3D20E 20E కంటే గణనీయంగా ఎక్కువ ప్రభావవంతంగా ఉందని మేము గమనించాము (Fig. 4d). ముఖ్యంగా, LRTలో 3D20E యొక్క సగం శారీరక స్థాయి (1,066 pg పోస్ట్-ఇంజెక్షన్ vs. 2,022 pg పోస్ట్-సంభోగం) అత్యధిక సాంద్రత వద్ద ఇంజెక్షన్ తర్వాత 24 గంటల తర్వాత 20E (361 pg పోస్ట్-ఇంజెక్షన్) యొక్క శారీరక స్థాయి కంటే 20 రెట్లు ఎక్కువగా ఉన్న వక్రీభవన స్త్రీల నిష్పత్తిని ప్రేరేపించింది; విస్తరించిన డేటా పట్టిక 1). ఈ ఫలితం 20E యొక్క లైంగిక బదిలీ సంభోగం వక్రీభవన కాలాలకు కారణం కాదనే భావనకు అనుగుణంగా ఉంది మరియు తల్లిదండ్రులు-పిల్లల సంబంధాన్ని నిర్ధారించడంలో 3D20E ఒక ప్రధాన కారకంగా సూచించబడింది. కన్య స్త్రీలలో గుడ్డు పెట్టే పరీక్షలలో 3D20E 20E కంటే గణనీయంగా ఎక్కువ చురుకుగా ఉంది (Fig. 4e), పాక్షిక EPP నిశ్శబ్దం తర్వాత మేము గమనించిన సాధారణ గుడ్డు పెట్టే రేటు సంభోగం-ప్రేరిత స్త్రీ కారకాల ద్వారా ఇప్పటికీ ఉత్పత్తి చేయబడిన అవశేష 3D20E కార్యాచరణ కారణంగా ఉందని సూచిస్తుంది.
(a,b) 20E (a) నుండి రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E (a) చాలా అధిక మార్పిడి/సామర్థ్యంతో (మూడు స్వతంత్ర సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యల నుండి సగటు ± sem గా సమర్పించబడిన డేటా) (b).c, ద్రవ్యరాశి స్పెక్ట్రం (దిగువ సగం) జతకట్టిన స్త్రీ LRT (పైభాగంలో సగం)లో కనిపించే ఎక్డిసోన్‌తో సరిగ్గా సరిపోతుంది.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల) మరియు 10% ఇథనాల్ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, 2-వైపుల)తో పోలిస్తే, 20E అధిక మోతాదులలో మాత్రమే నియంత్రణ కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంది (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, 2-వైపుల).e, 3D20E ఇంజెక్షన్ 10% ఇథనాల్ నియంత్రణల కంటే కన్య స్త్రీలలో గణనీయంగా ఎక్కువ స్పానింగ్ రేట్లను ప్రేరేపించింది (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల), అయితే 20E నియంత్రణలతో పోలిస్తే అధిక మోతాదుల వద్ద మాత్రమే (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల).3D20E అధిక మోతాదుల వద్ద 20E కంటే గణనీయంగా ఎక్కువ స్పానింగ్ రేట్లను ప్రేరేపించింది (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల).అన్ని ప్యానెల్‌లలో, n జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమల నమూనాల సంఖ్యను సూచిస్తుంది.NS, కాదు ముఖ్యమైనది.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. డేటా మూడు ప్రతిరూపాల నుండి వచ్చింది.
మునుపటి అధ్యయనాలలో, స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ల లైంగిక బదిలీ MISO (సంభోగం-ప్రేరిత స్టిమ్యులేటర్ ఆఫ్ ఓజెనిసిస్ 11) యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుందని మేము నిర్ధారించాము, ఇది A. గాంబియే ఆడవారిని P. ఫాల్సిపరం ఇన్ఫెక్షన్ నుండి రక్షించే స్త్రీ పునరుత్పత్తి జన్యువు, ఇది మానవ మలేరియా పరాన్నజీవి అయిన 13 వల్ల కలిగే ఆరోగ్య ఖర్చులు. మలేరియా-స్థానిక ప్రాంతాలలో అనాఫిలిస్ యొక్క పునరుత్పత్తి ఫిట్‌నెస్‌కు MISO యొక్క ప్రాముఖ్యతను దృష్టిలో ఉంచుకుని, ఈ జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించే హార్మోన్ 3D20E లేదా 20E ని నిర్ణయించాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము. 20E ఇంజెక్షన్ ప్రత్యేకంగా లేదా అంతకంటే ఎక్కువ శక్తివంతంగా HR3 మరియు HR4 వంటి కొన్ని న్యూక్లియర్ హార్మోన్ గ్రాహకాలను (HR) ప్రేరేపించినప్పటికీ, మరియు యోక్జెనిక్ జన్యువులు Vg14, 15, 16 వంటి సాధారణ దిగువ స్టెరాయిడ్ లక్ష్యాలను ప్రేరేపించినప్పటికీ, MISO 3D20E ద్వారా మరింత బలంగా ప్రేరేపించబడిందని మేము కనుగొన్నాము (విస్తరించిన డేటా Fig. 3). అందువల్ల, ఈ ఆండ్రోజెనిక్ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ యొక్క లైంగిక బదిలీ పరాన్నజీవి సంక్రమణ వల్ల కలిగే ఖర్చుల నుండి స్త్రీలను రక్షించే విధానాలను ప్రేరేపిస్తుంది. ఇంకా, 3D20E E గ్రాహక EcR యొక్క రెండు ఐసోఫామ్‌లను భిన్నంగా ప్రభావితం చేస్తుంది, EcR-A ని ప్రేరేపిస్తుంది మరియు EcR-B ని అణచివేస్తుంది మరియు HPX15 తో సహా ఇతర సంభోగ-ప్రేరేపించే జన్యువులను మరింత బలంగా ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది స్త్రీ సంతానోత్పత్తిని ప్రభావితం చేస్తుంది. EPP- నిశ్శబ్ద పురుషులతో జతకట్టిన స్త్రీలలో గమనించిన గణనీయమైన వంధ్యత్వాన్ని ఇది వివరించవచ్చు (విస్తరించిన డేటా Fig. 3). ఈ డేటా లింగ-నిర్దిష్ట పనితీరుకు లోబడి ఉండే రెండు ఎక్డిసోన్ హార్మోన్ల ద్వారా ప్రాధాన్యతగా సక్రియం చేయబడిన దిగువ మార్గాల ఉనికిని సూచిస్తుంది.
తరువాత, మా బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ పైప్‌లైన్‌లో గుర్తించబడిన రెండు EcK జన్యువుల పనితీరును మేము పరీక్షించాము. EcK1 లేదా EcK2 ని నిశ్శబ్దం చేయడం వల్ల పురుషులలో గణనీయమైన మరణాలు సంభవించాయి (విస్తరించిన డేటా Fig. 4a), ఎక్డిసోన్ ఫాస్ఫోరైలేషన్ మరియు అందువల్ల నిష్క్రియం చేయడం మనుగడకు ముఖ్యమైనదని సూచిస్తుంది. EcK2 EcK1 కంటే ఎక్కువ స్థాయిలో వ్యక్తీకరించబడింది మరియు ప్రోటీమిక్స్ ద్వారా MAG లలో కనుగొనబడింది (Fig. 2b,c మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 2), మేము దానిని 20E తో పొదిగించడం ద్వారా దాని ఎక్డిస్టెరాయిడ్ కినేస్ కార్యాచరణను ధృవీకరించాము, దీని ఫలితంగా ఫాస్ఫోరైలేషన్ 20E22P (విస్తరించిన డేటా Fig. 2) వచ్చింది. 4b). 3D20E ని సబ్‌స్ట్రేట్‌గా ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ ఉత్పత్తి 3D20E22P (విస్తరించిన డేటా Fig. 4c) ను మేము గుర్తించలేకపోయాము, ఇది 3D20E కంటే 20E EcK2 యొక్క ప్రాధాన్య లక్ష్యం కావచ్చునని సూచిస్తుంది.
