Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSSకు పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ప్రదర్శిస్తాము.
వెన్నెముక గల జీవుల వలె కాకుండా, కీటకాలలో మగ-ఆధారిత లైంగిక స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లు ఉండవని విస్తృతంగా భావిస్తారు. అనోఫెలెస్ గాంబియేలో, ఎక్డైసోన్ స్టెరాయిడ్ 20-హైడ్రాక్సీఎక్డైసోన్ (20E), ఆడ దోమలచే సంశ్లేషణ చేయబడినప్పుడు అండాల అభివృద్ధిని నియంత్రించడానికి2 మరియు మగ దోమల ద్వారా లైంగికంగా బదిలీ చేయబడినప్పుడు సంభోగ నిరోధక కాలాన్ని ప్రేరేపించడానికి3 పరిణామం చెందినట్లు కనిపిస్తుంది. అండాల అభివృద్ధి మరియు సంభోగం అనేవి ముఖ్యమైన పునరుత్పత్తి లక్షణాలు కాబట్టి, ఆడ అనోఫెలెస్ దోమలు ఈ హార్మోన్ల సంకేతాలను ఎలా సమన్వయం చేసుకుంటాయో అర్థం చేసుకోవడం, కొత్త మలేరియా నియంత్రణ కార్యక్రమాల రూపకల్పనకు దోహదపడుతుంది. ఇక్కడ, ఈ పునరుత్పత్తి విధులు, ఎక్డైస్టెరాయిడ్‌లను ఉత్తేజపరిచే/నిష్క్రియం చేసే ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్టమైన నెట్‌వర్క్ ద్వారా, విభిన్న లైంగిక స్టెరాయిడ్లచే నియంత్రించబడతాయని మేము వెల్లడిస్తున్నాము. మేము మగ-నిర్దిష్ట ఆక్సీకరణ చెందిన ఎక్డైసోన్, 3-డీహైడ్రో-20E (3D20E)ను గుర్తించాము. ఇది లైంగిక బదిలీ మరియు డీఫాస్ఫోరైలేషన్ ద్వారా ఉత్తేజం పొందిన తర్వాత, ఆడ దోమ యొక్క లైంగిక స్వీకరణను నిలిపివేయడం ద్వారా సంతాన సామర్థ్యాన్ని కాపాడుతుంది. ముఖ్యంగా, 3D20E బదిలీ, అండాల అభివృద్ధిని కొనసాగించే పునరుత్పత్తి జన్యువుల వ్యక్తీకరణను కూడా ప్రేరేపించింది. ప్లాస్మోడియం సంక్రమణ, సోకిన ఆడ దోమల ఆరోగ్యాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. ఆడ దోమల నుండి లభించే 20E లైంగిక ప్రతిస్పందనను ప్రేరేపించదు, కానీ 20E-నిరోధక కైనేజ్‌లు నిరోధించబడిన తర్వాత సంభోగంలో పాల్గొన్న జీవులు గుడ్లు పెట్టడానికి అనుమతిస్తుంది. మగ దోమలకు మాత్రమే ప్రత్యేకమైన ఈ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్‌ను గుర్తించడం మరియు ఆడ దోమల లైంగిక స్వీకరణశక్తి, సంతానోత్పత్తి మరియు ప్లాస్మోడియంతో పరస్పర చర్యను నియంత్రించడంలో దాని పాత్ర, మలేరియాను వ్యాపింపజేసే దోమల పునరుత్పత్తి విజయాన్ని తగ్గించే సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది.
మానవ మలేరియా పరాన్నజీవులకు ఏకైక వాహకమైన అనోఫెలెస్ దోమలలో విస్తృతంగా పురుగుమందుల నిరోధకత పెరగడం వల్ల మలేరియా కేసులు మరియు మరణాలు మళ్లీ పెరుగుతున్నాయి. ఈ దోమల సంభోగ జీవశాస్త్రం నూతన మలేరియా నియంత్రణ చర్యలకు ఒక ప్రత్యేకమైన ఆకర్షణీయమైన లక్ష్యం, ఎందుకంటే ఆడ దోమలు ఒక్కసారి మాత్రమే సంభోగిస్తాయి; ఈ ఒక్క సంభోగాన్ని వంధ్యం చేయడం ద్వారా క్షేత్రస్థాయిలో దోమల జనాభాను తగ్గించడానికి గొప్ప అవకాశం ఉంటుంది.
పురుషుల నుండి అధిక మోతాదులో స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లను స్వీకరించిన తర్వాత స్త్రీలు లైంగికంగా బలహీనపడతారు. తదుపరి సంభోగంలో ఇబ్బందికి ప్రేరకం 20-హైడ్రాక్సీఎక్డైసోన్ (20E) అని అధ్యయనాలు వెల్లడించాయి. ఇది లార్వా దశలో నిర్మోచన చక్రాన్ని నియంత్రించే ఒక స్టెరాయిడ్ హార్మోన్‌గా ప్రసిద్ధి చెందింది. 20Eను సంశ్లేషణ చేసి, బదిలీ చేసే మగ దోమల సామర్థ్యం, ​​ప్రత్యేకంగా ఆఫ్రికాలో విస్తరించి ఉన్న మరియు అనోఫెలెస్ గాంబియేతో సహా మలేరియా యొక్క అత్యంత ప్రమాదకరమైన వాహకాలను కలిగి ఉన్న సెల్లియా7 ఉపజాతికి చెందిన అనోఫెలెస్ జాతులలో పరిణామం చెందింది. ఇది ప్రత్యేకంగా గమనించదగిన విషయం, ఎందుకంటే ఈ జాతులలో ఆడ దోమలు కూడా ప్రతి రక్త భోజనం తర్వాత 20Eను ఉత్పత్తి చేస్తాయి, మరియు 20E అండజనన చక్రాన్ని నడిపిస్తుంది (రిఫరెన్స్ 8 చూడండి). అయితే, ఆడ దోమలు తమ సంభోగ సామర్థ్యానికి భంగం కలగకుండా, ఎక్డైసోన్ యొక్క రెండు విభిన్న వనరుల (మగ దోమ బదిలీ మరియు రక్త భోజన ప్రేరణ) నుండి వచ్చే సంకేతాలను ఏ విధంగా సమన్వయం చేసుకుంటాయనే దాని గురించి పెద్దగా తెలియదు. వాస్తవానికి, ఆడ దోమలు ఉత్పత్తి చేసే 20E లైంగిక అసహనాన్ని ప్రేరేపిస్తే, అది వంధ్యత్వానికి దారితీస్తుంది. తొలిదశలోనే ఆహారం తీసుకునే జీవులు, ఈ దోమలలో ఇది చాలా సాధారణ ప్రవర్తన5.
దీనికి ఒక సంభావ్య వివరణ ఏమిటంటే, A. gambiae మగ జీవులు మార్పు చెందిన మగ-నిర్దిష్ట ఎక్డైసోన్‌ను బదిలీ చేస్తాయి, ఇది ఆడ జీవి యొక్క పునరుత్పత్తి మార్గంలో ఒక సంకేత శ్రేణిని క్రియాశీలం చేస్తుంది, ఫలితంగా సంభోగ అస్థిరత ఏర్పడుతుంది. అయితే, సకశేరుకాలలో ఈస్ట్రోజెన్ మరియు ఆండ్రోజెన్ వంటి బహుళ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లు ఉన్నప్పటికీ (రిఫరెన్స్ 9లో సమీక్షించబడింది), మాకు తెలిసినంతవరకు, కీటకాలలో ఆండ్రోజెనిక్-బయాస్డ్ స్టెరాయిడ్లు గుర్తించబడలేదు.
లైంగిక పరిపక్వత చెందిన A. gambiae యొక్క మగ అనుబంధ గ్రంథి (MAG)లో ఉండే స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ల సముదాయాన్ని, మరియు బహుశా మార్పుచేసే స్టెరాయిడ్లను కనుగొనడానికి మేము పరిశోధన ప్రారంభించాము. గతంలో ఉపయోగించిన తక్కువ నిర్దిష్ట పద్ధతికి బదులుగా, టాండెమ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కూడిన హై పర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC-MS/MS)ని ఉపయోగించి, మేము ఈ కణజాలంలో ఎక్డైసోన్ (E) మరియు 20Eలను గుర్తించాము, ఇది మునుపటి ఫలితాన్ని ధృవీకరించింది. అయితే, ఈ నమూనాలో ఆక్సీకరణ చెందిన ఫాస్ఫొరైలేటెడ్ స్టెరాయిడ్లు అధికంగా ఉన్నాయి, ఇది 3-డీహైడ్రో-20E-22-ఫాస్ఫేట్ (3D20E22P)12 (పటం 1) అనే ఫార్ములాకు అనుగుణంగా ఉంది. ఇతర రూపాలలో 3-డీహైడ్రో-20E (3D20E) మరియు 20E-22-ఫాస్ఫేట్ (20E22P) ఉన్నాయి. 3D20E22P యొక్క HPLC-MS/MS సిగ్నల్ తీవ్రత, దాని డీఫాస్ఫొరైలేటెడ్ రూపమైన 3D20E కంటే రెండు రెట్లు అధికంగా మరియు E కంటే మూడు రెట్లు అధికంగా ఉంది. 20E (పటం 1). శరీరంలోని ఇతర భాగాలలో మరియు దిగువ ప్రత్యుత్పత్తి మార్గంలో (LRT; విస్తరించిన డేటా పటం 1a) ఉన్నప్పటికీ, మేము కొత్తగా మూసుకుపోయిన (<1 రోజు వయస్సు) మగ మరియు ఆడ జీవులలో ఎక్డైస్టెరాయిడ్‌లను కూడా విశ్లేషించాము మరియు 3D20E మరియు 3D20E22P లను MAG లో మాత్రమే గుర్తించాము; E, 20E మరియు 20E22P లు రెండు లింగాలలోనూ ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా పటం 1b). ఈ డేటా ప్రకారం, A. gambiae వయోజన మగ జీవులు తమ MAG లలో అధిక మోతాదులో మార్పుచేసే హార్మోన్లను ఉత్పత్తి చేస్తాయని, ఇవి ఆడ జీవులచే సంశ్లేషణ చేయబడవని సూచిస్తున్నాయి.
