కణ విభజన మరియు హోమియోస్టాసిస్‌ను నిర్వహించడానికి స్రవించే మార్గంలో ప్రోటీన్ క్రమబద్ధీకరణ చాలా అవసరం. షెల్-మధ్యవర్తిత్వ క్రమబద్ధీకరణతో పాటు, స్రవించే రవాణా ప్రక్రియలో కినిసిన్ క్రమబద్ధీకరణలో లిపిడ్‌ల పాత్ర అనేది ఇంకా సమాధానం లేని చాలా కాలంగా ఉన్న ప్రాథమిక ప్రశ్న. ఇక్కడ, చాలా పొడవైన సిరమైడ్ లిపిడ్ భాగాలతో కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన గ్లైకోసైల్ఫాస్ఫాటిడైలినోసిటాల్-ఇమ్మొబిలైజ్డ్ ప్రోటీన్‌లు క్లస్టర్ చేయబడి ప్రత్యేక ఎండోప్లాజమ్‌లుగా వర్గీకరించబడతాయని ఇన్ వివోలో నిరూపించడానికి మేము 3D ఏకకాలిక మల్టీకలర్ హై-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్‌ను నిర్వహిస్తాము. నికర నిష్క్రమణ సైట్, ఇది ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌లు ఉపయోగించే దానికంటే భిన్నంగా ఉంటుంది. అదనంగా, ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం పొరలో సిరమైడ్ యొక్క గొలుసు పొడవు ఈ సార్టింగ్ సెలెక్టివిటీకి కీలకమని మేము చూపిస్తున్నాము. లిపిడ్ గొలుసు పొడవు ఆధారంగా ప్రోటీన్ కార్గోలను సెలెక్టివ్ పాత్వేలో సెలెక్టివ్ ఎక్స్‌పోర్ట్ సైట్‌లుగా వర్గీకరించడానికి మా అధ్యయనం మొదటి ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో ఆధారాలను అందిస్తుంది.
యూకారియోటిక్ కణాలలో, ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం (ER)లో సంశ్లేషణ చేయబడిన ప్రోటీన్లు వాటి తగిన సెల్యులార్ గమ్యస్థానానికి డెలివరీ కోసం స్రవించే మార్గం ద్వారా రవాణా సమయంలో క్రమబద్ధీకరించబడతాయి (1). కోట్-మెడియేటెడ్ సార్టింగ్‌తో పాటు, కొన్ని లిపిడ్‌లు నిర్దిష్ట పొర డొమైన్‌లలో వాటిని క్లస్టర్ చేయడం ద్వారా సెలెక్టివ్ ఎగ్జిట్ పాయింట్లుగా కూడా పనిచేస్తాయని చాలా కాలంగా ఊహించబడింది, ఆ నిర్దిష్ట ప్రోటీన్‌లు (2-5). అయితే, ఈ సాధ్యమయ్యే లిపిడ్-ఆధారిత యంత్రాంగాన్ని నిరూపించడానికి ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో ఆధారాలు ఇప్పటికీ లేవు. ఈ ప్రాథమిక సమస్యను పరిష్కరించడానికి, గ్లైకోసైల్ఫాస్ఫాటిడైలినోసిటాల్ (GPI) యాంకర్డ్ ప్రోటీన్లు (GPI-APలు) ER నుండి ఎలా భిన్నంగా ఎగుమతి చేయబడతాయో మేము ఈస్ట్‌లో అధ్యయనం చేసాము. GPI-APలు వివిధ రకాల లిపిడ్-కనెక్ట్ చేయబడిన సెల్ ఉపరితల ప్రోటీన్లు (6, 7). GPI-AP అనేది గ్లైకోలిపిడ్ భాగం (GPI యాంకర్) ద్వారా ప్లాస్మా పొర యొక్క బయటి కరపత్రాలకు జతచేయబడిన స్రవించే ప్రోటీన్. అవి ER ల్యూమన్‌లో సంప్రదాయవాద పోస్ట్-ట్రాన్స్లేషనల్ సవరణలుగా GPI యాంకర్‌లను అంగీకరిస్తాయి (8). అటాచ్మెంట్ తర్వాత, GPI-AP గోల్గి ఉపకరణం (5, 9) గుండా ER నుండి ప్లాస్మా పొరకు వెళుతుంది. GPI యాంకర్ల ఉనికి GPI-APని ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్‌ల నుండి (ఇతర ప్లాస్మా పొర