మా RNA-seq విశ్లేషణ ప్రకారం, కన్య స్త్రీల LRTలో EcK2 కూడా ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడింది, ఇక్కడ అది సంభోగం తర్వాత ఆపివేయబడింది (Fig. 2b). మేము ఈ డేటాను నిర్ధారించాము మరియు EcK2 వ్యక్తీకరణ రక్త దాణా ద్వారా ప్రభావితం కాదని నిర్ధారించాము (విస్తరించిన డేటా Fig. 5a). మా ప్రారంభ MS ప్రయోగాలను విస్తరించడం ద్వారా, 20E22P యొక్క గరిష్ట స్థాయి 20E యొక్క గరిష్ట స్థాయికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉందని మేము నిర్ధారించాము (రక్త భోజనం తర్వాత 22-26 గంటలు; విస్తరించిన డేటా Fig. 5b). కన్య స్త్రీలలో EcK2 నిశ్శబ్దం చేయడం వలన రక్త భోజనం తర్వాత 26 గంటలకు 20E నుండి 20E22P యొక్క సాపేక్ష నిష్పత్తిలో 3 రెట్లు పెరుగుదల ఏర్పడింది (విస్తరించిన డేటా గణాంకాలు 2c మరియు 5c), ఇది EcK2 కూడా స్త్రీలలో 20E ఫాస్ఫోరైలేట్ చేస్తుందని నిర్ధారిస్తుంది. ముఖ్యంగా, EcK2-క్షీణించిన కన్యలు పూర్తి లైంగిక గ్రహణశక్తిని కలిగి ఉన్నారు (విస్తరించిన డేటా Fig. 5d,e), 20E యొక్క స్త్రీ ఉత్పత్తి సంభోగం వక్రీభవనాన్ని ప్రేరేపించదని మరింత సూచిస్తుంది. అయితే, ఈ ఆడ జంతువులు నియంత్రణలతో పోలిస్తే గుడ్లు పెట్టే రేటును గణనీయంగా పెంచాయి, 30% కంటే ఎక్కువ కన్యలు గుడ్లు పెడతాయి (విస్తరించిన డేటా Fig. 5f).రక్త దాణా తర్వాత డబుల్ స్ట్రాండెడ్ Eck2 RNA (dsEcK2) ఇంజెక్షన్లు నిర్వహించినట్లయితే, స్పానింగ్ జరగలేదు, ఆ సమయంలో రక్తం తీసుకోవడం వల్ల 20E శిఖరం తగ్గింది. మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు రక్తం పీల్చిన తర్వాత ఉత్పత్తి చేయబడిన 20E స్పానింగ్‌ను ప్రేరేపించగల నమూనాకు మద్దతు ఇస్తాయి, కానీ స్పానింగ్ బ్లాక్ (EcK2 మరియు బహుశా ఇతర కారకాలు) సంభోగం ద్వారా ఆపివేయబడినప్పుడు మాత్రమే. 20E లేదా 3D20E ఇంజెక్షన్లు కన్యలలో EcK2 వ్యక్తీకరణను నిరోధించలేదు (విస్తరించిన డేటా Fig. 5g), ఇతర కారకాలు ఈ కినేస్ నిరోధానికి మధ్యవర్తిత్వం వహిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి. అయితే, రక్త దాణా తర్వాత 20E స్థాయిలు సంభోగం అసౌకర్యాన్ని కలిగించడానికి సరిపోవు, కానీ లైంగికంగా బదిలీ చేయబడిన 3D20E యొక్క అధిక టైటర్‌ల ద్వారా సమర్థవంతంగా ప్రేరేపించబడ్డాయి.
మా ఫలితాలు A. గాంబియే యొక్క పునరుత్పత్తి విజయాన్ని నియంత్రించే విధానాలపై ముఖ్యమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి. మగవారు 3D20E యొక్క అధిక టైటర్‌లను సంశ్లేషణ చేయడానికి పరిణామం చెందిన ఒక నమూనా ఉద్భవించింది, ఇది మగ-నిర్దిష్ట సవరించిన ఎక్డిసోన్, ఇది ఆడవారిని మరింత సంభోగం కోసం డీసెన్సిటైజ్ చేయడం ద్వారా తల్లిదండ్రులను నిర్ధారిస్తుంది. అదే సమయంలో, ఈ మలేరియా వెక్టర్స్ మగ-నిర్దిష్ట EPP యొక్క లైంగిక బదిలీకి ప్రతిస్పందనగా ఆడవారిలో 3D20Eని సక్రియం చేయడానికి సమర్థవంతమైన వ్యవస్థను కూడా అభివృద్ధి చేశాయి. మా జ్ఞానం ప్రకారం, కీటకాలలో ప్రత్యేకమైన మరియు కీలకమైన పనితీరును ప్రదర్శించే పురుష మరియు స్త్రీ ఆధిపత్య స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ వ్యవస్థకు ఇది మొదటి ఉదాహరణ. మగ-నిర్దిష్ట ఎక్డిసోన్ ఫంక్షన్ ప్రతిపాదించబడింది కానీ ఖచ్చితంగా ప్రదర్శించబడలేదు. ఉదాహరణకు, ఎక్కువగా తిరస్కరించబడిన పరికల్పన 18 ఏమిటంటే, ఈ విధులను 20E పూర్వగామి E1 ద్వారా నిర్వహించవచ్చు. డ్రోసోఫిలాలో, మోనాండ్రీ చిన్న సెక్స్ పెప్టైడ్‌ల లైంగిక బదిలీ ద్వారా ప్రేరేపించబడుతుందని అందరికీ తెలుసు19,20 ఇవి నిర్దిష్ట సెక్స్ పెప్టైడ్ ద్వారా స్త్రీ పునరుత్పత్తి మార్గాన్ని కనిపెట్టే న్యూరాన్‌లతో సంకర్షణ చెందుతాయి. గ్రాహకాలు21,22. A. గాంబియే ఆడ జీవులలో 3D20E ద్వారా నియంత్రించబడే దిగువ సిగ్నలింగ్ క్యాస్కేడ్‌లను నిర్ణయించడానికి మరియు ఈ క్యాస్కేడ్‌లను దోమలు మరియు డ్రోసోఫిలా మధ్య సంరక్షించవచ్చో లేదో నిర్ణయించడానికి మరింత పని అవసరం.