4 రోజుల వయస్సు గల (4-రోజుల వయస్సు) కన్య మగ జీవులు మరియు కన్య మరియు సంభోగం చేసిన ఆడ జీవుల (0.5, 3, మరియు 12 hpm) నుండి MAG మరియు ఆడ LRT (కర్ణికలు, శుక్రకోశాలు, మరియు పరోవేరియంతో సహా) వేరుచేయబడ్డాయి. ఈ కణజాలాలలో ఎక్డైసోన్‌ను HPLC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషించారు (సగటు ± సెమ్; జతకాని t-పరీక్ష, రెండు-వైపుల, తప్పుడు ఆవిష్కరణ రేటు (FDR) సరిచేయబడింది; NS, గణనీయమైనది కాదు; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.035; 12 గంటలు vs. 3 గంటలు, P = 0.0015; 12 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.030. 3D20E22P: 3 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.25; 12 గంటలు vs. 3 గంటలు, P = 0.0032; 12 గంటలు vs. 0.5 గంటలు, P = 0.015). డేటా మూడు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌ల నుండి తీసుకోబడింది. ఆసక్తి ఉన్న ప్రతి ఎక్డైసోన్ యొక్క పీక్ ఏరియాను లెక్కించి, దోమల సంఖ్య ద్వారా సాధారణీకరించబడింది. ఎక్డైసోన్‌ను ఈ క్రింది విధంగా రంగు ద్వారా సూచించారు: E, ఆకుపచ్చ; 20E, నారింజ; 20E22P, ఊదా; 3D20E, నీలం; 3D20E22P, గులాబీ. తక్కువ ఎక్డైసోన్ స్థాయిలను చూపించడానికి ఇన్సెట్ y-అక్షంపై స్కేల్‌ను పెంచుతుంది.
సంభోగం సమయంలో 3D20E22P మరియు 3D20E బదిలీ అవుతాయో లేదో పరిశోధించడానికి, మేము సంభోగం తర్వాత వివిధ సమయాల్లో ఆడ ఈగల LRTలను విడదీసి పరిశీలించాము. కన్యలలో ఎక్డైసోన్ కనుగొనబడనప్పటికీ, సంభోగం జరిగిన వెంటనే (సంభోగం తర్వాత 0.5 గంటలు, hpm) LRTలో గణనీయమైన మొత్తంలో 3D20E22Pని మేము గమనించాము, ఇది కాలక్రమేణా తగ్గుతూ ఉండగా, 3D20E స్థాయిలు గణనీయంగా పెరిగాయి (పటం 1). రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20Eని ప్రామాణికంగా ఉపయోగించి, సంభోగ LRTలలో ఈ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ స్థాయిలు 20E కంటే కనీసం 100 రెట్లు ఎక్కువగా ఉన్నాయని మేము నిర్ధారించాము (విస్తరించిన డేటా పట్టిక 1). అందువల్ల, 3D20E22P అనేది సంభోగం సమయంలో ఆడ ఈగల LRTకి బదిలీ చేయబడే ప్రధాన మగ ఎక్డైసోన్, మరియు దాని డీఫాస్ఫొరైలేటెడ్ రూపమైన 3D20E, సంభోగం జరిగిన కొద్దిసేపటికే అధిక పరిమాణంలోకి వస్తుంది. ఇది సంభోగం తర్వాత ఆడ ఈగల జీవశాస్త్రంలో ఈ రెండవ ఎక్డైసోన్‌కు ఒక ముఖ్యమైన పాత్ర ఉందని సూచిస్తుంది.
కస్టమ్-బిల్ట్ బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ పైప్‌లైన్‌ను ఉపయోగించి, కొత్త RNA సీక్వెన్సింగ్ (RNA-seq) డేటాసెట్‌ను (Fig. 2a) రూపొందించిన తర్వాత, మేము ఎక్డైసోన్ కైనేస్ (EcK), ఎక్డైసోన్ ఆక్సిడేస్ (EO), మరియు ఎక్డైసోన్‌ను ఎన్‌కోడ్ చేసే 20E-మాడిఫైడ్ ఫాస్ఫటేస్ జన్యువు కోసం శోధించాము. EPP పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో వ్యక్తమవుతుంది. మేము ఒక అభ్యర్థి EPP జన్యువును మరియు రెండు సంభావ్య EcK జన్యువులను (EcK1 మరియు EcK2) గుర్తించాము, కానీ ఒక మంచి అభ్యర్థి EO జన్యువును కనుగొనలేకపోయాము. ముఖ్యంగా, గాంబియన్ MAGలలో వ్యక్తిగత EPP జన్యువులు అధిక స్థాయిలో (98.9వ పర్సంటైల్) వ్యక్తమయ్యాయి, కానీ ఆడ LRTలలో (Fig. 2b) వ్యక్తమవ్వలేదు. ఈ ఆడ కణజాలంలో 3D20E22P యొక్క డీఫాస్ఫొరైలేషన్ జరిగినప్పటికీ, ఇది మా అంచనాలకు విరుద్ధంగా ఉంది. అందువల్ల, సంభోగం సమయంలో మగ EPP బదిలీ చేయబడవచ్చని మేము నమ్ముతున్నాము. నిజానికి, సంభోగం తర్వాత ఆడ ప్రోటీన్‌ను మాస్క్ చేయడానికి మేము ఇన్ వివో స్టేబుల్ ఐసోటోప్ లేబులింగ్‌ను ఉపయోగించాము, ఇది ఆడ ఏట్రియంలో MS ద్వారా గుర్తించబడిన ఒక ఎంజైమ్ (Fig. 2c మరియు అనుబంధ పట్టిక 1). నిర్దిష్ట యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి MAG మరియు సంభోగం చేసిన (కానీ కన్య కాని) ఆడ LRT లలో EPP ఉనికిని కూడా నిర్ధారించారు (Fig. 2d).
a, ప్రతి లింగం యొక్క పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో EcKలు, EOలు మరియు EPPలను ఎన్‌కోడ్ చేసే జన్యువుల కోసం శోధించడానికి ప్రత్యేకంగా నిర్మించిన బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ పైప్‌లైన్. బాణాల పక్కన ఉన్న సంఖ్యలు ప్రతి దశలో మగ మరియు ఆడ అభ్యర్థుల సంఖ్యను సూచిస్తాయి. ఈ విశ్లేషణ మగవారిలో వ్యక్తమయ్యే ఒక EPP జన్యువును (EPP) మరియు ఒక EcK జన్యువును (EcK1), మరియు రెండు లింగాలలోనూ వ్యక్తమయ్యే కానీ అభ్యర్థి EO జన్యువును ఇవ్వని ఒక EcK జన్యువును (EcK2) గుర్తించింది. b, అనోఫెలెస్ గాంబియే మరియు అనోఫెలెస్ ఆల్బికాన్స్ యొక్క కన్య (V) మరియు సంభోగ (M) కణజాలాలలో అభ్యర్థి జన్యు వ్యక్తీకరణను పోల్చే హీట్‌మ్యాప్. Spca, ఫలదీకరణం; MAGs, మగవారిలో అనుబంధ గ్రంథులు; శరీరంలోని ఇతర భాగాలు, అనగా రెండు లింగాలలో రొమ్ములు, రెక్కలు, కాళ్లు, కొవ్వు కణజాలాలు మరియు అంతర్గత అవయవాలు, మరియు ఆడవాటిలో అండాశయాలు. గాంబియా యొక్క MAG మరియు ఏట్రియా రెండింటిలోనూ EcK2 అధికంగా వ్యక్తమవుతుంది, అయితే EPP కేవలం MAGలో మాత్రమే కనిపిస్తుంది.c, 3, 12 మరియు 24 hpm వద్ద ఆడ ఏట్రియాలోకి మగ స్ఖలనం సమూహం యొక్క స్థానభ్రంశం యొక్క ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ, అత్యంత సమృద్ధిగా ఉండే 67 ప్రోటీన్‌లను చూపుతుంది. అన్ని ప్రోటీన్‌లను లేబుల్ చేయడానికి (మరియు మాస్క్ చేయడానికి) ఆడవాటిని 15N కలిగిన ఆహారంపై పెంచారు. ట్యాగ్ చేయని మగవాటిని ట్యాగ్ చేసిన ఆడవాటితో జతకట్టించారు, మరియు ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ కోసం 3, 12 మరియు 24 hpm వద్ద ఆడ LRTలను విడదీశారు (స్ఖలన ప్రోటీన్‌ల పూర్తి జాబితా కోసం అనుబంధ పట్టిక 1 చూడండి). ఇన్సెట్, ఈ కణజాలాల ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ ద్వారా కన్య మగవాటి MAGలో EPP, Eck1 మరియు EcK2 కనుగొనబడ్డాయి.d, జతకట్టిన ఆడవాటి MAG మరియు LRTలో వెస్టర్న్ బ్లాట్ ద్వారా EPP కనుగొనబడింది, కానీ కన్యలో కాదు. ఆడవారు లేదా మగవారు లేదా ఆడవారి శరీరంలోని మిగిలిన భాగం. మెంబ్రేన్‌లను ఏకకాలంలో యాంటీ-యాక్టిన్ (లోడింగ్ కంట్రోల్) మరియు యాంటీ-EPP యాంటీబాడీలతో ప్రోబ్ చేశారు. మగవారందరూ కన్యలు. జెల్ సోర్స్ డేటా కోసం అనుబంధ చిత్రం 1 చూడండి. వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌లను రెండుసార్లు నిర్వహించారు మరియు అవే ఫలితాలు వచ్చాయి.
MAG నుండి వేరుచేయబడిన 3D20E22P తో ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత HPLC-MS/MS ద్వారా EPP యొక్క ఎక్డైస్టెరాయిడ్ ఫాస్ఫోఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణ ధృవీకరించబడింది (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 2a). ఇంకా, మేము RNA-మధ్యవర్తిత్వ జోక్యం (RNAi) ద్వారా EPPని నిశ్శబ్దం చేసినప్పుడు, ఈ మగ దోమల పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో ఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణలో బలమైన తగ్గుదలని మేము గుర్తించాము (చిత్రం 3a), మరియు పాక్షిక జన్యు నిశ్శబ్దం ఉన్నప్పటికీ (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 2b,c), EPP-నిశ్శబ్దం చేయబడిన మగ దోమలతో జతకట్టిన ఆడ దోమలలో డీఫాస్ఫొరైలేటెడ్ 3D20E నిష్పత్తి గణనీయంగా తక్కువగా ఉంది (చిత్రం 3b). దీనికి విరుద్ధంగా, అదే దోమలలో 20E22P/20E నిష్పత్తిలో మేము గణనీయమైన మార్పులను గుర్తించలేదు, ఇది ఆ ఎంజైమ్ 3D20E22P కి ప్రత్యేకమైనదని సూచించవచ్చు (చిత్రం 3b).