ప్రోటీన్‌లతో సహా) స్రావ మార్గం వెంట విడిగా రవాణా చేయడానికి కారణమవుతుంది (5, 9, 10). ఈస్ట్ కణాలలో, GPI-APలు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులంలోని ఇతర స్రవించే ప్రోటీన్‌ల నుండి వేరు చేయబడతాయి మరియు తరువాత కోట్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్ II (COPII) (6, 7) ద్వారా చుట్టబడిన ప్రత్యేకమైన వెసికిల్స్‌లో ప్యాక్ చేయబడతాయి. ER ఎగుమతి ప్రక్రియలో ఈ వర్గీకరణ ప్రక్రియ యొక్క నిర్ణాయకాలు అస్పష్టంగా ఉన్నాయి, కానీ ఈ యంత్రాంగానికి లిపిడ్‌లు అవసరం కావచ్చు, ముఖ్యంగా GPI యాంకర్ యొక్క లిపిడ్ భాగం యొక్క నిర్మాణాత్మక పునర్నిర్మాణం (5, 8) అని ఊహించబడింది. ఈస్ట్‌లో, GPI లిపిడ్ పునర్నిర్మాణం GPI అటాచ్ అయిన వెంటనే ప్రారంభమవుతుంది మరియు చాలా సందర్భాలలో, ఇది సిరామైడ్‌ను 26-కార్బన్ లాంగ్-చైన్ సాచురేటెడ్ ఫ్యాటీ యాసిడ్ (C26:0) (11, 12) కు బంధించడానికి కారణమవుతుంది. ఇప్పటివరకు ఈస్ట్ కణాలు ఉత్పత్తి చేసే ప్రధాన సిరమైడ్ C26 సిరమైడ్. ఇది ERలో సంశ్లేషణ చేయబడుతుంది మరియు దానిలో ఎక్కువ భాగం COPII వెసికిల్స్ ద్వారా గోల్గి ఉపకరణానికి ఎగుమతి చేయబడుతుంది (13). GPI-AP యొక్క ER ఎగుమతికి ప్రత్యేకంగా కొనసాగుతున్న సిరమైడ్ సంశ్లేషణ అవసరం (14, 15), మరియు క్రమంగా, గోల్గి ఉపకరణంలో సిరమైడ్‌ను ఇనోసిటాల్ ఫాస్ఫేట్ సిరమైడ్ (IPC)గా మార్చడం GPI యాంకర్ సంశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది (16). కృత్రిమ పొరలతో బయోఫిజికల్ అధ్యయనాలు చాలా పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సిరమైడ్‌లు ప్రత్యేకమైన భౌతిక లక్షణాలతో క్రమబద్ధమైన డొమైన్‌లను ఏర్పరచడానికి కలిసిపోతాయని చూపించాయి (17, 18). ఈ డేటా C26 సిరమైడ్‌తో C26 సిరమైడ్ మరియు GPI-AP సాపేక్షంగా గజిబిజిగా ఉన్న ER పొర లిపిడ్ వాతావరణంలో క్రమబద్ధమైన ప్రాంతాలు లేదా ప్రాంతాలలో కలిసిపోవడానికి వాటి భౌతిక లక్షణాలను ఉపయోగిస్తాయనే పరికల్పనకు దారితీస్తుంది. ఇది ప్రధానంగా చిన్న మరియు అసంతృప్త గ్లిసరోలిపిడ్‌లతో కూడి ఉంటుంది (C16:1 మరియు C18:1) (19, 20). ఈ ప్రాంతాలు నిర్దిష్ట ER నిష్క్రమణ సైట్‌లపై (ERES) ఎంపిక చేయబడతాయి, ఇక్కడ సిరామైడ్ మరియు సిరామైడ్-ఆధారిత GPI-AP లను ఒకే అంకితమైన COPII వెసికిల్ (5)లో గొల్గికి సహ-రవాణా చేయవచ్చు.
ఈ అధ్యయనంలో, సూపర్-రిజల్యూషన్ కన్ఫోకల్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ మైక్రోస్కోపీ (SCLIM) ను ఉపయోగించి ఈ లిపిడ్-ఆధారిత యంత్రాంగాన్ని మేము నేరుగా పరీక్షించాము, ఇది ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లను ఏకకాలంలో గమనించగల అత్యాధునిక మైక్రోస్కోపీ టెక్నిక్. త్రి-రంగు మరియు త్రిమితీయ (3D) చిత్రాలు జీవన కణాలలో చాలా అధిక రిజల్యూషన్ మరియు వేగాన్ని కలిగి ఉంటాయి (21, 22).