మా అధ్యయనంలో గుర్తించబడిన స్త్రీ సంతానోత్పత్తి మరియు ప్రవర్తనపై 3D20E యొక్క ముఖ్యమైన పాత్రను దృష్టిలో ఉంచుకుని, 3D20E సంశ్లేషణ మరియు క్రియాశీలతకు దారితీసే మార్గాలు భవిష్యత్తులో దోమల నియంత్రణ వ్యూహాలకు కొత్త అవకాశాలను అందిస్తాయి, ఉదాహరణకు స్టెరైల్ క్రిమి సాంకేతిక వ్యూహాలలో పోటీ స్టెరైల్ మగవారి ఉత్పత్తి. అడవి విడుదల కోసం ఉపయోగించండి లేదా వర్జిన్ ప్లేలో 3D20Eని అనుకరించండి. A. గాంబియే మరియు ఇతర సెల్లియా జాతులు తమ వీర్యాన్ని సంభోగం ప్లగ్‌లుగా గడ్డకట్టే సామర్థ్యాన్ని పొందినప్పుడు 3D20E యొక్క పురుష-నిర్దిష్ట పనితీరు అభివృద్ధి చెంది ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే ఇది పెద్ద సంఖ్యలో హార్మోన్లు మరియు హార్మోన్-యాక్టివేటింగ్ ఎంజైమ్‌లను సమర్థవంతంగా బదిలీ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది. ప్రతిగా, 3D20E పరిణామం అమలు చేయడం వలన మోనాండ్రీ అధిక మలేరియా ప్రాబల్యం ఉన్న ప్రాంతాలలో వారి పునరుత్పత్తి ఫిట్‌నెస్‌కు అనుకూలంగా ఉండటానికి (MISO యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణ ద్వారా) ఒక యంత్రాంగాన్ని అందిస్తుంది, ఇది పరోక్షంగా ప్లాస్మోడియం ప్రసారానికి దోహదం చేస్తుంది. ఆడ అనోఫిలిస్ దోమలలో P. ఫాల్సిపరం యొక్క మనుగడ మరియు పెరుగుదలపై ఆడ 20E తీవ్ర ప్రభావాలను చూపుతుందని చూపబడింది,24 మగ మరియు ఆడ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ మార్గాలు రెండూ ఇప్పుడు దోమ-పరాన్నజీవి పరస్పర చర్యలలో కీలకమైన అంశాలు.
A. గాంబియే G3 జాతులను ప్రామాణిక కీటకాల పరిస్థితులలో (26-28 °C, 65-80% సాపేక్ష ఆర్ద్రత, 12:12 h కాంతి/చీకటి ఫోటోపీరియడ్) పెంచారు. లార్వాలకు పౌడర్డ్ ఫిష్ ఫుడ్ (టెట్రామిన్ ట్రాపికల్ ఫ్లేక్స్, కోయి పెల్లెట్స్ మరియు టెట్రా పాండ్ స్టిక్స్ 7:7:2 నిష్పత్తిలో) తినిపించారు. వయోజన దోమలకు యాడ్ లిబిటమ్ 10% డెక్స్ట్రోస్ ద్రావణం మరియు వారపు మానవ రక్తం (రక్త భాగాలను అధ్యయనం చేయండి) తినిపించారు. మైక్రోస్కోపీ ద్వారా చివరలను పరిశీలించిన తర్వాత ప్యూపల్ దశలో లింగాలను వేరు చేయడం ద్వారా వర్జిన్ దోమలను పొందారు. DsRed ట్రాన్స్‌జీన్‌ను కలిగి ఉన్న మగ దోమలను గతంలో వివరించబడింది.
గతంలో వివరించిన ప్రోటోకాల్‌ల ప్రకారం బలవంతంగా సంభోగం ప్రయోగాలు జరిగాయి. సహజ సంభోగం కోసం, 4 రోజుల వయసున్న కన్య ఆడ జంతువులను లైంగికంగా పరిణతి చెందిన కన్య మగ జంతువులతో 1:3 నిష్పత్తిలో రెండు రాత్రులు ఉంచారు. మగ జంతువులకు dsEPP ఇంజెక్ట్ చేసిన ప్రయోగాలకు, ఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణ గరిష్టంగా నిశ్శబ్దం చేయబడినప్పుడు, ఇంజెక్షన్ తర్వాత 3-4 రోజులతో కో-కేజింగ్ సమానంగా జరిగింది (విస్తరించిన డేటా Fig. 2b).
దోమల కణజాలాలు, మిగిలిన శవాలు (శరీరంలోని మిగిలిన భాగం) లేదా మొత్తం శరీరాన్ని 100% మిథనాల్‌గా విడదీసి, బీడర్‌తో (2 మిమీ గాజు పూసలు, 2,400 rpm, 90 సెకన్లు) సజాతీయపరచారు. కణజాల పరిమాణాలు మరియు మిథనాల్ వాల్యూమ్‌లు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి: మిగిలిన శరీరం, 1,000 µlలో 50; MAG, 50–100 80 µl; ఆడ LRT, 25–50 80 µl. అవక్షేపణను అదే పరిమాణంలో మిథనాల్‌తో రెండవ మిథనాల్ వెలికితీతకు గురి చేశారు. సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కణ శిధిలాలను తొలగించారు. రెండు వెలికితీతల నుండి మిథనాల్‌ను కలిపి నత్రజని ప్రవాహంలో ఎండబెట్టి, తరువాత నీటిలో 80% మిథనాల్ యొక్క క్రింది వాల్యూమ్‌లలో తిరిగి ఉంచారు: మిగిలిన శరీరం, 50 µl; MAGలు మరియు ఆడ LRT, 30 µl.
నమూనాలను LC పరికరం (వాన్క్విష్, థర్మో ఫిషర్) తో కలిపి మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (ID-X, థర్మో ఫిషర్) పై విశ్లేషించారు. 5 µl నమూనాను 25 °C వద్ద నిర్వహించబడే 3 µm, 100 × 4.6 mm కాలమ్ (ఇన్‌స్పైర్ C8, డిక్మా) పై ఇంజెక్ట్ చేశారు. LC కోసం మొబైల్ దశలు A (నీరు, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం) మరియు B (అసిటోనిట్రైల్, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం). LC ప్రవణత ఈ క్రింది విధంగా ఉంది: 1 నిమిషానికి 5% B, తరువాత 11 నిమిషాల్లో 100% B కి పెరిగింది. 100% వద్ద 8 నిమిషాల తర్వాత, 4 నిమిషాల పాటు 5% B వద్ద కాలమ్‌ను తిరిగి సమతౌల్యం చేయండి. ప్రవాహం రేటు 0.3 ml min-1. MS సోర్స్‌లో అయనీకరణం సానుకూల మరియు ప్రతికూల మోడ్‌లలో వేడిచేసిన ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ ద్వారా సాధించబడుతుంది.
మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ పూర్తి MS మోడ్‌లో 60,000 రిజల్యూషన్ వద్ద 350 నుండి 680 వరకు m/z పరిధిలో డేటాను కొలుస్తుంది. [M + H]+ (అన్ని లక్ష్యాలు), [M - H2O + H]+ (అన్ని లక్ష్యాలు) మరియు [M - H]- (ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ లక్ష్యాలు)పై MS/MS డేటాను పొందారు. ఎటువంటి ప్రమాణం అందుబాటులో లేని లక్ష్యాల యొక్క ఎక్డిసోన్ లక్షణాలను నిర్ధారించడానికి MS/MS డేటాను ఉపయోగించారు. లక్ష్యంగా లేని ఎక్డిస్టెరాయిడ్‌లను గుర్తించడానికి, >15% సాపేక్ష సమృద్ధి ఉన్న అన్ని HPLC శిఖరాల కోసం MS/MS డేటాను విశ్లేషించారు. ఒక పురుషుడిలో కనిపించే మొత్తాలకు వాటి సమానత్వాన్ని లెక్కించడానికి ఒక నిర్దిష్ట నమూనా (అన్ని ఇతర లక్ష్యాలు) యొక్క సంపూర్ణ మొత్తాలు లేదా పలుచనలను లెక్కించడానికి స్వచ్ఛమైన ప్రమాణాల (20E, 3D20E) నుండి సృష్టించబడిన ప్రామాణిక వక్రతలను ఉపయోగించి పరిమాణీకరించండి. 3D20E కోసం, కింది సంకలనాల మొత్తాన్ని ఉపయోగించి పరిమాణీకరణ జరిగింది: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. ట్రేస్‌ఫైండర్ (వెర్షన్ 4.1) ఉపయోగించి డేటాను సంగ్రహించి, లెక్కించారు. MS/MS డేటాను Xcalibur (వెర్షన్ 4.4) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. E, 20E మరియు 3D20E యొక్క MS స్పెక్ట్రాను సంబంధిత ప్రమాణాలతో పోల్చారు. 3D20E22P ను గిరార్డ్ యొక్క రియాజెంట్‌తో ఉత్పన్నం చేయడం ద్వారా విశ్లేషించారు. 20E22P ను m/z నిష్పత్తి ద్వారా విశ్లేషించారు.