a, డబుల్-స్ట్రాండెడ్ EPP RNA (dsEPP) లేదా డబుల్-స్ట్రాండెడ్ GFP RNA (dsGFP) నియంత్రణలను ఉపయోగించి EPP సైలెన్సింగ్ చేయడం వల్ల MAGలో ఫాస్ఫటేస్ చర్య తగ్గింది. ప్రతి రెప్లికేట్‌లో ఇరవై MAG పూల్స్ ఉపయోగించబడ్డాయి (P = 0.0046, పెయిర్డ్ t-టెస్ట్, టూ-సైడెడ్), వీటిని వేర్వేరు చుక్కలతో సూచించారు. b, EPP-సైలెన్స్ చేయబడిన మగవాటితో జతకట్టిన ఆడవాటిలో 3 hpm వద్ద డీఫాస్ఫొరైలేటెడ్ 3D20E నిష్పత్తి గణనీయంగా తక్కువగా ఉంది (P = 0.0043, అన్‌పెయిర్డ్ t-టెస్ట్, టూ-సైడెడ్), అయితే 20E స్థాయిలు ప్రభావితం కాలేదు (P = 0.063, అన్‌పెయిర్డ్). t-పరీక్ష, రెండు-వైపుల). డేటాను 13, 16 మరియు 19 ఆడ జీవులు ఉన్న మూడు సమూహాల నుండి సగటు ± sem గా అందించారు.c, EPP-నిశ్శబ్దం చేయబడిన మగ జీవులతో జతకట్టిన ఆడ జీవులు తిరిగి జతకట్టే రేటును గణనీయంగా ఎక్కువగా కలిగి ఉన్నాయి (P = 0.0002, ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల).ఆడ జీవుల జతకట్టే స్థితిని నిర్ధారించుకోవడానికి వాటిని మొదట జతకట్టేలా బలవంతం చేశారు; రెండు రోజుల తరువాత, ట్రాన్స్‌జీన్‌ను క్వాంటిటేటివ్ PCR ద్వారా గుర్తించి, పునఃసంయోగ రేట్లను అంచనా వేయడానికి, జన్యుమార్పిడి వీర్యాన్ని కలిగి ఉన్న ఇతర మగ దోమలతో వాటిని సంపర్కంలోకి తీసుకువచ్చారు. EPP-నిశ్శబ్దం చేయబడిన మగ దోమలతో సంభోగించిన, రక్తం తాగిన ఆడ దోమలలో సంతానోత్పత్తి గణనీయంగా తగ్గింది (P < 0.0001; మాన్-విట్నీ పరీక్ష, రెండువైపుల) మరియు గుడ్ల సంఖ్య కొద్దిగా తగ్గింది (P = 0.088, మాన్-విట్నీ పరీక్ష, రెండువైపుల), అయితే గుడ్లు పెట్టే రేటు ప్రభావితం కాలేదు (P = 0.94, ఫిషర్ ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండువైపుల). అన్ని ప్యానెళ్లలో, n అనేది జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమల నమూనాల సంఖ్యను సూచిస్తుంది. NS, గణనీయమైనది కాదు. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
తరువాత, ఆడ జీవులలో సంభోగ నిరోధకతను ప్రేరేపించడంలో ఎక్డైసోన్ డీఫాస్ఫోరైలేషన్ ముఖ్యమైనదా కాదా అని మేము అంచనా వేశాము. ముఖ్యంగా, EPP-క్షీణించిన మగ జీవులతో సంభోగించిన ఆడ జీవులు, అదనపు (ట్రాన్స్‌జెనిక్) మగ జీవులకు గురైనప్పుడు, నియంత్రణ సమూహంలోని ఆడ జీవుల (10.4%) కంటే చాలా ఎక్కువ పౌనఃపున్యంతో (44.9%) తిరిగి సంభోగించాయి (పటం 3సి). మేము సంతానోత్పత్తిలో గణనీయమైన తగ్గుదల (పటం 3డి, ఎడమ) మరియు ఈ ఆడ జీవులు పెట్టిన గుడ్ల సంఖ్యలో స్వల్ప తగ్గుదల (పటం 3డి, మధ్య) కూడా గమనించాము, అయితే ఆడ జీవులు పెట్టిన గుడ్ల శాతం (సంభోగం ద్వారా ఆడ జీవులలో ప్రేరేపించబడిన మరొక ప్రతిస్పందన) ప్రభావితం కాలేదు (పటం 3డి, కుడి). 3D20E22P పట్ల EPP యొక్క గమనించిన నిర్దిష్టతను బట్టి, ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నదేమిటంటే, సంభోగం సమయంలో బదిలీ చేయబడిన EPP ద్వారా 3D20E యొక్క క్రియాశీలత, తదుపరి సంభోగానికి ఆడ జీవుల స్వీకరణశక్తిని ఆపివేయడంలో ఒక ముఖ్యమైన పాత్ర పోషించవచ్చు, ఈ ప్రవర్తన గతంలో 20E యొక్క లైంగిక బదిలీకి ఆపాదించబడింది. అందువల్ల, ఈ మగ-నిర్దిష్ట హార్మోన్ స్త్రీల సంతానోత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని కూడా బలంగా ప్రభావితం చేస్తుంది.
తరువాత, రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E (పటం 4a–c) మరియు వాణిజ్యపరంగా లభించే 20E లను ఉపయోగించి, లైంగికంగా పరిపక్వత చెందిన కన్యలలో ఇంజెక్షన్ ప్రయోగాలలో 20E మరియు 3D20E ల కార్యకలాపాలను మేము పోల్చాము. రెండు గాఢతలలోనూ సంభోగం పట్ల ఆడవారి సున్నితత్వాన్ని ఆపివేయడంలో 20E కంటే 3D20E గణనీయంగా ఎక్కువ ప్రభావవంతంగా ఉందని మేము గమనించాము (పటం 4d). ముఖ్యంగా, LRT లో 3D20E యొక్క సగం శారీరక స్థాయి (ఇంజెక్షన్ తర్వాత 1,066 pg vs. సంభోగం తర్వాత 2,022 pg) ప్రేరేపించిన మొండి ఆడవారి నిష్పత్తి, అత్యధిక గాఢత అయిన సంభోగం తర్వాత 18 pg వద్ద ఇంజెక్షన్ చేసిన 24 గంటల తర్వాత, 20E యొక్క శారీరక స్థాయి (ఇంజెక్షన్ తర్వాత 361 pg) కంటే 20 రెట్లు ఎక్కువగా ఉంది; విస్తరించిన డేటా పట్టిక 1). 20E యొక్క లైంగిక బదిలీ సంభోగ నిరోధక కాలాలకు కారణం కాదనే భావనకు ఈ ఫలితం అనుగుణంగా ఉంది, మరియు తల్లి-బిడ్డ సంబంధాన్ని నిర్ధారించడంలో 3D20E ఒక ప్రధాన కారకంగా ఉందని మరింతగా సూచిస్తుంది. కన్య ఆడ ఈగలలో గుడ్లు పెట్టే పరీక్షలలో 20E కంటే 3D20E గణనీయంగా ఎక్కువ చురుకుగా ఉంది (పటం 4e), పాక్షిక EPP నిశ్శబ్దం తర్వాత మనం గమనించిన సాధారణ గుడ్లు పెట్టే రేటు, సంభోగం-ప్రేరిత ఆడ కారకాల ద్వారా ఇప్పటికీ ఉత్పత్తి అవుతున్న అవశేష 3D20E క్రియాశీలత ఉండటం వల్లే అని ఇది సూచిస్తుంది.
(ఎ,బి) 20E నుండి రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E (ఎ) చాలా అధిక మార్పిడి/సామర్థ్యంతో (మూడు స్వతంత్ర సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యల నుండి సగటు ± sem గా అందించబడిన డేటా) (బి).సి, మాస్ స్పెక్ట్రమ్ (దిగువ భాగం) సంభోగం చేసిన ఆడ LRT (పై భాగం)లో కనిపించే ఎక్డైసోన్‌తో ఖచ్చితంగా సరిపోలుతుంది.డి, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల) మరియు 10% ఇథనాల్ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, 2-వైపుల)తో పోల్చినప్పుడు, 20E అధిక మోతాదులలో మాత్రమే నియంత్రణ కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంది (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, 2-వైపుల).అంటే, 10% ఇథనాల్ నియంత్రణలతో పోలిస్తే 3D20E ఇంజెక్షన్ కన్య ఆడ దోమలలో గణనీయంగా అధిక గుడ్లు పెట్టే రేట్లను ప్రేరేపించింది (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల), అయితే 20E నియంత్రణలతో పోలిస్తే అధిక మోతాదులలో మాత్రమే (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల).అధిక మోతాదులలో 20E కంటే 3D20E గణనీయంగా అధిక గుడ్లు పెట్టే రేట్లను ప్రేరేపించింది (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, రెండు-వైపుల).అన్ని ప్యానెళ్లలో, n అనేది జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమల సంఖ్యను సూచిస్తుంది. నమూనాలు.NS, గణనీయమైనది కాదు.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.డేటా మూడు పునరావృతాల నుండి తీసుకోబడింది.
గత అధ్యయనాలలో, స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ల లైంగిక బదిలీ, అత్యంత ప్రాణాంతకమైన మానవ మలేరియా పరాన్నజీవి అయిన P. falciparum సంక్రమణ (13) నుండి A. gambiae ఆడ దోమలను రక్షించే MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) అనే ఆడ పునరుత్పత్తి జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుందని మేము నిర్ధారించాము. మలేరియా ప్రబలంగా ఉన్న ప్రాంతాలలో అనోఫెలెస్ దోమల పునరుత్పత్తి సామర్థ్యానికి MISO యొక్క ప్రాముఖ్యతను దృష్టిలో ఉంచుకుని, 3D20E లేదా 20E లలో ఏ హార్మోన్ ఈ జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుందో నిర్ధారించాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము. 20E ఇంజెక్షన్, HR3 మరియు HR4 వంటి కొన్ని న్యూక్లియర్ హార్మోన్ రిసెప్టర్లను (HR), మరియు Vg14, 15, 16 వంటి పచ్చసొనను ఉత్పత్తి చేసే సాధారణ స్టెరాయిడ్ లక్ష్యాలను ప్రత్యేకంగా లేదా మరింత శక్తివంతంగా ప్రేరేపించగా, MISO మాత్రం 3D20E ద్వారా మరింత బలంగా ప్రేరేపించబడిందని మేము కనుగొన్నాము (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 3). అందువల్ల, ఈ ఆండ్రోజెనిక్ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ యొక్క లైంగిక బదిలీ, పరాన్నజీవుల వలన కలిగే నష్టాల నుండి ఆడ దోమలను రక్షించే యంత్రాంగాలను ప్రేరేపిస్తున్నట్లు కనిపిస్తుంది. సంక్రమణ. అంతేకాకుండా, 3D20E అనేది E గ్రాహకం EcR యొక్క రెండు ఐసోఫార్మ్‌లను విభిన్నంగా ప్రభావితం చేస్తుంది, EcR-Aను ప్రేరేపిస్తుంది మరియు EcR-Bను అణచివేస్తుంది, ఇంకా HPX15తో సహా ఇతర సంభోగ-ప్రేరక జన్యువులను మరింత బలంగా ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది ఆడవారి సంతానోత్పత్తిని ప్రభావితం చేస్తుంది. EPP-నిశ్శబ్దం చేయబడిన మగవారితో సంభోగించిన ఆడవారిలో గమనించిన గణనీయమైన వంధ్యత్వానికి ఇది వివరణ ఇవ్వగలదు (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 3). ఈ డేటా రెండు ఎక్డైసోన్ హార్మోన్ల ద్వారా ప్రాధాన్యతగా సక్రియం చేయబడిన డౌన్‌స్ట్రీమ్ మార్గాల ఉనికిని సూచిస్తుంది, ఇవి లింగ-నిర్దిష్ట పనితీరుకు ఆధారం కావచ్చు.