S. cerevisiae లో ER నుండి నిష్క్రమించిన తర్వాత ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్ల నుండి C26 సెరామైడ్ సమూహంతో సాధారణ GPI-AP ఎలా పరీక్షించబడిందో మరింత నిర్వచించడానికి మేము మొదట SCLIM సాంకేతికతను ఉపయోగించాము. ER యొక్క వర్గీకరణను తనిఖీ చేయడానికి, ERES ఇన్ వివోలోకి కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన కార్గోను నేరుగా దృశ్యమానం చేయగల జన్యు వ్యవస్థను ఉపయోగించాము (7, 23). కార్గోగా, మేము గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) తో లేబుల్ చేయబడిన C26 సెరామైడ్-ఆధారిత GPI-AP గ్యాస్ 1 మరియు నియర్-ఇన్‌ఫ్రారెడ్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (iRFP) తో లేబుల్ చేయబడిన ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్ Mid2 ను ఎంచుకున్నాము, రెండూ ప్లాస్మా పొరను లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి (24–26). sec31-1 ఉష్ణోగ్రత-సెన్సిటివ్ మ్యూటాంట్‌లో, ఈ రెండు కార్గోలు గెలాక్టోస్-ప్రేరేపించదగిన ప్రమోటర్ మరియు కాన్‌స్టిట్యూటివ్ ERES మార్కర్ కింద వ్యక్తీకరించబడతాయి. తీవ్ర ఉష్ణోగ్రత వద్ద (37°C), sec31-1 మ్యుటేషన్ COPII అంకురోత్పత్తి మరియు ER ఎగుమతిని నిరోధించడానికి COPII కోటు భాగం Sec31 యొక్క పనితీరును ప్రభావితం చేస్తుంది కాబట్టి, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన కార్గో ER వద్ద పేరుకుపోతుంది (23). తక్కువ ఉష్ణోగ్రత (24°C) కు చల్లబడిన తర్వాత, sec31-1 ఉత్పరివర్తన కణాలు స్రావ ప్రాంతం నుండి కోలుకున్నాయి మరియు పేరుకుపోయిన కొత్త సింథటిక్ కార్గోను ER నుండి ఎగుమతి చేయడం ప్రారంభించాయి. CLIM విజువలైజేషన్ ప్రకారం, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP 37°C వద్ద పొదిగిన తర్వాత కూడా sec31-1 ఉత్పరివర్తన కణాల ERలో పేరుకుపోయి, ఆపై 24°C వద్ద 5 నిమిషాలు విడుదల చేయబడ్డాయి (మూర్తి 1). Mid2-iRFP మొత్తం ER పొరపై పంపిణీ చేయబడుతుంది మరియు Gas1-GFP నిరంతరాయ ER పొర ప్రాంతంలో కేంద్రీకృతమై సేకరించబడుతుంది కాబట్టి, వాటి పంపిణీ పూర్తిగా భిన్నంగా ఉంటుంది (మూర్తి 1, A నుండి C మరియు మూవీ S1). అదనంగా, చిత్రం 1Dలో చూపినట్లుగా, Gas1-GFP క్లస్టర్‌లో Mid2-iRFP లేదు. ఈ ఫలితాలు GPI-AP మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌లను ముందుగానే వేర్వేరు ER పొర ప్రాంతాలుగా వేరు చేశాయని సూచిస్తున్నాయి. Gas1-GFP క్లస్టర్ mCherry యొక్క COPII కోట్ ప్రోటీన్ Sec13 (మూర్తి 1, E మరియు F, మరియు మూవీ S1) (23) తో లేబుల్ చేయబడిన నిర్దిష్ట ERES కి ఆనుకొని ఉంటుంది.
sec31-1 కణాలు గెలాక్టోస్-ప్రేరిత స్రావాలను, పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు (C26) సెరామైడ్ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్ Mid2-iRFP (TMP, నీలం) ను వ్యక్తపరుస్తాయి మరియు ఈ నిర్మాణాత్మక ERES లేబులింగ్ Sec13-mCherry (ERES, మెజెంటా) ను 37°C వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించి, 24°Cకి తరలించి, 5 నిమిషాల తర్వాత SCLIM ద్వారా చిత్రీకరించబడింది. (A నుండి C) ఒక విమానం (A) యొక్క ప్రతినిధి విలీనం చేయబడిన లేదా ఒకే 2D చిత్రం, 10 z-విభాగాల (B) 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రం లేదా కార్గో మరియు ERES మార్కర్ల (C) యొక్క 3D సెల్ అర్ధగోళ చిత్రం చూపిస్తుంది. స్కేల్ బార్ 1μm (A మరియు B). స్కేల్ యూనిట్ 0.551μm (C). Gas1-GFP వివిక్త ER ప్రాంతాలు లేదా క్లస్టర్‌లలో కనుగొనబడింది, అయితే Mid2-iRFP గుర్తించబడింది మరియు ER పొర (C) అంతటా పంపిణీ చేయబడింది. (D) గ్రాఫ్ Gas1-GFP క్లస్టర్‌లో Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP యొక్క సాపేక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను తెల్ల బాణం రేఖ (ఎడమ) వెంట చూపిస్తుంది. AU, ఏకపక్ష యూనిట్. (E మరియు F) వస్తువులు మరియు ERES గుర్తును కలిపే 3D చిత్రాన్ని సూచిస్తాయి. నిర్దిష్ట ERES దగ్గర Gas1-GFP క్లస్టర్‌లు కనుగొనబడ్డాయి. స్కేల్ యూనిట్ 0.551μm. (F) తెల్లటి ఘన బాణం ERESతో అనుబంధించబడిన Gas1-GFP క్లస్టర్‌ను సూచిస్తుంది. మధ్య మరియు కుడి ప్యానెల్‌లు విలీనం చేయబడిన విస్తరించిన 3D చిత్రాన్ని మరియు ఎంచుకున్న Gas1-GFP క్లస్టర్ యొక్క భ్రమణ వీక్షణను చూపుతాయి.