MAG నుండి 3D20E22P శుద్ధి చేయబడింది. HPLC-MS/MS విశ్లేషణ వలె అదే LC పరిస్థితులలో క్వాడ్రూపోల్ మాస్-బేస్డ్ డిటెక్టర్ (QDa, అక్విటీ, వాటర్స్)తో అల్ట్రా-పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రాఫ్ (అక్విటీ, వాటర్స్) ఉపయోగించి విశ్లేషణాత్మక స్థాయిలో శుద్దీకరణ జరిగింది. గతంలో నిర్ణయించిన అదే నిలుపుదల సమయంలో 3D20E22Pకి సంబంధించిన m/z కనుగొనబడినప్పుడు భిన్న సేకరణ ప్రేరేపించబడింది. పైన వివరించిన విధంగా సంగ్రహించిన సమ్మేళనాల స్వచ్ఛతను HPLC-MS/MS ద్వారా తనిఖీ చేశారు.
తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి TRI రియాజెంట్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి 10-12 పునరుత్పత్తి కణజాలాలు లేదా శరీరంలోని ఇతర భాగాల నుండి (తలలేని) మొత్తం RNA సంగ్రహించబడింది. RNAను TURBO DNase (థర్మో ఫిషర్)తో చికిత్స చేశారు. తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి మోలోనీ మురైన్ లుకేమియా వైరస్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (M-MLV RT; థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి cDNAను సంశ్లేషణ చేశారు. రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (RT-qPCR; ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా టేబుల్ 2) కోసం ప్రైమర్‌లు గతంలో ప్రచురించబడ్డాయి24 లేదా ప్రైమర్-BLAST26ని ఉపయోగించి రూపొందించబడ్డాయి, 70-150 bp పరిమాణం మరియు విస్తరించిన ఎక్సాన్-ఎక్సాన్ జంక్షన్‌లు లేదా ప్రైమర్ పెయిర్ ప్రైమర్‌ల ఉత్పత్తులకు ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడింది. RT-qPCR కోసం మూడు నుండి నాలుగు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లను నీటిలో నాలుగు రెట్లు కరిగించారు. 1× పవర్‌అప్ SYBR గ్రీన్ మాస్టర్ మిక్స్ (థర్మో ఫిషర్), ప్రైమర్‌లు మరియు 5 µl డైల్యూటెడ్ cDNA కలిగిన 15 µl రెప్లికేట్ రియాక్షన్‌లలో పరిమాణీకరణ జరిగింది. ప్రతిచర్యలు aపై అమలు చేయబడ్డాయి క్వాంట్‌స్టూడియో 6 ప్రో రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్) మరియు డేటాను డిజైన్ అండ్ అనాలిసిస్ (వెర్షన్ 2.4.3) ఉపయోగించి సేకరించి విశ్లేషించారు. ఈ అధ్యయనంలో ప్రదర్శించినట్లుగా, సాపేక్ష మొత్తాలు రైబోసోమల్ జన్యువు RpL19 (AGAP004422) కు సాధారణీకరించబడ్డాయి, దీని వ్యక్తీకరణ రక్తం తినిపించడం 27 లేదా సంభోగం 3 తో ​​గణనీయంగా మారలేదు.
ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ 2100 బయోఅనలైజర్ (ఎజిలెంట్) ఉపయోగించి RNA నాణ్యతను తనిఖీ చేశారు. ఇల్యూమినా జత చేసిన-ముగింపు లైబ్రరీలను బ్రాడ్ ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ MIT మరియు హార్వర్డ్‌లో తయారు చేసి అమలు చేశారు. సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌లు HISAT2 (వెర్షన్ 2.0.5) ఉపయోగించి A. గాంబియే జీనోమ్ (PEST స్ట్రెయిన్, వెర్షన్ 4.12) కు సమలేఖనం చేయబడ్డాయి. మ్యాపింగ్ నాణ్యత (MAPQ) స్కోర్‌లు <30 ఉన్న రీడ్‌లు Samtools (వెర్షన్ 1.3.1) ఉపయోగించి తొలగించబడ్డాయి. డిఫాల్ట్ పారామితులతో htseq-count (వెర్షన్ 0.9.1) ఉపయోగించి జన్యువులకు మ్యాప్ చేయబడిన రీడ్‌ల సంఖ్యను లెక్కించారు. సాధారణీకరించిన రీడ్ కౌంట్‌లు లెక్కించబడ్డాయి మరియు R (వెర్షన్ 4.0.3) లోని DESeq2 ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.28.1) ఉపయోగించి అవకలన జన్యు వ్యక్తీకరణను విశ్లేషించారు.
ఎక్డిసోన్-సవరించే జన్యు అభ్యర్థులను మొదట PSI-BLAST అల్గోరిథం (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ఉపయోగించి A. gambiae జన్యువును శోధించడం ద్వారా గుర్తించారు, డిఫాల్ట్ విలువలను ఉపయోగించి కింది ప్రశ్న ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లతో పారామితులు: బాంబిక్స్ మోరి (యాక్సెషన్ నం. NP_001038956.1), ముస్కా డొమెస్టికా (యాక్సెషన్ నం. XP_005182020.1, XP_005175332.1 మరియు XP_011294434.1) మరియు మైక్రోప్లిటిస్ డెమోలిటర్ (యాక్సెషన్ నం. XP_008552646.1 మరియు XP_008552645.1) నుండి EcK బి. మోరి (యాక్సెషన్ నం. NP_001036900), డ్రోసోఫిలా మెలనోగాస్టర్ (యాక్సెషన్ నం. NP_651202), అపిస్ మెల్లిఫెరా (యాక్సెషన్ నం. XP_394838) మరియు అసిర్తోసిఫోన్ పిసమ్ (యాక్సెషన్ నం. XP_001947166); మరియు B. మోరి (యాక్సెషన్ నం. XP_001947166) NP_001177919.1 మరియు NP_001243996.1) నుండి EPP మరియు D. మెలనోగాస్టర్ (యాక్సెషన్ నం. NP_572986.1) యొక్క EO (దశ 1). తరువాత, గాంబియాలోని పునరుత్పత్తి కణజాలంలో (స్త్రీ LRT లేదా MAG) (దశ 2) అధిక mRNA వ్యక్తీకరణ (>100 శకలాలు/కిలోబేస్ ఎక్సోన్లు పర్ మిలియన్ మ్యాప్డ్ రీడ్‌లు (FPKM) లేదా >85%) ఆధారంగా ఫిల్టర్ హిట్ అవుతుంది. విశిష్టతను మెరుగుపరచడానికి, సంభోగం సమయంలో ఎక్డిసోన్‌ను సంశ్లేషణ చేయని లేదా బదిలీ చేయని అనోఫిలిస్ జాతి అయిన A. అల్బిమానస్ యొక్క పునరుత్పత్తి కణజాలంలో కూడా వ్యక్తీకరించబడిన అభ్యర్థి ఎంజైమ్‌లను మేము ఎంచుకున్నాము. A. అల్బిమానస్ పునరుత్పత్తి కణజాలంలో (దశ 3) తక్కువ వ్యక్తీకరణ (<100 FPKM లేదా <85వ శాతం) ఆధారంగా అభ్యర్థి జన్యువులను ఫిల్టర్ చేశారు. తుది ఫిల్టర్‌గా (దశ 4), అభ్యర్థి జన్యువులు కింది వాటిలో కనీసం ఒకదానిని సంతృప్తి పరచాలి: (1) విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువుల విశ్లేషణ ప్రకారం సంభోగం తర్వాత గణనీయంగా పైకి నియంత్రించబడతాయి (P < 0.05) మరియు (2) పునరుత్పత్తి కాని కణజాలాలలో (< 85 % లేదా <100 FPKM).