తరువాత, మా బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ పైప్‌లైన్‌లో గుర్తించిన రెండు EcK జన్యువుల పనితీరును మేము పరీక్షించాము. EcK1 లేదా EcK2 ను నిశ్శబ్దం చేయడం మగవాటిలో గణనీయమైన మరణానికి దారితీసింది (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 4a), ఇది మనుగడకు ఎక్డైసోన్ ఫాస్ఫోరైలేషన్, మరియు తద్వారా నిష్క్రియం కావడం ముఖ్యమని సూచిస్తుంది. EcK1 కంటే EcK2 అధిక స్థాయిలో వ్యక్తమైనందున మరియు ప్రోటీయోమిక్స్ ద్వారా MAG లలో గుర్తించబడినందున (చిత్రం 2b,c మరియు అనుబంధ పట్టిక 2), మేము దానిని 20E తో ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా దాని ఎక్డైస్టెరాయిడ్ కైనేస్ కార్యాచరణను ధృవీకరించాము, దీని ఫలితంగా 20E22P ఫాస్ఫోరైలేషన్ జరిగింది (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 2b). 3D20E ను సబ్‌స్ట్రేట్‌గా ఉపయోగించినప్పుడు, మేము ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ ఉత్పత్తి 3D20E22P ను గుర్తించలేకపోయాము (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 4c), ఇది 3D20E కంటే 20E EcK2 యొక్క ప్రాధాన్య లక్ష్యం కావచ్చునని సూచిస్తుంది.
మా RNA-seq విశ్లేషణ ప్రకారం, కన్య ఆడ జీవుల LRTలో కూడా EcK2 అధికంగా వ్యక్తమైంది, ఇది సంభోగం తర్వాత ఆగిపోయింది (పటం 2b). మేము ఈ డేటాను ధృవీకరించాము మరియు రక్త పానము వలన EcK2 వ్యక్తీకరణ ప్రభావితం కాలేదని నిర్ధారించాము (విస్తరించిన డేటా పటం 5a). మా ప్రారంభ MS ప్రయోగాలను విస్తరిస్తూ, 20E22P యొక్క గరిష్ఠ స్థాయి, 20E యొక్క గరిష్ఠ స్థాయికి దగ్గరగా సంబంధం కలిగి ఉందని మేము నిర్ధారించాము (రక్త పానము తర్వాత 22-26 గంటలు; విస్తరించిన డేటా పటం 5b). కన్య ఆడ జీవులలో EcK2ను నిశ్శబ్దం చేయడం వలన, రక్త పానము తర్వాత 26 గంటలకు 20E మరియు 20E22Pల సాపేక్ష నిష్పత్తిలో 3 రెట్లు పెరుగుదల కనిపించింది (విస్తరించిన డేటా పటాలు 2c మరియు 5c), ఇది ఆడ జీవులలో EcK2 కూడా 20Eను ఫాస్ఫోరైలేట్ చేస్తుందని ధృవీకరించింది. ముఖ్యంగా, EcK2-రహిత కన్యలు పూర్తి లైంగిక స్వీకరణ సామర్థ్యాన్ని కొనసాగించాయి (విస్తరించిన డేటా పటం 5d,e), ఇది ఆడ జీవులలో 20E ఉత్పత్తి కేవలం ఫాస్ఫోరైలేషన్ మాత్రమే కాదని మరింతగా సూచిస్తుంది. సంభోగ నిరోధక కాలాలను ప్రేరేపించడం. అయితే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే ఈ ఆడ జీవులలో గుడ్లు పెట్టే రేటు గణనీయంగా పెరిగింది, 30% కంటే ఎక్కువ కన్యలు గుడ్లు పెట్టాయి (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 5f). రక్త పానం తర్వాత డబుల్-స్ట్రాండెడ్ Eck2 RNA (dsEcK2) ఇంజెక్షన్లు చేసినట్లయితే, గుడ్లు పెట్టడం జరగలేదు, ఆ సమయానికి రక్త పానం వల్ల ఏర్పడిన 20E శిఖరం తగ్గిపోయింది. మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు ఒక నమూనాకు మద్దతు ఇస్తున్నాయి, అదేమిటంటే రక్త పానం తర్వాత ఉత్పత్తి అయ్యే 20E గుడ్లు పెట్టడాన్ని ప్రేరేపించగలదు, కానీ అది కేవలం సంభోగం ద్వారా గుడ్లు పెట్టడాన్ని నిరోధించే అంశం (EcK2 మరియు బహుశా ఇతర కారకాలు) ఆపివేయబడినప్పుడు మాత్రమే జరుగుతుంది. 20E గానీ, 3D20E ఇంజెక్షన్లు గానీ కన్యలలో EcK2 వ్యక్తీకరణను నిరోధించలేదు (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 5g), ఇది ఈ కైనేజ్ యొక్క నిరోధానికి ఇతర కారకాలు మధ్యవర్తిత్వం వహిస్తాయని సూచిస్తుంది. అయితే, రక్త పానం తర్వాత 20E స్థాయిలు సంభోగ అసౌకర్యాన్ని ప్రేరేపించడానికి సరిపోలేదు, కానీ లైంగికంగా బదిలీ చేయబడిన అధిక స్థాయి 3D20E ద్వారా అవి సమర్థవంతంగా ప్రేరేపించబడ్డాయి.
మా ఫలితాలు A. gambiae యొక్క పునరుత్పత్తి విజయాన్ని నియంత్రించే యంత్రాంగాల గురించి ముఖ్యమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి. ఒక నమూనా ఆవిర్భవించింది, దీని ప్రకారం మగ జీవులు 3D20E యొక్క అధిక టైటర్లను సంశ్లేషణ చేయడానికి పరిణామం చెందాయి. ఇది మగ-నిర్దిష్టమైన, మార్పు చెందిన ఎక్డైసోన్, ఇది ఆడ జీవులను తదుపరి సంభోగానికి సున్నితత్వం లేకుండా చేయడం ద్వారా సంతాన సాఫల్యాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. అదే సమయంలో, ఈ మలేరియా వాహకాలు మగ-నిర్దిష్ట EPP యొక్క లైంగిక బదిలీకి ప్రతిస్పందనగా ఆడ జీవులలో 3D20Eని సక్రియం చేయడానికి ఒక సమర్థవంతమైన వ్యవస్థను కూడా అభివృద్ధి చేసుకున్నాయి. మాకు తెలిసినంతవరకు, కీటకాలలో ఒక ప్రత్యేకమైన మరియు కీలకమైన విధిని నిర్వర్తించే మగ మరియు ఆడ-ఆధిపత్య స్టెరాయిడ్ హార్మోన్ వ్యవస్థకు ఇది మొదటి ఉదాహరణ. మగ-నిర్దిష్ట ఎక్డైసోన్ విధిని ప్రతిపాదించారు కానీ నిశ్చయంగా నిరూపించలేదు. ఉదాహరణకు, ఈ విధులు 20E పూర్వగామి అయిన E1 ద్వారా నిర్వర్తించబడవచ్చనేది ఎక్కువగా ఖండించబడిన ఒక పరికల్పన¹⁸. డ్రోసోఫిలాలో, చిన్న లైంగిక పెప్టైడ్‌ల¹⁹,²⁰ లైంగిక బదిలీ ద్వారా ఏకపురుషత్వం ప్రేరేపించబడుతుందని బాగా తెలుసు. ఇవి నిర్దిష్ట లైంగిక పెప్టైడ్ ద్వారా ఆడ పునరుత్పత్తి మార్గానికి నాడీ సరఫరా చేసే న్యూరాన్‌లతో సంకర్షణ చెందుతాయి. గ్రాహకాలు21,22. A. gambiae ఆడ ఈగలలో 3D20E ద్వారా నియంత్రించబడే డౌన్‌స్ట్రీమ్ సిగ్నలింగ్ కాస్కేడ్‌లను నిర్ధారించడానికి మరియు ఈ కాస్కేడ్‌లు దోమలు మరియు డ్రోసోఫిలా మధ్య సంరక్షించబడతాయో లేదో నిర్ధారించడానికి మరింత పని అవసరం.
మా అధ్యయనంలో గుర్తించినట్లుగా, ఆడ దోమల సంతానోత్పత్తి మరియు ప్రవర్తనపై 3D20E పోషించే ముఖ్యమైన పాత్ర దృష్ట్యా, 3D20E సంశ్లేషణ మరియు క్రియాశీలతకు దారితీసే మార్గాలు భవిష్యత్ దోమల నియంత్రణ వ్యూహాలకు కొత్త అవకాశాలను అందిస్తున్నాయి. ఉదాహరణకు, వంధ్య కీటకాల సాంకేతిక వ్యూహాలలో పోటీపడగల వంధ్య మగ దోమలను ఉత్పత్తి చేయడం, వాటిని అడవిలో విడుదల చేయడానికి ఉపయోగించడం లేదా కన్య సంభోగంలో 3D20Eని అనుకరించడం వంటివి. A. gambiae మరియు ఇతర Cellia జాతులు తమ వీర్యాన్ని సంభోగ ప్లగ్‌లుగా గడ్డకట్టించే సామర్థ్యాన్ని పొందినప్పుడు 3D20E యొక్క మగ-నిర్దిష్ట విధి పరిణామం చెంది ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే ఇది పెద్ద సంఖ్యలో హార్మోన్లు మరియు హార్మోన్-క్రియాశీలక ఎంజైమ్‌ల సమర్థవంతమైన బదిలీకి అనుమతిస్తుంది. దీనికి ప్రతిగా, ఏకపురుషత్వాన్ని అమలు చేసే 3D20E పరిణామం, అధిక మలేరియా ప్రాబల్యం ఉన్న ప్రాంతాలలో ఆడ దోమలు (MISO యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణ ద్వారా) తమ పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని పెంచుకోవడానికి ఒక యంత్రాంగాన్ని అందిస్తుంది, ఇది పరోక్షంగా ప్లాస్మోడియం వ్యాప్తికి దోహదం చేస్తుంది. ఆడ అనోఫెలెస్ దోమలలో P. falciparum యొక్క మనుగడ మరియు పెరుగుదలపై ఆడ 20E తీవ్ర ప్రభావాలను చూపుతుందని నిరూపించబడినందున,24 మగ మరియు ఆడ స్టెరాయిడ్ హార్మోన్లు రెండూ దోమ-పరాన్నజీవి పరస్పర చర్యలలో మార్గాలు ఇప్పుడు కీలక అంశాలుగా మారాయి.
A. gambiae G3 జాతులను ప్రామాణిక కీటక పరిస్థితులలో (26-28 °C, 65-80% సాపేక్ష ఆర్ద్రత, 12:12 గంటల కాంతి/చీకటి ఫోటోపీరియడ్) పెంచారు. లార్వాలకు పొడి చేపల ఆహారాన్ని (టెట్రామిన్ ట్రాపికల్ ఫ్లేక్స్, కోయి పెల్లెట్స్ మరియు టెట్రా పాండ్ స్టిక్స్ 7:7:2 నిష్పత్తిలో) తినిపించారు. వయోజన దోమలకు యథేచ్ఛగా 10% డెక్స్‌ట్రోజ్ ద్రావణాన్ని మరియు వారానికి ఒకసారి మానవ రక్తాన్ని (అధ్యయన రక్త భాగాలు) ఆహారంగా ఇచ్చారు. ప్యూపల్ దశలో సూక్ష్మదర్శిని ద్వారా వాటి చివరలను పరిశీలించిన తర్వాత లింగాలను వేరు చేయడం ద్వారా కన్య దోమలను పొందారు. DsRed ట్రాన్స్‌జీన్‌ను కలిగి ఉన్న మగ దోమల గురించి గతంలో వివరించబడింది.