Gas1-GFP క్లస్టర్ మరియు నిర్దిష్ట ERES మధ్య ఉన్న దగ్గరి ప్రాదేశిక సంబంధం, Gas1-GFP సెలెక్టివ్ ERESలోకి ప్రవేశించగలదని సూచిస్తుంది, ఇది Mid2-iRFP ER నుండి నిష్క్రమించడానికి ఉపయోగించే సెలెక్టివిటీకి భిన్నంగా ఉంటుంది. ఈ అవకాశాన్ని పరిష్కరించడానికి, మేము ఒకటి లేదా రెండు వస్తువులకు మాత్రమే ERES నిష్పత్తిని లెక్కించాము (మూర్తి 2, A నుండి C వరకు). చాలా ERES (70%) ఒకే రకమైన కార్గోను కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము. Figure 2C యొక్క దిగువ చిత్రం Gas1-GFP (మూర్తి 1) లేదా Mid2-iRFP (మూర్తి 2) మాత్రమే ఉన్న ERES యొక్క రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపిస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, దాదాపు 20% ERES ఒకే ప్రాంతంలో అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రెండు కార్గోలను కలిగి ఉంది. కొన్ని ERES (10%) రెండు రకాల కార్గోను కలిగి ఉన్నాయని కనుగొనబడింది, కానీ అవి స్పష్టంగా వేర్వేరు ప్రాంతాలలో వేరుచేయబడ్డాయి. అందువల్ల, ER ఎగుమతి చేయబడిన తర్వాత, GPI-AP Gas1-GFP మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గో Mid2-iRFP వేర్వేరు ERES (మూర్తి 2D) గా విభజించబడ్డాయని ఈ గణాంక విశ్లేషణ చూపిస్తుంది. ఈ క్రమబద్ధీకరణ సామర్థ్యం మునుపటి జీవరసాయన విశ్లేషణ (6) మరియు పదనిర్మాణ నిర్ధారణ (7) తో చాలా స్థిరంగా ఉంటుంది. ERES (Figure 2E మరియు Movie S2) లోకి ప్రవేశించే క్వారంటైన్ చేయబడిన కార్గో ప్రవర్తనను కూడా మనం గమనించవచ్చు. Gas1-GFP (ప్యానెల్ 3) లేదా Mid2-iRFP (ప్యానెల్ 4) యొక్క చిన్న భాగం మాత్రమే ERESలోకి ఒక వైపు నుండి ప్రవేశిస్తుందని మరియు వివిక్త ప్రాంతంలో పరిమితం చేయబడిందని Figure 2E చూపిస్తుంది. Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP కొన్నిసార్లు ఒకే ERESలో కనిపిస్తాయని Figure 2E యొక్క ప్యానెల్ 5 చూపిస్తుంది, కానీ అవి వేర్వేరు వైపుల నుండి ప్రవేశిస్తాయి మరియు వేర్వేరు COPII వెసికిల్స్‌ను సూచించే ప్రత్యేక ప్రాంతాలలో కేంద్రీకృతమై ఉంటాయి. సెలెక్టివ్ ERESగా C26 సెరామైడ్-ఆధారిత GPI-AP Gas1 యొక్క గమనించిన విభజన మరియు వర్గీకరణ నిర్దిష్టంగా ఉందని కూడా మేము నిర్ధారించాము ఎందుకంటే మరొక ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావం కార్గో, GFP-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్లాస్మా మెమ్బ్రేన్ ప్రోటీన్ Axl2 (27), Mid2-iRFPకి సమానమైన ప్రవర్తనను చూపుతుంది. (చిత్రం S1 మరియు మూవీ S3). కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Axl2-GFP Mid2-iRFP (Figure S1, A మరియు B) వంటి ER పొర ద్వారా పంపిణీ చేయబడుతుంది మరియు చాలా ERES లలో Mid2-iRFP తో సహ-స్థానికీకరించబడుతుంది (Figure S1, B నుండి D వరకు). Figure 1 లోని ప్యానెల్‌లు 1 మరియు 2. S1C రెండు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గోలు అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ERES యొక్క రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపిస్తుంది. ఈ సందర్భాలలో, రెండు వస్తువులు కలిసి ERESలోకి ప్రవేశిస్తాయి (Figure S1E, Panel 3 మరియు Movie S3).