మొత్తం జీవి ఐసోటోపిక్ లేబులింగ్‌ను సాధించడానికి మేము గతంలో వివరించిన పద్ధతులను 28,29,30 సవరించాము. క్లుప్తంగా, వైల్డ్-టైప్ సాచరోమైసెస్ సెరెవిసియా టైప్ II (YSC2, సిగ్మా) ను ఈస్ట్ నైట్రోజన్ బేస్ (BD డిఫ్కో, DF0335) లో (wt/vol) 2% గ్లూకోజ్ (G7528, సిగ్మా), 1.7% అమైనో ఆమ్లం లేని మరియు అమ్మోనియం సల్ఫేట్. కల్చర్ మీడియం) మరియు 5% 15N అమ్మోనియం సల్ఫేట్ (NLM-713, >99%, కేంబ్రిడ్జ్ ఐసోటోప్ లాబొరేటరీస్) కలిగి ఉన్న ఈస్ట్ నైట్రోజన్ బేస్ (BD డిఫ్కో, DF0335) లో పరీక్షించారు. ఈస్ట్ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా తిరిగి పొందబడింది మరియు దోమల లార్వాలను ప్యూపేషన్ వరకు యాడ్ లిబిటమ్ తినిపించారు. నాల్గవ ఇన్‌స్టార్ మరణాలను నివారించడానికి ఫిష్‌మీల్ (300 లార్వాకు 0.5 mg) తో సప్లిమెంట్. సంభోగం సమయంలో బదిలీ చేయబడిన మగ ప్రోటీమ్‌ను విశ్లేషించడానికి లేబుల్ చేయని మగవారితో సంభోగం ప్రయోగాలలో ఆడవారిని మాత్రమే ఉపయోగించారు.
4-6 రోజుల వయసున్న 15N-ట్యాగ్ చేయబడిన వర్జిన్ ఆడ జంతువులను వయస్సుకు సరిపోయే ట్యాగ్ చేయని వర్జిన్ మగ జంతువులతో జతకట్టవలసి వచ్చింది. ఎపిఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ కింద సంభోగం ప్లగ్‌లను గుర్తించడం ద్వారా విజయవంతమైన సంభోగం ధృవీకరించబడింది. 3, 12, మరియు 24 hpm వద్ద, 45-55 సంభోగం చేయబడిన ఆడ జంతువుల కర్ణికలను 50 µl అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ బఫర్ (pH 7.8)గా విడదీసి, ఒక రోకలితో సజాతీయీకరించారు. హోమోజెనేట్‌ను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సూపర్‌నాటెంట్‌ను 50 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్‌లో 0.1% రాపిజెస్ట్ (186001860, వాటర్స్) యొక్క 50 µlతో కలిపారు. ప్రతి నమూనా నుండి సూపర్‌నాటెంట్ మరియు గుళికలను పొడి మంచు మీద స్తంభింపజేసి రాత్రిపూట వాషింగ్టన్ విశ్వవిద్యాలయంలోని మాక్‌కాస్ ప్రయోగశాలకు రవాణా చేశారు, అక్కడ LC-MS/MS కోసం నమూనా తయారీ పూర్తయింది. 50 mM అమ్మోనియంలో 0.1% రాపిజెస్ట్ యొక్క 50 µlలో గుళికను తిరిగి అమర్చండి. నీటి స్నానంలో బైకార్బోనేట్ మరియు సోనికేట్. గుళిక మరియు సూపర్‌నాటెంట్ యొక్క ప్రోటీన్ సాంద్రతను BCA అస్సే ద్వారా కొలుస్తారు, నమూనాలను 5 mM డైథియోథ్రెయిటాల్ (DTT; సిగ్మా)తో తగ్గించారు, 15 mM అయోడోఅసెటమైడ్ (సిగ్మా)తో ఆల్కైలేట్ చేసి 37 °C (1:0 50) వద్ద 1 గంట పాటు ట్రిప్సినైజేషన్: ట్రిప్సిన్:సబ్‌స్ట్రేట్ నిష్పత్తితో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. రాపిజెస్ట్‌ను 200 mM HCl జోడించడం ద్వారా లైస్ చేశారు, తరువాత 37 °C వద్ద 45 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు మరియు శిధిలాలను తొలగించడానికి 4 °C వద్ద 10 నిమిషాలు 14,000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేశారు. నమూనాలను డ్యూయల్-మోడ్ సాలిడ్-ఫేజ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ (ఒయాసిస్ MCX కార్ట్రిడ్జ్‌లు, వాటర్స్) ద్వారా కడిగి, 0.33 µg µl-1 తుది ప్రోటీన్ సాంద్రత కోసం 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లంలో తిరిగి అమర్చారు. లేబుల్ చేయని MAG ప్రోటీమ్‌లను వర్జిన్ మగవారి నుండి అదేవిధంగా విశ్లేషించారు. రెండు ప్రతి నమూనాకు విశ్లేషణాత్మక ప్రతిరూపాలను విశ్లేషించారు. తరువాత, జూపిటర్ C12 రివర్స్డ్-ఫేజ్ రెసిన్ (ఫెనోమెనెక్స్) మరియు 180 నిమిషాల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీతో ప్యాక్ చేయబడిన 4-సెం.మీ ఫ్యూజ్డ్ సిలికా కాసిల్1 (PQ) ఫ్రిట్ ట్రాప్‌తో 25-సెం.మీ ఫ్యూజ్డ్ సిలికా 75-μm కాలమ్‌ను ఉపయోగించి ప్రతిదానిలో 1 µg విశ్లేషించబడింది. నమూనా డైజెస్ట్‌లు - MS/MS ను నానోACQUITY UPLC సిస్టమ్ (వాటర్స్) తో Q-ఎక్సాక్టివ్ HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్) పై అమలు చేశారు. ప్రతి రన్ కోసం ఉత్పత్తి చేయబడిన డేటా-సంబంధిత సముపార్జన డేటాను ప్రోటీయోవిజార్డ్ (వెర్షన్ 3.0.20287) ఉపయోగించి మరియు కామెట్31 (వెర్షన్ 3.2) ఉపయోగించి అనోఫిలెస్ గాంబియే (వెక్టర్‌బేస్ వెర్షన్ 54), అనోఫిలెస్ కొలుజ్జి నుండి ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉన్న FASTA డేటాబేస్‌కు వ్యతిరేకంగా mzML ఫార్మాట్‌కు మార్చారు. మాలి-NIH (వెక్టర్‌బేస్ వెర్షన్ 54), సాచరోమైసెస్ సెరెవిసియా (యూనిప్రోట్, మార్చి 2021), A. గాంబియే RNA-seq మరియు తెలిసిన మానవ కలుషితాల యొక్క మూడు-ఫ్రేమ్ అనువాదాలపై శోధన జరిగింది. పెప్టైడ్ మ్యాప్-సరిపోలిన FDR లను 0.01 థ్రెషోల్డ్‌తో పెర్కోలేటర్32 (వెర్షన్ 3.05) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు మరియు పెప్టైడ్‌లను ప్రోటీన్ పార్సిమోనీని ఉపయోగించి ప్రోటీన్ గుర్తింపులలో సమీకరించారు. లైమ్‌లైట్33 (వెర్షన్ 2.2.0). గతంలో వివరించిన విధంగా ప్రతి రన్‌లో ప్రతి ప్రోటీన్‌కు లెక్కించిన నార్మలైజ్డ్ స్పెక్ట్రల్ బండినెస్ ఫ్యాక్టర్ (NSAF) ఉపయోగించి సాపేక్ష ప్రోటీన్ సమృద్ధిని అంచనా వేశారు. ప్రతి ప్రోటీన్‌కు సంబంధించి NSAF రెండు వేర్వేరు జీవ ప్రతిరూపాల నుండి నమూనాలలో సగటున లెక్కించబడింది. 15N లేబులింగ్ స్త్రీ ప్రోటీమ్‌ను విజయవంతంగా ముసుగు చేసింది, అయినప్పటికీ లేబుల్ చేయబడిన వర్జిన్స్ నుండి తక్కువ మొత్తంలో లేబుల్ చేయని ప్రోటీన్‌ను కనుగొనవచ్చు. HPLC "క్యారీ ఓవర్" ఫలితంగా ముడి నమూనాలను మగ/సంభోగం నమూనాల తర్వాత అమలు చేసిన సాంకేతిక పరుగులలో మాత్రమే స్త్రీ ముడి నమూనాలలో మగ ప్రోటీన్ తగ్గింపు (1-5 స్పెక్ట్రా) గుర్తింపును మేము నమోదు చేసాము. లేబుల్ చేయబడిన వర్జిన్స్ నుండి 'కలుషితాలు'గా కనుగొనబడిన అప్పుడప్పుడు ప్రోటీన్లు అనుబంధ పట్టిక 1లో జాబితా చేయబడ్డాయి.