గతంలో వివరించిన ప్రోటోకాల్‌ల ప్రకారం బలవంతపు సంభోగ ప్రయోగాలు నిర్వహించబడ్డాయి. సహజ సంభోగం కోసం, 4 రోజుల వయస్సు గల కన్య ఆడ ఈగలను, లైంగిక పరిపక్వత చెందిన కన్య మగ ఈగలతో 1:3 నిష్పత్తిలో రెండు రాత్రులు ఉంచారు. మగ ఈగలకు dsEPP ఇంజెక్ట్ చేసిన ప్రయోగాలలో, ఫాస్ఫటేస్ చర్య గరిష్టంగా నిశ్శబ్దం చేయబడినప్పుడు (విస్తరించిన డేటా చిత్రం 2b), ఇంజెక్షన్ తర్వాత 3-4 రోజులతో వాటిని కలిపి బోనులో ఉంచడం జరిగింది.
దోమ కణజాలాలు, మిగిలిన కళేబరాలు (శరీరంలోని మిగిలిన భాగం), లేదా పూర్తి శరీరాన్ని 100% మెథనాల్‌లోకి విడదీసి, బీడర్ (2 మిమీ గాజు పూసలు, 2,400 rpm, 90 సెకన్లు) ఉపయోగించి ఏకరీతిగా చేశారు. కణజాల పరిమాణాలు మరియు మెథనాల్ పరిమాణాలు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి: శరీరంలోని మిగిలిన భాగం, 1,000 µl లో 50; MAG, 80 µl లో 50–100; ఆడ LRT, 80 µl లో 25–50. అవక్షేపాన్ని అదే పరిమాణంలో మెథనాల్‌తో రెండవ మెథనాల్ వెలికితీతకు గురిచేశారు. సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కణ శిధిలాలను తొలగించారు. రెండు వెలికితీతల నుండి వచ్చిన మెథనాల్‌ను కలిపి నైట్రోజన్ ప్రవాహం కింద ఆరబెట్టి, ఆ తర్వాత నీటిలో 80% మెథనాల్ యొక్క ఈ క్రింది పరిమాణాలలో తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు: శరీరంలోని మిగిలిన భాగం, 50 µl; MAGలు మరియు ఆడ LRT, 30 µl.
LC పరికరం (వాంక్విష్, థెర్మో ఫిషర్)కు అనుసంధానించబడిన మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (ID-X, థెర్మో ఫిషర్) పై నమూనాలను విశ్లేషించారు. 25 °C వద్ద ఉంచిన 3 µm, 100 × 4.6 mm కాలమ్ (ఇన్‌స్పైర్ C8, డిక్మా) పైకి 5 µl నమూనాను ఇంజెక్ట్ చేశారు. LC కోసం మొబైల్ దశలు A (నీరు, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం) మరియు B (ఎసిటోనైట్రైల్, 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం)గా ఉన్నాయి. LC గ్రేడియంట్ ఈ క్రింది విధంగా ఉంది: 1 నిమిషం పాటు 5% B, ఆపై 11 నిమిషాలలో 100% B కి పెంచబడింది. 100% వద్ద 8 నిమిషాల తర్వాత, 4 నిమిషాల పాటు 5% B వద్ద కాలమ్‌ను తిరిగి సమతుల్యం చేశారు. ప్రవాహ రేటు 0.3 ml min-1గా ఉంది. MS సోర్స్‌లో అయనీకరణం పాజిటివ్ మరియు నెగటివ్ మోడ్‌లలో హీటెడ్ ఎలెక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణం ద్వారా సాధించబడుతుంది.
మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ పూర్తి MS మోడ్‌లో 60,000 రిజల్యూషన్‌తో 350 నుండి 680 వరకు m/z పరిధిలో డేటాను కొలుస్తుంది. [M + H]+ (అన్ని లక్ష్యాలు), [M - H2O + H]+ (అన్ని లక్ష్యాలు), మరియు [M - H]- (ఫాస్ఫోరిలేటెడ్ లక్ష్యాలు) పై MS/MS డేటా సేకరించబడింది. ప్రామాణికం అందుబాటులో లేని లక్ష్యాల యొక్క ఎక్డైసోన్ లక్షణాలను నిర్ధారించడానికి MS/MS డేటా ఉపయోగించబడింది. లక్ష్యం కాని ఎక్డైస్టెరాయిడ్‌లను గుర్తించడానికి, 15% కంటే ఎక్కువ సాపేక్ష సమృద్ధి ఉన్న అన్ని HPLC శిఖరాల కోసం MS/MS డేటా విశ్లేషించబడింది. ఒక పురుషుడిలో కనిపించే పరిమాణాలకు వాటి సమానత్వాన్ని లెక్కించడానికి, ఒక నిర్దిష్ట నమూనా (అన్ని ఇతర లక్ష్యాలు) యొక్క సంపూర్ణ పరిమాణాలు లేదా విలీనాలను లెక్కించడానికి స్వచ్ఛమైన ప్రామాణికాల (20E, 3D20E) నుండి సృష్టించబడిన ప్రామాణిక వక్రరేఖలను ఉపయోగించి పరిమాణీకరించండి. 3D20E కోసం, కింది అడక్ట్‌ల మొత్తాన్ని ఉపయోగించి పరిమాణీకరణ చేయబడింది: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. ట్రేస్‌ఫైండర్ (వెర్షన్ 4.1) ఉపయోగించి డేటాను సంగ్రహించి, పరిమాణీకరించారు. Xcalibur (వెర్షన్ 4.4) ఉపయోగించి MS/MS డేటాను విశ్లేషించారు. E, 20E మరియు 3D20E ల యొక్క MS స్పెక్ట్రాలను వాటి సంబంధిత ప్రమాణాలతో పోల్చారు. గిరార్డ్ రియేజెంట్‌తో డెరివేటైజేషన్ ద్వారా 3D20E22P ను విశ్లేషించారు. m/z నిష్పత్తి ద్వారా 20E22P ను విశ్లేషించారు.
MAG నుండి 3D20E22P ను శుద్ధి చేశారు. HPLC-MS/MS విశ్లేషణలో ఉపయోగించిన అవే LC పరిస్థితులలో, క్వాడ్రపోల్ మాస్-బేస్డ్ డిటెక్టర్ (QDa, Acquity, Waters)తో కూడిన అల్ట్రా-పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రాఫ్ (Acquity, Waters)ను ఉపయోగించి విశ్లేషణాత్మక స్థాయిలో ఈ శుద్ధీకరణను నిర్వహించారు. ముందుగా నిర్ధారించిన అదే రిటెన్షన్ టైమ్‌లో 3D20E22P కు సంబంధించిన m/z ను గుర్తించినప్పుడు ఫ్రాక్షన్ సేకరణను ప్రారంభించారు. ఆ తర్వాత, పైన వివరించిన విధంగా HPLC-MS/MS ద్వారా సంగ్రహించిన సమ్మేళనాల స్వచ్ఛతను తనిఖీ చేశారు.
తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి, TRI రిఏజెంట్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి 10-12 పునరుత్పత్తి కణజాలాలు లేదా శరీరంలోని ఇతర భాగాల (తల లేని) నుండి మొత్తం RNA సంగ్రహించబడింది. RNAను TURBO DNase (థర్మో ఫిషర్)తో ట్రీట్ చేశారు. తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి, మోలోనీ మ్యూరిన్ ల్యూకేమియా వైరస్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేస్ (M-MLV RT; థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి cDNA సంశ్లేషణ చేయబడింది. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (RT-qPCR; విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2) కోసం ప్రైమర్‌లు గతంలో ప్రచురించబడ్డాయి24 లేదా ప్రైమర్-బ్లాస్ట్26 ఉపయోగించి రూపొందించబడ్డాయి, ఇందులో 70-150 bp పరిమాణంలో ఉండి, ఎక్సాన్-ఎక్సాన్ జంక్షన్‌లను లేదా వేర్వేరు ఎక్సాన్‌లను విస్తరించే ప్రైమర్ జత ప్రైమర్‌లకు ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడింది. RT-qPCR కోసం మూడు నుండి నాలుగు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌ల నుండి వచ్చిన cDNA నమూనాలను నీటిలో నాలుగు రెట్లు పలుచగా చేశారు. 1× పవర్‌అప్ SYBR గ్రీన్ మాస్టర్ మిక్స్ (థర్మో ఫిషర్), ప్రైమర్‌లు మరియు 5 µl పలుచగా చేసిన ద్రావణాన్ని కలిగి ఉన్న 15 µl రెప్లికేట్ రియాక్షన్‌లలో క్వాంటిఫికేషన్ నిర్వహించబడింది. cDNA. చర్యలను క్వాన్‌స్టూడియో 6 ప్రో రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్) పై నిర్వహించారు మరియు డిజైన్ అండ్ అనాలిసిస్ (వెర్షన్ 2.4.3) ఉపయోగించి డేటాను సేకరించి విశ్లేషించారు. ఈ అధ్యయనంలో చూపినట్లుగా, సాపేక్ష పరిమాణాలను రైబోసోమల్ జన్యువు RpL19 (AGAP004422) కు సాధారణీకరించారు, దీని వ్యక్తీకరణ రక్త ఆహారం 27 లేదా సంభోగం 3 తో ​​గణనీయంగా మారలేదు.
RNA నాణ్యతను అజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ 2100 బయోఅనలైజర్ (అజిలెంట్) ఉపయోగించి తనిఖీ చేశారు. ఇల్యూమినా పెయిర్డ్-ఎండ్ లైబ్రరీలను MIT మరియు హార్వర్డ్ యొక్క బ్రాడ్ ఇన్‌స్టిట్యూట్‌లో తయారు చేసి, రన్ చేశారు. సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌లను డిఫాల్ట్ పారామీటర్‌లతో HISAT2 (వెర్షన్ 2.0.5) ఉపయోగించి A. gambiae జీనోమ్ (PEST స్ట్రెయిన్, వెర్షన్ 4.12)కు అలైన్ చేశారు. మ్యాపింగ్ క్వాలిటీ (MAPQ) స్కోర్‌లు <30 ఉన్న రీడ్‌లను సామ్‌టూల్స్ (వెర్షన్ 1.3.1) ఉపయోగించి తొలగించారు. జన్యువులకు మ్యాప్ చేయబడిన రీడ్‌ల సంఖ్యను డిఫాల్ట్ పారామీటర్‌లతో htseq-count (వెర్షన్ 0.9.1) ఉపయోగించి లెక్కించారు. నార్మలైజ్డ్ రీడ్ కౌంట్‌లను లెక్కించి, R (వెర్షన్ 4.0.3)లోని DESeq2 ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.28.1)ని ఉపయోగించి డిఫరెన్షియల్ జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను విశ్లేషించారు.