గెలాక్టోస్ ప్రేరేపిత స్రావాలను వ్యక్తీకరించే sec31-1 కణాలు, Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (TMP, నీలం) మరియు కాన్‌స్టిట్యూటివ్ ERES లేబులింగ్ Sec13-mCherry (ERES, మెజెంటా) 37 వద్ద ఉంచబడ్డాయి. °C వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగిన తర్వాత, స్రావం బ్లాక్‌ను విడుదల చేయడానికి 24 °Cకి తరలించి, 20 నిమిషాల తర్వాత SCLIMతో చిత్రాన్ని రూపొందించండి. (A నుండి C) కార్గో యొక్క ప్రతినిధి 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రాలు (A; స్కేల్ బార్, 1μm) లేదా 3D సెల్ అర్ధగోళ చిత్రాలు (B మరియు C; స్కేల్ యూనిట్, 0.456μm) మరియు ERES ద్వారా గుర్తించబడిన 10 z-విభాగాలు. (B)లోని దిగువ ప్యానెల్ మరియు (C)లోని ప్యానెల్ ERES (మెజెంటా)లో ఉన్న వస్తువులను మాత్రమే ప్రదర్శించడానికి ప్రాసెస్ చేయబడిన చిత్రాలను ప్రదర్శిస్తాయి [Gas1-GFP (బూడిద) మరియు Mid2-iRFP (లేత నీలం)]. (C) ఓపెన్ బాణం: ERES ఒక కార్గో ముక్కను మాత్రమే తీసుకువెళుతుంది (1 నుండి 4). బూడిద బాణం: ERES వేరు చేయబడిన కార్గోను కలిగి ఉంటుంది (5). తెల్లటి ఘన బాణం: సహ-స్థానిక కార్గోను కలిగి ఉన్న ERES. క్రింద: ఎంచుకున్న సింగిల్ ERESలో Gas1-GFP (1) లేదా Mid2-iRFP (2) మాత్రమే ఉంటాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm. (D) (C)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. ఒకే కార్గో (Gas1-GFP లేదా Mid2-iRFP), వేరు చేయబడిన కార్గో మరియు అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గోను కలిగి ఉన్న ERES యొక్క సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, 54 కణాలలో n=432. ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోక జత చేయని t పరీక్ష. *** P = 0.0002. (E) (C)తో గుర్తించబడిన క్వారంటైన్ చేయబడిన కార్గో యొక్క ఎంచుకున్న ERES యొక్క 3D చిత్రం. Gas1-GFP (ఆకుపచ్చ) (3) లేదా Mid2-iRFP (నీలం) (4) ఒక వైపు నుండి ERES (మెజెంటా)లోకి ప్రవేశిస్తుంది మరియు ERESలోని ఒక చిన్న ప్రాంతానికి పరిమితం చేయబడింది. కొన్నిసార్లు, రెండు రకాల కార్గోలు ఒకే వైపు నుండి ఒకే ERES (5) లోకి ప్రవేశిస్తాయి మరియు ERES లోపల ఒక వివిక్త ప్రాంతానికి పరిమితం చేయబడతాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm.
తరువాత, ER పొరలో ఉన్న పొడవైన అసిల్ గొలుసు సిరమైడ్ (C26) గ్యాస్ 1 యొక్క నిర్దిష్ట క్లస్టరింగ్ మరియు సార్టింగ్‌ను సెలెక్టివ్ ERES లోకి నడిపిస్తుందనే పరికల్పనను మేము పరీక్షించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మేము సవరించిన ఈస్ట్ జాతి GhLag1 ను ఉపయోగించాము, దీనిలో రెండు ఎండోజెనస్ సిరమైడ్ సింథేస్‌లు Lag1 మరియు Lac1 లను GhLag1 (పత్తి యొక్క Lag1 హోమోలాగ్) ద్వారా భర్తీ చేశారు, దీని ఫలితంగా వైల్డ్ రకం కంటే చిన్న కణ త్వచం కలిగిన సెరమైడ్ జాతితో ఈస్ట్ జాతి ఏర్పడింది (మూర్తి 3A) (28). మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) విశ్లేషణ వైల్డ్-టైప్ జాతులలో, మొత్తం సిరమైడ్‌లో 95% చాలా పొడవుగా (C26) చైన్ సిరమైడ్ అని, GhLag1 లో, సిరమైడ్‌లో 85% చాలా పొడవుగా (C18 మరియు C16) ఉందని చూపించింది. ), సిరమైడ్‌లో 2% మాత్రమే చాలా పొడవుగా (C26) చైన్ సిరమైడ్. GhLag1 పొరలో ఇప్పటివరకు కనుగొనబడిన ప్రధాన సిరమైడ్‌లు C18 మరియు C16 సిరమైడ్‌లు అయినప్పటికీ, GhLag1 జాతిలో వ్యక్తీకరించబడిన Gas1-GFP యొక్క GPI యాంకర్‌లో C26 సిరమైడ్ ఉందని MS విశ్లేషణ నిర్ధారించింది, ఇది వైల్డ్-టైప్ లిపిడ్‌లతో పోల్చదగినది. నాణ్యత ఒకేలా ఉంటుంది (Fig. 3A) (26). అందువల్ల, దీని అర్థం సిరమైడ్ పునర్నిర్మాణ ఎంజైమ్ Cwh43 C26 సిరమైడ్ కోసం చాలా ఎంపిక చేయబడింది, చిత్రం 26లో చూపిన విధంగా, ఇది GhLag1 జాతిలో తక్కువ మొత్తంలో C26 సిరమైడ్ నుండి GPI యాంకర్‌ను ప్రాధాన్యతగా కలుపుతుంది. S2 (29). అయినప్పటికీ, GhLag1 యొక్క కణ త్వచం ప్రాథమికంగా C18-C16 సిరమైడ్‌ను మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది, అయితే