జెన్‌స్క్రిప్ట్‌లో రెండు యాంటిజెనిక్ పెప్టైడ్‌లు, QTTDRVAPAPDQQQ (ఐసోటైప్ PA లోపల) మరియు MESDGTTPSGDSEQ (ఐసోటైప్ PA మరియు PB లోపల). రెండు పెప్టైడ్‌లను కలిపి, తరువాత క్యారియర్ ప్రోటీన్ KLHతో సంయోగం చేసి న్యూజిలాండ్ కుందేళ్ళలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. నాల్గవ ఇంజెక్షన్ తర్వాత కుందేళ్ళను బలి ఇచ్చారు మరియు మొత్తం IgGని అఫినిటీ ప్యూరిఫికేషన్ ద్వారా వేరు చేశారు. అత్యంత EPP-నిర్దిష్ట కుందేలు నుండి IgGని మరింత వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ కోసం ఉపయోగించారు.
వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌ల కోసం, MAG (n = 10, ఇక్కడ n జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమల నమూనాల సంఖ్యను సూచిస్తుంది) మరియు 4 రోజుల వయసున్న వర్జిన్ మగవారి నుండి మరియు వర్జిన్ లేదా ఫోర్స్-మేటడ్ ఆడవారి నుండి (<10 పోస్ట్-మేటడ్), ప్రోటీన్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ బఫర్ (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% సోడియం డియోక్సికోలేట్; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ కాక్‌టెయిల్ (రోచె)) విడిగా జోడించబడింది. బీడర్‌తో విచ్ఛేదనం చేసిన వెంటనే నమూనాలను సజాతీయపరచారు (2 mm గాజు పూసలు, 2,400 rpm, 90 సెకన్లు). కరగని శిధిలాలను 4 °C వద్ద 20,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా తొలగించారు. బ్రాడ్‌ఫోర్డ్ అస్సే (బయో-రాడ్) ద్వారా ప్రోటీన్‌లను లెక్కించారు. తరువాత, 20 µg MAG ప్రోటీన్, 40 µg LRT ప్రోటీన్, మరియు 20 µg అవశేష బల్క్ ప్రోటీన్‌ను MOPS బఫర్ ఉపయోగించి 10% Bis-Tris NuPAGE ద్వారా డీనేచర్ చేసి వేరు చేశారు. iBlot2 ట్రాన్స్‌ఫర్ సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్‌లను పాలీవినైలిడిన్ ఫ్లోరైడ్ పొరలకు బదిలీ చేశారు. పొరలను 1× PBS-T (PBSలో 0.1% Tween-20)లో రెండుసార్లు కడిగి, ఆపై ఒడిస్సీ బ్లాకింగ్ బఫర్ (Li-Cor)లో 22°C వద్ద 1 గంట పాటు నిరోధించారు. పొరలను 4 °C వద్ద రాత్రిపూట కస్టమ్ రాబిట్ యాంటీ-EPP పాలిక్లోనల్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ (బ్లాకింగ్ బఫర్‌లో 1:700) మరియు రాట్ యాంటీ-ఆక్టిన్ మోనోక్లోనల్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ MAC237 (Abeam; 1:4,000)తో కదిలించారు. పొరలను PBS-Tతో కడిగి, ఆపై సెకండరీ యాంటీబాడీస్ (గాడిద యాంటీ-రాబిట్ 800CW మరియు మేక యాంటీ-రాట్ 680LT (Li-Cor), రెండూ 1:20,000)తో పొదిగించారు. 0.01% కలిగిన బ్లాకింగ్ బఫర్‌లో 22 °C వద్ద 1 గంట పాటు SDS మరియు 0.2% Tween -20. పొరలను PBS-Tతో కడిగి, ఒడిస్సీ CLx స్కానర్‌తో చిత్రించారు. చిత్రాలను సేకరించి ఇమేజ్ స్టూడియోలో (వెర్షన్ 5.2) ప్రాసెస్ చేశారు. EPP-RA ఐసోఫార్మ్ (82 kDa)కి సంబంధించిన నిర్దిష్ట బ్యాండ్ కనుగొనబడలేదు.
EPP యొక్క కోడింగ్ ప్రాంతాలు (హిస్టిడిన్ ఫాస్ఫేటేస్ డొమైన్‌ను కలిగి ఉన్న ఐసోఫార్మ్ AGAP002463-RB, NCBI సంరక్షించబడిన డొమైన్ శోధన 34) మరియు EcK2 (AGAP002181) లను pET-21a(+) ప్లాస్మిడ్ (నోవాగెన్ మిల్లిపోర్ సిగ్మా) లోకి క్లోన్ చేశారు; ప్రైమర్‌లు ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా టేబుల్ 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. pET-21a(+)-EcK2 నిర్మాణం యొక్క C-టెర్మినల్ 6xHis ట్యాగ్‌కు ముందు ఎనిమిది GS4 లింకర్‌లు (టాండెమ్‌లో) చొప్పించబడ్డాయి. NEBExpress సెల్-ఫ్రీ E. coli ప్రోటీన్ సింథసిస్ రియాక్షన్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోల్యాబ్స్) ఉపయోగించి రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లు ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. NEBExpress Ni స్పిన్ కాలమ్‌లను (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోల్యాబ్స్) ఉపయోగించి రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లు శుద్ధి చేయబడ్డాయి. NEBExpress సెల్-ఫ్రీ E. coli ప్రోటీన్ సింథసిస్ కిట్ నుండి DNA టెంప్లేట్ ఉపయోగించి డైహైడ్రోఫోలేట్ రిడక్టేజ్ (DHFR) నియంత్రణ ప్రోటీన్ ఉత్పత్తి చేయబడింది. ప్రోటీన్‌లను PBSలో -20 °C వద్ద 3 నెలల వరకు నిల్వ చేశారు.