ఎక్డైసోన్-మాడిఫైయింగ్ జన్యు అభ్యర్థులను మొదట A. gambiae జన్యువును PSI-BLAST అల్గోరిథం (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ఉపయోగించి శోధించడం ద్వారా గుర్తించారు, డిఫాల్ట్ విలువలతో పారామీటర్లను ఉపయోగించి కింది క్వెరీ ప్రోటీన్ సీక్వెన్సులు: Bombyx mori (యాక్సెషన్ నం. NP_001038956.1), Musca domestica (యాక్సెషన్ నం. XP_005182020.1, XP_005175332.1 మరియు XP_011294434.1) మరియు Microplitis demolitor (యాక్సెషన్ నం. XP_008552646.1 మరియు XP_008552645.1) నుండి; B. mori (యాక్సెషన్ నం. NP_001036900), Drosophila melanogaster (యాక్సెషన్ నం. NP_651202), ఏపిస్ మెల్లిఫెరా (యాక్సెషన్ నం. XP_394838) మరియు ఏసిర్థోసిఫాన్ పిసమ్ (యాక్సెషన్ నం. XP_001947166); మరియు B. మోరి (యాక్సెషన్ నం. XP_001947166) NP_001177919.1 మరియు NP_001243996.1) నుండి EPP మరియు D. మెలనోగాస్టర్ (యాక్సెషన్ నం. NP_572986.1) యొక్క EO (దశ 1). తరువాత, గాంబియాలోని పునరుత్పత్తి కణజాలంలో (ఆడ LRT లేదా MAG) అధిక mRNA వ్యక్తీకరణ (>100 ఫ్రాగ్మెంట్స్/కిలోబేస్ ఎక్సాన్స్ పర్ మిలియన్ మ్యాప్డ్ రీడ్స్ (FPKM) లేదా >85%) ఆధారంగా హిట్‌లను ఫిల్టర్ చేయండి (దశ 2). నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచడానికి, సంభోగం సమయంలో ఎక్డైసోన్‌ను సంశ్లేషణ లేదా బదిలీ చేయని అనోఫెలెస్ జాతి అయిన A. అల్బిమానస్ యొక్క పునరుత్పత్తి కణజాలంలో కూడా వ్యక్తమయ్యే అభ్యర్థి ఎంజైమ్‌లను మేము ఎంచుకున్నాము. A. అల్బిమానస్ పునరుత్పత్తి కణజాలంలో తక్కువ వ్యక్తీకరణ (<100 FPKM లేదా <85వ పర్సంటైల్) ఆధారంగా అభ్యర్థి జన్యువులను ఫిల్టర్ చేయడం జరిగింది (దశ 3). తుది ఫిల్టర్‌గా (దశ 4), అభ్యర్థి జన్యువులు కింది వాటిలో కనీసం ఒకదానిని సంతృప్తి పరచాలి: (1) విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే జన్యువుల విశ్లేషణ ప్రకారం సంభోగం తర్వాత గణనీయంగా అప్-రెగ్యులేట్ అవ్వడం (P < 0.05) మరియు (2) పునరుత్పత్తియేతర కణజాలాలలో (< 85 % లేదా <100 FPKM).
మొత్తం జీవి ఐసోటోపిక్ లేబులింగ్‌ను సాధించడానికి మేము గతంలో వివరించిన పద్ధతులు 28,29,30 ను సవరించాము. క్లుప్తంగా, వైల్డ్-టైప్ సాక్రోమైసెస్ సెరెవిసియా టైప్ II (YSC2, సిగ్మా) ను యీస్ట్ నైట్రోజన్ బేస్ (BD డిఫ్కో, DF0335) లో పరీక్షించారు, ఇందులో (wt/vol) 2% గ్లూకోజ్ (G7528, సిగ్మా), 1.7% అమైనో ఆమ్లం లేని మరియు అమ్మోనియం సల్ఫేట్ ఉన్నాయి. కల్చర్ మీడియం) మరియు నైట్రోజన్‌కు ఏకైక వనరుగా 5% 15N అమ్మోనియం సల్ఫేట్ (NLM-713, >99%, కేంబ్రిడ్జ్ ఐసోటోప్ లాబొరేటరీస్) ఉన్నాయి. సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా యీస్ట్‌ను వేరుచేసి, దోమ లార్వాలకు ప్యూపేషన్ అయ్యే వరకు యథేచ్ఛగా ఆహారం అందించారు. నాల్గవ దశ మరణాన్ని నివారించడానికి ఫిష్‌మీల్ (300 లార్వాలకు 0.5 mg) అనుబంధంగా ఇచ్చారు. సంభోగం సమయంలో బదిలీ చేయబడిన మగ ప్రోటీయోమ్‌ను విశ్లేషించడానికి, లేబుల్ లేని మగవాటితో సంభోగ ప్రయోగాలలో ఆడవాటిని మాత్రమే ఉపయోగించారు.
4-6 రోజుల వయస్సు గల, 15N-ట్యాగ్ చేయబడిన కన్య ఆడ ఈగలను, అదే వయస్సు గల ట్యాగ్ చేయని కన్య మగ ఈగలతో సంభోగం చేయించారు. ఎపిఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ కింద మేటింగ్ ప్లగ్‌లను గుర్తించడం ద్వారా విజయవంతమైన సంభోగాన్ని ధృవీకరించారు. 3, 12, మరియు 24 గంటల తర్వాత, సంభోగం చేసిన 45-55 ఆడ ఈగల కర్ణికలను 50 µl అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ బఫర్ (pH 7.8) లోకి వేరు చేసి, రోకలితో మెత్తగా నూరారు. ఆ మిశ్రమాన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, పై ద్రవాన్ని 50 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్‌లో 50 µl 0.1% రాపిజెస్ట్ (186001860, వాటర్స్)తో కలిపారు. ప్రతి నమూనా నుండి వచ్చిన పై ద్రవాన్ని మరియు పెల్లెట్‌ను డ్రై ఐస్‌పై తక్షణమే గడ్డకట్టించి, వాషింగ్టన్ విశ్వవిద్యాలయంలోని మాక్‌కాస్ ప్రయోగశాలకు రాత్రికి రాత్రే పంపించారు, అక్కడ LC-MS/MS కోసం నమూనా తయారీని పూర్తి చేశారు. పెల్లెట్‌ను 50 µl 0.1% ద్రావణంలో తిరిగి సస్పెండ్ చేయండి. 50 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్‌లో రాపిజెస్ట్‌ను కలిపి, వాటర్ బాత్‌లో సోనికేట్ చేయండి. పెల్లెట్ మరియు సూపర్‌నాటెంట్ యొక్క ప్రోటీన్ గాఢతను BCA అస్సే ద్వారా కొలిచారు, నమూనాలను 5 mM డైథియోథ్రెయిటాల్ (DTT; సిగ్మా)తో రిడ్యూస్ చేసి, 15 mM అయోడోఅసిటమైడ్ (సిగ్మా)తో ఆల్కైలేట్ చేసి, 37 °C (1:0:50) వద్ద 1 గంట పాటు ట్రిప్సినైజేషన్ (ట్రిప్సిన్:సబ్‌స్ట్రేట్ నిష్పత్తి)తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 200 mM HCl కలపడం ద్వారా రాపిజెస్ట్‌ను లైజ్ చేశారు, ఆ తర్వాత 37 °C వద్ద 45 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, శిథిలాలను తొలగించడానికి 4 °C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 14,000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. నమూనాలను డ్యూయల్-మోడ్ సాలిడ్-ఫేజ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ (ఒయాసిస్ MCX కార్ట్రిడ్జ్‌లు, వాటర్స్) ద్వారా కడిగి, 0.33 µg µl-1 తుది ప్రోటీన్ గాఢత కోసం 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌లో తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు. లేబుల్ చేయని MAG ప్రోటీయోమ్‌లు కన్య మగ జీవుల నుండి కూడా ఇదే విధంగా విశ్లేషించబడ్డాయి. ప్రతి నమూనాకు రెండు విశ్లేషణాత్మక ప్రతిరూపాలు విశ్లేషించబడ్డాయి. తరువాత, ప్రతి దాని నుండి 1 µg ను, జూపిటర్ C12 రివర్స్డ్-ఫేజ్ రెసిన్ (ఫెనోమెనెక్స్) తో నింపబడిన 4-సెం.మీ ఫ్యూజ్డ్ సిలికా కాసిల్1 (PQ) ఫ్రిట్ ట్రాప్‌తో కూడిన 25-సెం.మీ ఫ్యూజ్డ్ సిలికా 75-μm కాలమ్ మరియు 180 నిమిషాల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీని ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. నమూనా డైజెస్ట్‌లు – MS/MSను Q-ఎక్సాక్టివ్ HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్) మరియు నానోACQUITY UPLC సిస్టమ్ (వాటర్స్) ఉపయోగించి నిర్వహించారు. ప్రతి రన్ కోసం ఉత్పత్తి చేయబడిన డేటా-సంబంధిత అక్విజిషన్ డేటాను ప్రోటియోవిజార్డ్ (వెర్షన్ 3.0.20287) ఉపయోగించి mzML ఫార్మాట్‌లోకి మార్చారు మరియు అనోఫెలెస్ గాంబియే (వెక్టర్‌బేస్ వెర్షన్ 54), అనోఫెలెస్ కొలుజ్జీ (మాలి-NIH (వెక్టర్‌బేస్ వెర్షన్ 54) పై శోధన నిర్వహించబడింది), సాక్రోమైసెస్ సెరెవిసియే (యూనిప్రోట్, మార్చి 2021), A. గాంబియే RNA-seq, మరియు తెలిసిన మానవ కలుషితాల యొక్క త్రీ-ఫ్రేమ్ అనువాదాల నుండి ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉన్న ఫాస్టా డేటాబేస్‌కు వ్యతిరేకంగా కామెట్31 (వెర్షన్ 3.2) ఉపయోగించి మార్చారు. పెప్టైడ్ మ్యాప్-మ్యాచ్డ్ FDRలను 0.01 థ్రెషోల్డ్‌తో పెర్కోలేటర్32 (వెర్షన్ 3.05) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు, మరియు ప్రోటీన్ పార్సిమోనీని ఉపయోగించి పెప్టైడ్‌లను ప్రోటీన్ గుర్తింపులుగా సమీకరించారు. లైమ్‌లైట్33 (వెర్షన్ 2.2.0). గతంలో వివరించిన విధంగా ప్రతి రన్‌లో ప్రతి ప్రోటీన్ కోసం లెక్కించబడిన నార్మలైజ్డ్ స్పెక్ట్రల్ అబండెన్స్ ఫ్యాక్టర్ (NSAF) ఉపయోగించి సాపేక్ష ప్రోటీన్ సమృద్ధిని అంచనా వేశారు. ప్రతి ప్రోటీన్‌కు సాపేక్షంగా ఉన్న NSAFను రెండు వేర్వేరు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌ల నుండి వచ్చిన నమూనాలలో సగటున లెక్కించారు. 15N లేబులింగ్ ఆడ ప్రోటీయోమ్‌ను విజయవంతంగా మాస్క్ చేసింది, అయినప్పటికీ లేబుల్ చేయబడిన కన్యల నుండి తక్కువ మొత్తంలో లేబుల్ చేయని ప్రోటీన్‌ను గుర్తించగలిగారు. HPLC "క్యారీ ఓవర్" ఫలితంగా, మగ/సంభోగ నమూనాల తర్వాత ముడి నమూనాలను రన్ చేసిన టెక్నికల్ రన్‌లలో మాత్రమే ఆడ ముడి నమూనాలలో మగ ప్రోటీన్ తగ్గింపు (1-5 స్పెక్ట్రా)ను మేము గుర్తించాము. లేబుల్ చేయబడిన కన్యల నుండి 'కలుషితాలు'గా కనుగొనబడిన అప్పుడప్పుడు కనిపించే ప్రోటీన్‌లు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1లో జాబితా చేయబడ్డాయి.