Gas1-GFP ఇప్పటికీ C26 సిరమైడ్‌ను కలిగి ఉంటుంది. ఈ వాస్తవం ఈ జాతిని ERలో పొర సిరమైడ్ యొక్క ఎసిల్ గొలుసు పొడవు సమస్యను ప్రత్యేకంగా పరిష్కరించడానికి ఒక ఆదర్శ సాధనంగా చేస్తుంది. తరగతి మరియు క్రమబద్ధీకరణ యొక్క ఊహాత్మక పాత్ర. తరువాత, మేము మొదట సాంప్రదాయిక ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా ఉష్ణోగ్రత-సున్నితమైన ఉత్పరివర్తన యుగ్మ వికల్పంతో GhLag1 లోని క్లస్టర్లలో C26 Gas1-GFP పేరుకుపోయే సామర్థ్యాన్ని అధ్యయనం చేసాము, ఇక్కడ పొడవైన (C18-C16) గొలుసు మాత్రమే ER పొర సెరామైడ్‌లో ఉంటుంది (Fig. 3). sec31-1 లో, Gas1-GFP లో ఎక్కువ భాగం క్లస్టర్లలో కేంద్రీకృతమై ఉందని మేము గమనించాము, అయితే sec31-1 లో పొడవైన (C18-C16) పొడవైన సిరామైడ్ ER పొరతో Gas1-GFP GhLag1 ప్రధానంగా మొత్తం ER పొరలో క్లస్టర్ చేయబడి పంపిణీ చేయబడలేదు. ఖచ్చితంగా చెప్పాలంటే, C26 సిరామైడ్-ఆధారిత క్లస్టరింగ్ నిర్దిష్ట ERES (Figure 1) కు దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉన్నందున, ఈ ప్రక్రియ ER ఎగుమతి ప్రోటీన్ యంత్రాంగం యొక్క పనితీరును కూడా కలిగి ఉండవచ్చో లేదో మేము తరువాత పరిశోధించాము. GPI-AP ER ఎగుమతి కోసం ప్రత్యేక COPII వ్యవస్థను ఉపయోగిస్తుంది, ఇది GPI యాంకర్ యొక్క గ్లైకాన్ భాగం యొక్క Ted1 యొక్క నిర్మాణాత్మక పునర్నిర్మాణం ద్వారా చురుకుగా నియంత్రించబడుతుంది (30, 31). తరువాత రీకాంబినెంట్ GPI-గ్లైకాన్‌ను ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గో రిసెప్టర్ p24 కాంప్లెక్స్ గుర్తిస్తుంది, ఇది Lst1 ను ఎంపిక చేసి నియమిస్తుంది, ఇది ప్రధాన COPII కార్గో బైండింగ్ సబ్యూనిట్ Sec24 యొక్క నిర్దిష్ట ఐసోఫామ్, GPI-AP-రిచ్ COPII వెసికిల్స్‌ను ఏర్పరుస్తుంది (31-33). అందువల్ల, ఈ సింగిల్ ప్రోటీన్‌ల తొలగింపును (p24 కాంప్లెక్స్ కాంపోనెంట్ Emp24, GPI-గ్లైకాన్ రీమోడలింగ్ ఎంజైమ్ Ted1 మరియు నిర్దిష్ట COPII సబ్యూనిట్ Lst1) sec31-1 మ్యూటెంట్ స్ట్రెయిన్‌తో కలిపి డబుల్ మ్యూటాంట్‌ను నిర్మించాము మరియు వాటిని అధ్యయనం చేసాము. Gas1-క్లస్టర్ GFP (మూర్తి 3) ను ఏర్పరచడం సాధ్యమేనా అని మేము గమనించాము. sec31-1emp24Δ మరియు sec31-1ted1Δ లలో, Gas1-GFP ప్రధానంగా అన్‌క్లస్టర్ చేయబడి ER పొర అంతటా పంపిణీ చేయబడిందని మేము గమనించాము, గతంలో sec31-1 GhLag1 లో చూసినట్లుగా, sec31-1lst1Δ లో, Gas1-GFP sec31-1 లాగా. ఈ ఫలితాలు ER పొరలో C26 సెరామైడ్ ఉనికితో పాటు, Gas1-GFP యొక్క క్లస్టరింగ్ కూడా p24 కాంప్లెక్స్‌కు బంధించాల్సిన అవసరం ఉందని మరియు నిర్దిష్ట Lst1 నియామకం అవసరం లేదని సూచిస్తున్నాయి. అప్పుడు, ER పొరలోని సిరామైడ్ యొక్క గొలుసు పొడవు Gas1-GFP యొక్క p24 కు బంధించడాన్ని నియంత్రించగల అవకాశాన్ని మేము అన్వేషించాము. అయితే, పొరలో C18-C16 సెరామైడ్ ఉనికి p24 కాంప్లెక్స్ ద్వారా పునర్నిర్మించబడిన GPI-గ్లైకాన్‌లను ప్రభావితం చేయదని లేదా GPI-APకి బంధించడం మరియు GPI-APని ఎగుమతి చేయడాన్ని ప్రభావితం చేయదని మేము కనుగొన్నాము. సామర్థ్యాన్ని COPII సబ్టైప్ Lst1ని నియమించుకోండి (చిత్రం S4C). అందువల్ల, C26 సెరామైడ్-ఆధారిత క్లస్టరింగ్‌కు వివిధ ER ఎగుమతి ప్రోటీన్ విధానాలతో ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు అవసరం లేదు, కానీ లిపిడ్ పొడవు ద్వారా నడిచే ప్రత్యామ్నాయ సార్టింగ్ మెకానిజానికి మద్దతు ఇస్తుంది. అప్పుడు, ER పొరలోని సిరామైడ్ ఎసిల్ గొలుసు పొడవు Gas1-GFP యొక్క సెలెక్టివ్ ERESగా ప్రభావవంతమైన వర్గీకరణకు ముఖ్యమైనదా అని మేము విశ్లేషించాము. షార్ట్-చైన్ సిరమైడ్‌తో కూడిన GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లోని Gas1, ER నుండి నిష్క్రమించి ప్లాస్మా పొరలోకి ప్రవేశిస్తుంది (మూర్తి S5), సెరమైడ్ ఎసిల్ గొలుసు పొడవు ద్వారా క్రమబద్ధీకరణ జరిగితే, GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లోని Gas1ని దారి మళ్లించి దాటవచ్చని మేము విశ్వసిస్తున్నాము. అదే పొరతో ERES వస్తువులు.