EPP మరియు కణజాల సారాల యొక్క ఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణను 4-నైట్రోఫెనైల్ ఫాస్ఫేట్ (pNPP; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉపయోగించి కొలుస్తారు. ప్రతిచర్య బఫర్‌లో 25 mM ట్రిస్, 50 mM ఎసిటిక్ యాసిడ్, 25 mM బిస్-ట్రిస్, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, మరియు 1 mM DTT ఉన్నాయి. ప్రతిచర్య బఫర్‌లో కణజాలాన్ని సజాతీయపరచారు మరియు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కణ శిధిలాలను తొలగించారు. 2.5 mg ml-1 pNPP కలిగిన ప్రతిచర్య బఫర్‌కు ఎంజైమ్ లేదా కణజాల సారాన్ని జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్యను ప్రారంభించండి. ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పొదిగించారు మరియు pNPP నుండి మార్చబడిన pNP మొత్తాన్ని వివిధ సమయాల్లో 405 nm వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా లెక్కించారు.
ఇన్ విట్రో EcK యాక్టివిటీ కోసం, ప్రోటీన్‌ను 27 °C వద్ద 2 గంటలకు 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP మరియు 10 mM MgCl2 కలిగిన 200 µl బఫర్ (pH 7.5)లో 0.2 mg 20E లేదా 3D20Eతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 800 µl మిథనాల్‌ను జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్యను ఆపివేసి, ఆపై -20 °C వద్ద 1 గంట పాటు చల్లబరిచి, ఆపై 4 °C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 20,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను HPLC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషించారు. నియంత్రణ సమూహంలో ఉపయోగించే ప్రోటీన్‌లను వేడి-నిష్క్రియం చేయడానికి, ప్రోటీన్‌లను PBSలో 50% గ్లిసరాల్‌లో 20 నిమిషాలు 95°C వద్ద పొదిగించారు.
ఇన్ విట్రో EPP కార్యాచరణ కోసం, ప్రోటీన్‌ను 27 °C వద్ద 3 గంటల పాటు 25 mM Tris, 50 mM ఎసిటిక్ ఆమ్లం, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, మరియు 1 mM DTT కలిగిన 100 µl బఫర్ (pH 7.5)లో 3D20E22P (18 జతల MAGలో కనుగొనబడిన మొత్తానికి సమానం)తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 400 µl మిథనాల్‌ను జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్యను ఆపివేసి, -20 °C వద్ద 1 గంట పాటు చల్లబరిచారు, ఆపై 4 °C వద్ద 10 నిమిషాలు 20,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను HPLC-MS/MS విశ్లేషించింది.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) మరియు EcK2 (556 bp) ల కొరకు PCR భాగాలు మిశ్రమ-లింగ తలలేని దోమల శవాల నుండి తయారు చేయబడిన cDNA నుండి విస్తరించబడ్డాయి. eGFP నియంత్రణ (495 bp) యొక్క PCR భాగం గతంలో వివరించిన pCR2.1-eGFP నుండి విస్తరించబడింది; PCR ప్రైమర్‌లు ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా టేబుల్ 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. PCR భాగాన్ని pL4440 ప్లాస్మిడ్‌లోని విలోమ T7 ప్రమోటర్‌ల మధ్య చొప్పించారు. ప్లాస్మిడ్ నిర్మాణాలు NEB 5-α కాంపిటెంట్ E. coli (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్) నుండి తిరిగి పొందబడ్డాయి మరియు ఉపయోగం ముందు DNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి (ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్ కోసం సప్లిమెంటరీ డేటా 1 చూడండి). T7 ప్రమోటర్ (ఎక్స్‌టెండెడ్ డేటా టేబుల్ 2)కి సరిపోలిన ప్రైమర్‌లు pL4440-ఆధారిత ప్లాస్మిడ్ నుండి ఇన్సర్ట్‌ను విస్తరించడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి. PCR ఉత్పత్తి పరిమాణం అగరోజ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా నిర్ధారించబడింది. మెగాస్క్రిప్ట్ T7 ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కిట్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి PCR టెంప్లేట్‌ల నుండి dsRNA లిప్యంతరీకరించబడింది మరియు గతంలో వివరించిన మార్పులతో తయారీదారు సూచనల ప్రకారం శుద్ధి చేయబడింది.
dsRNA ఇంజెక్షన్ కోసం, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ను 10 ng nl-1 గాఢతతో వయోజన మగవారి లేదా ఆడవారి (నానోజెక్ట్ III, డ్రమ్మండ్) ఛాతీలోకి ఎక్లోషన్ తర్వాత 1 రోజులోపు ఇంజెక్ట్ చేశారు. RNA వెలికితీత, cDNA సంశ్లేషణ మరియు RT-qPCR ద్వారా కనీసం మూడు జీవ ప్రతిరూపాలలో జీన్ నాక్‌డౌన్ స్థాయిలు నిర్ణయించబడ్డాయి. ఎక్డిసోన్ ఇంజెక్షన్ కోసం, 4 రోజుల వయసున్న వర్జిన్ లేదా 6 రోజుల వయసున్న వర్జిన్ రక్తం తాగిన ఆడవారికి వరుసగా 1.3, 2.1 గాఢతలతో 0.13, 0.21, లేదా 0.63 µg 20E లేదా 3D20E (నానోజెక్ట్ III, డ్రమ్మండ్) ఇంజెక్ట్ చేశారు, ప్రయోగాత్మక డిజైన్ లేదా 6.3 ng nl-1 ఆధారంగా. 10% లో 100 nl ఇంజెక్ట్ చేయండి. (వాల్యూమ్/వాల్యూమ్) నీటిలో ఇథనాల్; 10% ఇథనాల్‌లో 100 nl 3D20E22P (ఒక జత MAGలలో లభించే మొత్తంలో 75%కి సమానం). దోమలను యాదృచ్ఛికంగా ఇంజెక్షన్ సమూహానికి కేటాయించారు.
గుడ్లు పెట్టే పరీక్షల కోసం, 3 రోజుల వయసున్న ఆడ దోమలకు మానవ రక్తంతో యాడ్ లిబిటమ్ తినిపించబడింది. పాక్షికంగా తినిపించిన లేదా తినిపించని దోమలను తొలగించండి. చికిత్సను బట్టి, రక్త భోజనం తర్వాత కనీసం 48 గంటల పాటు ఆడ దోమలను ప్రత్యేక గుడ్లు పెట్టే కప్పులలో నాలుగు రాత్రులు ఉంచారు. గుడ్లను స్టీరియోస్కోప్ కింద లెక్కించారు (స్టెమి 508, జీస్); జతకట్టిన ఆడ దోమలకు, లార్వాల్లోకి పొదిగిన గుడ్లను సారవంతమైనవిగా పరిగణించారు.