జెన్‌స్క్రిప్ట్‌లో QTTDRVAPAPDQQQ (ఐసోటైప్ PA పరిధిలో) మరియు MESDGTTPSGDSEQ (ఐసోటైప్ PA మరియు PB పరిధిలో) అనే రెండు యాంటిజెనిక్ పెప్టైడ్‌లు ఉన్నాయి. ఈ రెండు పెప్టైడ్‌లను కలిపి, ఆ తర్వాత KLH అనే క్యారియర్ ప్రోటీన్‌కు సంయోగం చేసి న్యూజిలాండ్ కుందేళ్ళలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. నాల్గవ ఇంజెక్షన్ తర్వాత కుందేళ్ళను బలి ఇచ్చి, అఫినిటీ ప్యూరిఫికేషన్ ద్వారా మొత్తం IgGని వేరు చేశారు. అత్యంత EPP-నిర్దిష్టమైన కుందేలు నుండి వచ్చిన IgGని తదుపరి వెస్టర్న్ బ్లాటింగ్ కోసం ఉపయోగించారు.
వెస్టర్న్ బ్లాట్స్ కోసం, 4-రోజుల వయస్సు గల కన్య మగ దోమలు మరియు కన్య లేదా బలవంతంగా సంభోగం చేయబడిన ఆడ దోమల (<10 సంభోగం తర్వాత) నుండి MAG (n = 10, ఇక్కడ n అనేది జీవశాస్త్రపరంగా స్వతంత్ర దోమ నమూనాల సంఖ్యను సూచిస్తుంది) మరియు ఆడ LRT (n = 30) నమూనాలను తీసుకున్నారు. ప్రోటీన్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ బఫర్ (50 mM ట్రిస్, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% సోడియం డియోక్సికోలేట్; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ కాక్‌టెయిల్ (రోష్))ను విడివిడిగా కలిపారు. నమూనాలను విడదీసిన వెంటనే బీడర్ (2 mm గాజు పూసలు, 2,400 rpm, 90 సెకన్లు) ఉపయోగించి హోమోజనైజ్ చేశారు. 4 °C వద్ద 20,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కరగని శిధిలాలను తొలగించారు. బ్రాడ్‌ఫోర్డ్ అస్సే (బయో-రాడ్) ద్వారా ప్రోటీన్‌లను పరిమాణీకరించారు. తరువాత, 20 µg MAG ప్రోటీన్, 40 µg LRT ప్రోటీన్, మరియు 20 µg LRT ప్రోటీన్‌ను వేరువేరుగా కలిపారు. మిగిలిన µg బల్క్ ప్రోటీన్‌ను డీనాచురేషన్ చేసి, MOPS బఫర్‌ను ఉపయోగించి 10% బిస్-ట్రిస్ నూపేజ్ (NuPAGE) ద్వారా వేరు చేశారు. iBlot2 ట్రాన్స్‌ఫర్ సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్‌లను పాలివినైలిడీన్ ఫ్లోరైడ్ మెంబ్రేన్‌లకు బదిలీ చేశారు. మెంబ్రేన్‌లను 1× PBS-T (PBSలో 0.1% ట్వీన్-20)లో రెండుసార్లు కడిగి, ఆపై 22°C వద్ద 1 గంట పాటు ఒడిస్సీ బ్లాకింగ్ బఫర్ (లి-కార్)లో బ్లాక్ చేశారు. కస్టమ్ రాబిట్ యాంటీ-EPP పాలీక్లోనల్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ (బ్లాకింగ్ బఫర్‌లో 1:700) మరియు ర్యాట్ యాంటీ-యాక్టిన్ మోనోక్లోనల్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ MAC237 (అబీమ్; 1:4,000)తో మెంబ్రేన్‌లను 4°C వద్ద రాత్రంతా షేక్ చేశారు. మెంబ్రేన్‌లను PBS-Tతో కడిగి, ఆపై సెకండరీ యాంటీబాడీలతో (డాంకీ యాంటీ-రాబిట్ 800CW మరియు గోట్ యాంటీ-ర్యాట్ 680LT (లి-కార్), రెండూ 1:20,000) ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 0.01% SDS మరియు 0.2% Tween -20 కలిగిన బ్లాకింగ్ బఫర్‌లో 22 °C వద్ద 1 గంట పాటు ఉంచారు. మెంబ్రేన్‌లను PBS-T తో కడిగి, ఒడిస్సీ CLx స్కానర్‌తో ఇమేజింగ్ చేశారు. ఇమేజ్‌లను ఇమేజ్ స్టూడియో (వెర్షన్ 5.2)లో సేకరించి, ప్రాసెస్ చేశారు. EPP-RA ఐసోఫార్మ్ (82 kDa)కు సంబంధించిన నిర్దిష్ట బ్యాండ్ కనుగొనబడలేదు.
EPP (హిస్టిడిన్ ఫాస్ఫేటేస్ డొమైన్‌ను కలిగి ఉన్న ఐసోఫార్మ్ AGAP002463-RB, NCBI కన్సర్వ్డ్ డొమైన్ సెర్చ్ 34) మరియు EcK2 (AGAP002181) యొక్క కోడింగ్ ప్రాంతాలను pET-21a(+) ప్లాస్మిడ్ (నోవాజెన్ మిల్లిపోర్ సిగ్మా) లోకి క్లోన్ చేశారు; ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. pET-21a(+)-EcK2 కన్‌స్ట్రక్ట్ యొక్క C-టెర్మినల్ 6xHis ట్యాగ్‌కు ముందు ఎనిమిది GS4 లింకర్లు (ట్యాండమ్‌లో) చొప్పించబడ్డాయి. NEBExpress సెల్-ఫ్రీ E. కోలి ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ చర్యను (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోల్యాబ్స్) ఉపయోగించి రికాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లు ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. NEBExpress Ni స్పిన్ కాలమ్‌లను (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోల్యాబ్స్) ఉపయోగించి రికాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లు శుద్ధి చేయబడ్డాయి. NEBExpress సెల్-ఫ్రీ E. కోలి ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ కిట్ నుండి DNA టెంప్లేట్‌ను ఉపయోగించి డైహైడ్రోఫోలేట్ రిడక్టేజ్ (DHFR) కంట్రోల్ ప్రోటీన్ ఉత్పత్తి చేయబడింది. ప్రోటీన్‌లు 3 నెలల వరకు -20 °C వద్ద PBSలో 50% గ్లిజరాల్‌లో నిల్వ చేయబడ్డాయి.
4-నైట్రోఫెనైల్ ఫాస్ఫేట్ (pNPP; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉపయోగించి EPP మరియు కణజాల సారాల యొక్క ఫాస్ఫటేస్ క్రియాశీలతను కొలిచారు. రియాక్షన్ బఫర్‌లో 25 mM ట్రిస్, 50 mM ఎసిటిక్ ఆమ్లం, 25 mM బిస్-ట్రిస్, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, మరియు 1 mM DTT ఉన్నాయి. కణజాలాన్ని రియాక్షన్ బఫర్‌లో హోమోజనైజ్ చేసి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కణ శిథిలాలను తొలగించారు. 2.5 mg ml-1 pNPP ఉన్న రియాక్షన్ బఫర్‌కు ఎంజైమ్ లేదా కణజాల సారాన్ని జోడించడం ద్వారా చర్యను ప్రారంభించండి. రియాక్షన్ మిశ్రమాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో ఇంక్యుబేట్ చేశారు, మరియు వివిధ సమయాల్లో 405 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను కొలవడం ద్వారా pNPP నుండి pNPగా మారిన పరిమాణాన్ని లెక్కించారు.
ఇన్ విట్రో EcK చర్య కోసం, ప్రోటీన్‌ను 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP మరియు 10 mM MgCl2 కలిగిన 200 µl బఫర్ (pH 7.5)లో 0.2 mg 20E లేదా 3D20Eతో కలిపి 27 °C వద్ద 2 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 800 µl మెథనాల్ కలపడం ద్వారా చర్యను ఆపి, ఆ తర్వాత -20 °C వద్ద 1 గంట పాటు చల్లబరిచి, అనంతరం 4 °C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 20,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఆ తర్వాత సూపర్నాటెంట్‌ను HPLC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషించారు. కంట్రోల్ గ్రూప్‌లో ఉపయోగించిన ప్రోటీన్‌లను వేడితో నిష్క్రియం చేయడానికి, ఆ ప్రోటీన్‌లను PBSలోని 50% గ్లిజరాల్‌లో 95 °C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు.
ఇన్ విట్రో EPP చర్య కోసం, ప్రోటీన్‌ను 3D20E22P (HPLC-MS/MS ద్వారా శుద్ధి చేయబడిన, 18 జతల MAGలో లభించే పరిమాణానికి సమానమైనది)తో 100 µl బఫర్ (pH 7.5)లో 25 mM ట్రిస్, 50 mM ఎసిటిక్ ఆమ్లం, 25 mM బిస్-ట్రిస్, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, మరియు 1 mM DTT కలిపి 27 °C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 400 µl మెథనాల్ కలపడం ద్వారా చర్యను ఆపి, 1 గంట పాటు -20 °C వద్ద చల్లబరిచారు, ఆ తర్వాత 4 °C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 20,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్నాటెంట్‌ను HPLC-MS/MS ద్వారా విశ్లేషించారు.