(ఎ) GhLag1 యొక్క కణ పొర ప్రధానంగా చిన్న C18-C16 సిరమైడ్‌లను కలిగి ఉంటుంది, అయితే Gas1-GFP యొక్క GPI యాంకర్ ఇప్పటికీ వైల్డ్-టైప్ కణాల మాదిరిగానే C26 IPCని కలిగి ఉంటుంది. పైన: మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) ద్వారా వైల్డ్-టైప్ (Wt) మరియు GhLag1p జాతుల కణ పొరలో సిరమైడ్ యొక్క ఎసిల్ చైన్ పొడవు విశ్లేషణ. డేటా మొత్తం సిరమైడ్ శాతాన్ని సూచిస్తుంది. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు. ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకలు జతచేయని t పరీక్ష. **** P ＜0.0001. దిగువ ప్యానెల్: వైల్డ్-టైప్ మరియు GhLag1p జాతులలో వ్యక్తీకరించబడిన Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI యాంకర్‌లో ఉన్న IPC యొక్క ఎసిల్ చైన్ పొడవు యొక్క MS విశ్లేషణ. డేటా మొత్తం IPC సిగ్నల్ శాతాన్ని సూచిస్తుంది. ఐదు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు. ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకలు జతచేయని t పరీక్ష. ns, ముఖ్యమైనది కాదు. P = 0.9134. (B) గెలాక్టోస్-ప్రేరిత Gas1-GFPని వ్యక్తీకరించే sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ మరియు sec31-1lst1Δ కణాల ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లను 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, 24°C తర్వాత రొటీన్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీని నిర్వహించడానికి పంపారు. తెల్ల బాణం: ER Gas1-GFP క్లస్టర్. ఓపెన్ బాణం: అన్‌క్లస్టర్డ్ గ్యాస్1-GFP మొత్తం ER పొరపై పంపిణీ చేయబడుతుంది, ఇది ER లక్షణమైన న్యూక్లియర్ రింగ్ స్టెయినింగ్‌ను చూపుతుంది. స్కేల్ బార్, 5μm. (C) (B)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. పంక్టేట్ Gas1-GFP నిర్మాణంతో కణాల సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, n≥300 కణాలు. ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకలు జత చేయని t పరీక్ష. **** P ＜0.0001.
ఈ సమస్యను నేరుగా పరిష్కరించడానికి, మేము sec31-1 ఉష్ణోగ్రత-సెన్సిటివ్ మ్యూటాంట్ అల్లెల్ (మూర్తి 4 మరియు మూవీ S4) తో GhLag1 లో Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP యొక్క SCLIM విజువలైజేషన్‌ను నిర్వహించాము. ER ను 37°C వద్ద నిలుపుకున్న తర్వాత మరియు తరువాత 24°C వద్ద విడుదల చేసిన తర్వాత, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFP చాలావరకు ER పొర అంతటా క్లస్టర్ చేయబడి పంపిణీ చేయబడలేదు, సాంప్రదాయ సూక్ష్మదర్శిని ద్వారా గమనించబడింది (మూర్తి 4, A మరియు B). అదనంగా, ERES (67%) లో ఎక్కువ శాతం దానిలో సహ-స్థానంలో ఉన్న రెండు రకాల కార్గోను కలిగి ఉంటుంది (మూర్తి 4D). Figure 4C యొక్క ప్యానెల్లు 1 మరియు 2 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న Gas1-GFP మరియు Mid2-GFP తో ERES యొక్క రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపుతాయి. అదనంగా, రెండు వస్తువులు ఒకే ERES లోకి నియమించబడ్డాయి (మూర్తి 4E, ప్యానెల్ 3 మరియు మూవీ S4). అందువల్ల, ER పొరలోని సిరామైడ్ ఎసిల్ గొలుసు యొక్క పొడవు ER ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్ మరియు వర్గీకరణ యొక్క ముఖ్యమైన నిర్ణయాధికారి అని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