సంభోగ పరీక్షల కోసం, చికిత్సను బట్టి ఆడ జంతువులకు సంభోగానికి నిరోధకతను పెంపొందించుకోవడానికి కనీసం 2 రోజులు అనుమతి ఇవ్వబడింది మరియు అడవి-రకం వయస్సు-సరిపోలిన మగ జంతువులను తరువాత అదే బోనులోకి ప్రవేశపెట్టారు. రెండు రాత్రుల తర్వాత, ఆడ జంతువుల ఫలదీకరణ వెసికిల్స్‌ను విచ్ఛేదనం చేసి, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, మరియు 25 mM NaCl (pH 8.2) కలిగిన బఫర్‌లో ఫ్రీజ్-థా మరియు సోనికేషన్ ద్వారా జెనోమిక్ DNA విడుదల చేయబడింది. నమూనాలను 55 °C వద్ద 15 నిమిషాలు, తరువాత 95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు ప్రోటీనేస్ K (0.86 µg µl-1) తో పొదిగించారు. ముడి జన్యు DNA సన్నాహాలు 10 రెట్లు కరిగించబడ్డాయి మరియు Y క్రోమోజోమ్ సీక్వెన్స్‌ల qPCR గుర్తింపుకు లోబడి ఉన్నాయి; ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా టేబుల్ 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. Y క్రోమోజోమ్ సీక్వెన్స్ లేకపోవడం సంభోగం లేదని సూచిస్తుంది.
పునఃసంయోగ పరీక్షల కోసం, సంభోగ స్థితిని నిర్ధారించడానికి బలవంతంగా సంభోగించిన ఆడ జీవులను సంభోగ ప్లగ్‌ల ఉనికి కోసం పరీక్షించారు మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా మగ జీవులు లేనప్పుడు సంభోగానికి వక్రీభవనతను అభివృద్ధి చేయడానికి 2 రోజులు అనుమతించారు 36. DsRed ట్రాన్స్‌జెనిక్ స్పెర్మ్‌ను మోసే మగ జీవులను ఆడ జీవుల బోనుల్లోకి ప్రవేశపెట్టారు. రెండు రాత్రుల తరువాత, ఆడ జీవుల నుండి ఫలదీకరణ వెసికిల్స్‌ను విడదీశారు మరియు పైన వివరించిన విధంగా జన్యుసంబంధమైన DNA తయారు చేయబడింది మరియు DsRed ట్రాన్స్‌జీన్ యొక్క qPCR గుర్తింపుకు లోబడి ఉంది; ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. DsRed ట్రాన్స్‌జీన్ లేకపోవడం పునఃసంభోగం జరగలేదని సూచించింది.
3D20E గతంలో వివరించిన విధంగా సంశ్లేషణ చేయబడింది 37. క్లుప్తంగా, 10 mg 20E (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను 10 ml నీటిలో కరిగించి, తరువాత 30 mg ప్లాటినం బ్లాక్ (పొడి రూపంలో, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను జోడించారు. ప్రతిచర్య మిశ్రమంలోకి O2 యొక్క సున్నితమైన ప్రవాహం నిరంతరం బుడగ వేయబడింది, ఇది గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద కదిలించబడింది. 6 గంటల తర్వాత, ప్రతిచర్యను ఆపడానికి 30 mL మిథనాల్ జోడించబడింది. ఉత్ప్రేరక కణాలను తొలగించడానికి మిశ్రమాన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద వాక్యూలో సూపర్‌నాటెంట్ పొడిగా మారడానికి ఆవిరైపోయింది. HPLC-MS/MS విశ్లేషణ కోసం ఇంజెక్షన్ కోసం ఎండిన ప్రతిచర్య ఉత్పత్తిని 10% ఇథనాల్ మరియు మిథనాల్‌లో కరిగించారు. మార్పిడి రేటు (20E నుండి 3D20E వరకు) సుమారు 97% (Fig. 4b), మరియు సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E యొక్క MS స్పెక్ట్రం జతకట్టిన ఆడవారిలో కనిపించే దానికి సరిపోలింది (Fig. 4c).
లెజెండ్‌లో నిర్వహించిన గణాంక పరీక్షల యొక్క నిర్దిష్ట వివరాలు ఉన్నాయి. ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, మాంటెల్-కాక్స్ పరీక్ష మరియు విద్యార్థుల టి-పరీక్షలను నిర్వహించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ (వెర్షన్ 9.0) ఉపయోగించబడింది. కోక్రాన్-మాంటెల్-హెన్స్‌జెల్ పరీక్షలు కస్టమ్ R స్క్రిప్ట్‌ను ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి (https://github.com/duopeng/mantelhaen.testలో అందుబాటులో ఉంది). 0.05 ప్రాముఖ్యత థ్రెషోల్డ్‌తో షాపిరో-విల్క్ పరీక్షను ఉపయోగించి డేటా పంపిణీని సాధారణత కోసం పరీక్షించారు. డేటా నార్మాలిటీ పరీక్షలో విఫలమైనప్పుడు, మాన్-విట్నీ పరీక్షను నిర్వహించారు. మాంటెల్-కాక్స్ పరీక్షను ఉపయోగించి సర్వైవల్ డేటాను విశ్లేషించారు. RNA-seq జన్యు-స్థాయి అవకలన వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి DESeq2 ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.28.1) ఉపయోగించబడింది. గ్రాఫ్‌లోని క్షితిజ సమాంతర బార్ మధ్యస్థాన్ని సూచిస్తుంది. అన్ని పరీక్షలకు థ్రెషోల్డ్‌గా P = 0.05 యొక్క ప్రాముఖ్యత విలువ ఉపయోగించబడింది.
అధ్యయన రూపకల్పన గురించి మరింత సమాచారం కోసం, ఈ కథనానికి లింక్ చేయబడిన నేచర్ రీసెర్చ్ రిపోర్ట్ సారాంశాన్ని చూడండి.
MS ప్రోటీమిక్ డేటా PRIDE పార్టనర్ రిపోజిటరీ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ద్వారా PXD032157 డేటాసెట్ ఐడెంటిఫైయర్‌తో ప్రోటీమ్ ఎక్స్‌ఛేంజ్ కన్సార్టియం (http://proteomecentral.proteomexchange.org)లో జమ చేయబడింది.
RNA-seq డేటాసెట్ GSE198665 సీరియల్ రికార్డ్ కింద జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ కాంప్రహెన్సివ్ లైబ్రరీ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)లో నిక్షిప్తం చేయబడింది.
ప్రస్తుత అధ్యయనంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన మరియు/లేదా విశ్లేషించబడిన అదనపు డేటాసెట్‌లను సంబంధిత రచయితల నుండి సహేతుకమైన అభ్యర్థనపై పొందవచ్చు. ఈ వ్యాసం మూల డేటాను అందిస్తుంది.
డి లూఫ్, ఎ. ఎక్డిస్టెరాయిడ్స్: నిర్లక్ష్యం చేయబడిన కీటకాల సెక్స్ స్టెరాయిడ్స్? పురుషుడు: బ్లాక్ బాక్స్. కీటకాల శాస్త్రం.13, 325–338 (2006).
రెడ్‌ఫెర్న్, CPF 20-హైడ్రాక్సీఎక్డిసోన్ మరియు అండాశయ అభివృద్ధి అనాఫిలిస్ స్టీఫెన్స్.J. ఇన్సెక్ట్ ఫిజియాలజీ.28, 97–109 (1982).