మిశ్రమ-లింగ తలలేని దోమల కళేబరాల నుండి తయారుచేసిన cDNA నుండి EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) మరియు EcK2 (556 bp) కొరకు PCR ఖండాలు విస్తరించబడ్డాయి. eGFP నియంత్రణ యొక్క PCR ఖండం (495 bp) గతంలో వివరించిన pCR2.1-eGFP నుండి విస్తరించబడింది; PCR ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. PCR ఫ్రాగ్మెంట్ pL4440 ప్లాస్మిడ్‌పై ఉన్న విలోమ T7 ప్రమోటర్‌ల మధ్య చొప్పించబడింది. ప్లాస్మిడ్ నిర్మాణాలు NEB 5-α కాంపిటెంట్ E. కోలి (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్) నుండి తిరిగి పొందబడ్డాయి మరియు ఉపయోగించడానికి ముందు DNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి (ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్ కోసం అనుబంధ డేటా 1 చూడండి). pL4440-ఆధారిత ప్లాస్మిడ్ నుండి ఇన్సర్ట్‌ను విస్తరించడానికి T7 ప్రమోటర్‌కు సరిపోలిన ప్రైమర్‌లు (విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2) ఉపయోగించబడ్డాయి. PCR ఉత్పత్తి పరిమాణం అగరోస్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ ద్వారా నిర్ధారించబడింది. dsRNA, మెగాస్క్రిప్ట్ T7 ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కిట్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి PCR టెంప్లేట్‌ల నుండి ట్రాన్స్‌క్రైబ్ చేయబడింది మరియు ముందుగా వివరించిన మార్పులతో తయారీదారు సూచనల ప్రకారం శుద్ధి చేయబడింది.
dsRNA ఇంజెక్షన్ కోసం, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ను, గుడ్డు నుండి బయటకు వచ్చిన 1 రోజులోపు, వయోజన మగ లేదా ఆడ ఈగల వక్షోభాగంలోకి 10 ng nl-1 గాఢతతో ఇంజెక్ట్ చేశారు (నానోజెక్ట్ III, డ్రమ్మండ్). RNA సంగ్రహణ, cDNA సంశ్లేషణ, మరియు RT-qPCR ద్వారా కనీసం మూడు జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాలలో జన్యు నాక్‌డౌన్ స్థాయిలను నిర్ధారించారు. ఎక్డైసోన్ ఇంజెక్షన్ కోసం, 4-రోజుల వయస్సు గల కన్య లేదా 6-రోజుల వయస్సు గల, రక్తం తాగిన కన్య ఆడ ఈగలకు, ప్రయోగాత్మక రూపకల్పనను బట్టి వరుసగా 1.3, 2.1 లేదా 6.3 ng nl-1 గాఢతలలో 0.13, 0.21, లేదా 0.63 µg 20E లేదా 3D20E (నానోజెక్ట్ III, డ్రమ్మండ్) ను ఇంజెక్ట్ చేశారు. 10% (vol/vol) ఇథనాల్ యొక్క 100 nl ను ఇంజెక్ట్ చేయండి. నీరు; 10% ఇథనాల్‌లో 100 nl 3D20E22P (ఒక జత MAGలలో ఉండే పరిమాణంలో 75%కి సమానం). దోమలను యాదృచ్ఛికంగా ఇంజెక్షన్ సమూహానికి కేటాయించారు.
గుడ్లు పెట్టే పరీక్షల కోసం, 3 రోజుల వయస్సు గల ఆడ దోమలకు మానవ రక్తాన్ని యథేచ్ఛగా ఆహారంగా ఇచ్చారు. పాక్షికంగా ఆహారం తీసుకున్న లేదా ఆహారం తీసుకోని దోమలను తొలగించండి. చికిత్సను బట్టి, ఆడ దోమలను రక్తాహారం తీసుకున్న కనీసం 48 గంటల తర్వాత నాలుగు రాత్రుల పాటు వేర్వేరు గుడ్లు పెట్టే కప్పులలో ఉంచారు. గుడ్లను స్టీరియోస్కోప్ (స్టెమి 508, జీస్) కింద లెక్కించారు; సంభోగం జరిపిన ఆడ దోమల విషయంలో, లార్వాలుగా పొదిగిన గుడ్లను సారవంతమైనవిగా పరిగణించారు.
సంభోగ ప్రయోగాల కోసం, ఆడవాటికి సంభోగ నిరోధకతను పెంపొందించుకోవడానికి చికిత్సను బట్టి కనీసం 2 రోజుల సమయం ఇచ్చారు, ఆ తర్వాత అదే వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ మగవాటిని అదే పంజరంలోకి ప్రవేశపెట్టారు. రెండు రాత్రుల తర్వాత, ఆడవాటి ఫలదీకరణ చెందిన వెసికిల్స్‌ను విడదీసి, 10 mM ట్రిస్-HCl, 1 mM EDTA, మరియు 25 mM NaCl (pH 8.2) కలిగిన బఫర్‌లో ఫ్రీజ్-థా మరియు సోనికేషన్ ద్వారా జెనోమిక్ DNAను విడుదల చేశారు. నమూనాలను ప్రోటీనేస్ K (0.86 µg µl-1)తో 55 °C వద్ద 15 నిమిషాలు, ఆ తర్వాత 95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ముడి జెనోమిక్ DNA సన్నాహాలను 10 రెట్లు పలుచగా చేసి, Y క్రోమోజోమ్ శ్రేణుల qPCR గుర్తింపుకు గురిచేశారు; ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. Y క్రోమోజోమ్ శ్రేణి లేకపోవడం సంభోగం జరగలేదని సూచిస్తుంది.
పునఃసంయోగ పరీక్షల కోసం, బలవంతంగా సంభోగం చేయించిన ఆడ ఈగలను, వాటి సంభోగ స్థితిని నిర్ధారించడానికి మేటింగ్ ప్లగ్‌ల ఉనికి కోసం పరిశీలించారు మరియు మగ ఈగలు లేనప్పుడు సంభోగానికి నిరోధకతను పెంపొందించుకోవడానికి 2 రోజులు అనుమతించారు, ఇది గతంలో వివరించిన విధంగానే 36. ఆ తర్వాత, DsRed ట్రాన్స్‌జెనిక్ స్పెర్మ్‌ను కలిగి ఉన్న మగ ఈగలను ఆడ ఈగల బోనులలోకి ప్రవేశపెట్టారు. రెండు రాత్రుల తర్వాత, ఆడ ఈగల నుండి ఫలదీకరణ వెసికిల్స్‌ను వేరుచేసి, పైన వివరించిన విధంగా జన్యు DNAను తయారుచేసి, DsRed ట్రాన్స్‌జీన్ యొక్క qPCR గుర్తింపుకు గురిచేశారు; ప్రైమర్‌లు విస్తరించిన డేటా పట్టిక 2లో జాబితా చేయబడ్డాయి. DsRed ట్రాన్స్‌జీన్ లేకపోవడం పునఃసంయోగం జరగలేదని సూచించింది.
3D20E ను ఇంతకు ముందు వివరించిన విధంగా 37 సంశ్లేషణ చేశారు. క్లుప్తంగా, 10 mg 20E (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను 10 ml నీటిలో కరిగించి, ఆ తర్వాత 30 mg ప్లాటినం బ్లాక్ (పౌడర్ రూపంలో, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ను కలిపారు. చర్య మిశ్రమంలోకి O2 ను నిరంతరం బుడగలుగా పంపి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద కలియబెట్టారు. 6 గంటల తర్వాత, చర్యను ఆపడానికి 30 ml మెథనాల్ కలిపారు. ఉత్ప్రేరక కణాలను తొలగించడానికి మిశ్రమాన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. పైనున్న ద్రవాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద వాక్యూమ్‌లో పూర్తిగా ఆవిరి చేశారు. ఎండిన చర్య ఉత్పత్తిని HPLC-MS/MS విశ్లేషణ కోసం ఇంజెక్షన్ కొరకు 10% ఇథనాల్ మరియు మెథనాల్‌లో కరిగించారు. మార్పిడి రేటు (20E నుండి 3D20E వరకు) సుమారుగా 97% (పటం 4b), మరియు సంశ్లేషణ చేయబడిన 3D20E యొక్క MS స్పెక్ట్రం సంభోగం చేసిన ఆడవాటిలో కనిపించిన దానితో సరిపోలింది (పటం 4c).
లెజెండ్‌లో నిర్వహించిన గణాంక పరీక్షల యొక్క నిర్దిష్ట వివరాలు ఉన్నాయి. ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, మాంటెల్-కాక్స్ పరీక్ష మరియు స్టూడెంట్ యొక్క t-పరీక్షను నిర్వహించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ (వెర్షన్ 9.0) ఉపయోగించబడింది. కోక్రాన్-మాంటెల్-హెన్సెల్ పరీక్షలు ఒక కస్టమ్ R స్క్రిప్ట్ (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test వద్ద అందుబాటులో ఉంది) ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి. 0.05 ప్రాముఖ్యత పరిమితితో షాపిరో-విల్క్ పరీక్షను ఉపయోగించి డేటా పంపిణీ సాధారణత కోసం పరీక్షించబడింది. డేటా సాధారణత పరీక్షలో విఫలమైనప్పుడు, మాన్-విట్నీ పరీక్ష నిర్వహించబడింది. మనుగడ డేటా మాంటెల్-కాక్స్ పరీక్షను ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది. RNA-seq జన్యు-స్థాయి అవకలన వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి DESeq2 ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.28.1) ఉపయోగించబడింది. గ్రాఫ్‌లోని క్షితిజ సమాంతర పట్టీ మధ్యస్థాన్ని సూచిస్తుంది. అన్ని పరీక్షలకు P = 0.05 ప్రాముఖ్యత విలువ పరిమితిగా ఉపయోగించబడింది.
అధ్యయన రూపకల్పనపై మరింత సమాచారం కోసం, ఈ వ్యాసానికి లింక్ చేయబడిన నేచర్ రీసెర్చ్ రిపోర్ట్ సారాంశాన్ని చూడండి.
MS ప్రోటియోమిక్ డేటాను PRIDE పార్టనర్ రిపోజిటరీ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ద్వారా ప్రోటియోమ్‌ఎక్స్‌ఛేంజ్ కన్సార్టియం (http://proteomecentral.proteomexchange.org) లో PXD032157 అనే డేటాసెట్ ఐడెంటిఫైయర్‌తో డిపాజిట్ చేయడం జరిగింది.
RNA-seq డేటాసెట్, జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ కాంప్రహెన్సివ్ లైబ్రరీ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)లో GSE198665 అనే సీరియల్ రికార్డ్ కింద నిక్షిప్తం చేయబడింది.
ప్రస్తుత అధ్యయనంలో రూపొందించబడిన మరియు/లేదా విశ్లేషించబడిన అదనపు డేటాసెట్‌లను, సహేతుకమైన అభ్యర్థనపై సంబంధిత రచయితల నుండి పొందవచ్చు. ఈ వ్యాసం మూల డేటాను అందిస్తుంది.
డి లూఫ్, ఎ. ఎక్డైస్టెరాయిడ్స్: నిర్లక్ష్యం చేయబడిన కీటకాల లైంగిక స్టెరాయిడ్లు? మగ: బ్లాక్ బాక్స్. కీటక శాస్త్రం. 13, 325–338 (2006).
రెడ్‌ఫెర్న్, CPF 20-హైడ్రాక్సీఎక్డైసోన్ మరియు అనోఫెలెస్ స్టెఫెన్స్‌లో అండాశయ అభివృద్ధి. జె. ఇన్సెక్ట్ ఫిజియాలజీ. 28, 97–109 (1982).