గెలాక్టోస్-ప్రేరిత స్రావాలను వ్యక్తీకరించే Sec31-1 GhLag1 కణాలు, Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (TMP, నీలం) మరియు కాన్‌స్టిట్యూటివ్ ERES-లేబుల్ చేయబడిన Sec13-mCherry (ERES, మెజెంటా) 37°C వద్ద పొదిగేవి. 30 నిమిషాలు కొనసాగించండి, స్రావాలను విడుదల చేయడానికి 24°Cకి తగ్గించండి మరియు 20 నిమిషాల తర్వాత SCLIMతో చిత్రాన్ని ఉంచండి. (A నుండి C) కార్గో మరియు ERES ద్వారా గుర్తించబడిన 10 z-విభాగాల యొక్క ప్రతినిధి 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రాలు (A; స్కేల్ బార్, 1μm) లేదా 3D సెల్ అర్ధగోళ చిత్రాలు (B మరియు C; స్కేల్ యూనిట్, 0.45μm). (B)లోని దిగువ ప్యానెల్ మరియు (C)లోని ప్యానెల్ ERES (మెజెంటా)లో ఉన్న వస్తువులను మాత్రమే ప్రదర్శించడానికి ప్రాసెస్ చేయబడిన చిత్రాలను ప్రదర్శిస్తాయి [Gas1-GFP (బూడిద) మరియు Mid2-iRFP (లేత నీలం)]. (C) తెల్లగా నిండిన బాణం: ERES, వస్తువులు అతివ్యాప్తి చెందుతాయి. ఓపెన్ బాణం: ERESలో ఒకే ఒక అంశం ఉంటుంది. దిగువ ప్యానెల్: ఎంచుకున్న ERESలో (C)లో గుర్తించబడిన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న వస్తువులు (1 మరియు 2) ఉన్నాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm. (D) (C)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. sec31-1 మరియు sec31-1 GhLag1 యూనిట్లలో, ఒక కార్గో (Gas1-GFP లేదా Mid2-iRFP) మాత్రమే చేర్చబడింది మరియు ఐసోలేటెడ్ కార్గో మరియు అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గో కోసం ERES యొక్క సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, n = 54 సెల్‌లలో (sec31-1) మరియు n = 47 సెల్‌లలో (sec31-1 GhLag1). ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకలు జత చేయని t పరీక్ష. *** P = 0.0002 (sec31-1) మరియు ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) లో గుర్తించబడిన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గో (3) తో ఎంచుకున్న ERES యొక్క 3D చిత్రం. Gas1-GFP (ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (నీలం) ఒకే వైపు నుండి ERES (మెజెంటా) వద్దకు చేరుకుంటాయి మరియు అదే ERES నిరోధిత ప్రాంతంలో ఉంటాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm.
ఈ అధ్యయనం లిపిడ్-ఆధారిత ప్రోటీన్ కార్గోలను రహస్య మార్గంలో ఎంపిక చేసిన ఎగుమతి ప్రదేశాలుగా వర్గీకరించిందని ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో ఆధారాలను అందిస్తుంది మరియు వర్గీకరణ ఎంపిక కోసం ఎసిల్ గొలుసు పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను వెల్లడిస్తుంది. SCLIM అని పిలువబడే శక్తివంతమైన మరియు అత్యాధునిక మైక్రోస్కోపీ టెక్నిక్‌ని ఉపయోగించి, మేము ఈస్ట్‌లో కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFP (చాలా పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు (C26) సిరామైడ్ లిపిడ్ భాగంతో కూడిన ప్రధాన ప్లాస్మా పొర GPI-AP)ని ప్రదర్శించాము. వివిక్త ERలలో క్లస్టర్ చేయబడిన ప్రాంతాలు నిర్దిష్ట ERESతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి, అయితే ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్లు ER పొర అంతటా పంపిణీ చేయబడతాయి (మూర్తి 1). అదనంగా, ఈ రెండు రకాల వస్తువులు వేర్వేరు ERESలోకి ఎంపికగా ప్రవేశిస్తాయి (మూర్తి 2). పొరలోని సెల్యులార్ సిరామైడ్ యొక్క ఎసిల్ గొలుసు పొడవు C26 నుండి C18-C16కి తగ్గించబడుతుంది, Gas1-GFP క్లస్టర్ వివిక్త ER ప్రాంతంలోకి అంతరాయం కలిగిస్తుంది మరియు Gas1-GFP అదే ERES ద్వారా ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌తో ER నుండి నిష్క్రమించడానికి తిరిగి మళ్ళించబడుతుంది (మూర్తి 3 మరియు చిత్రం 3). 4).
ER నుండి నిష్క్రమించడానికి GPI-AP ఒక ప్రత్యేకమైన ప్రోటీన్ యంత్రాంగాన్ని ఉపయోగిస్తున్నప్పటికీ, C26 సెరామైడ్-ఆధారిత విభజన ERES స్పెషలైజేషన్‌కు దారితీసే అవకలన ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలపై ఆధారపడదని మేము కనుగొన్నాము (చిత్రాలు S4 మరియు S5). బదులుగా, మా పరిశోధనలు లిపిడ్-ఆధారిత ప్రోటీన్ క్లస్టరింగ్ మరియు ఇతర కార్గోలను మినహాయించడం ద్వారా నడిచే ప్రత్యామ్నాయ వర్గీకరణ యంత్రాంగానికి మద్దతు ఇస్తాయి. మా పరిశీలనలు Gas1-GFP ప్రాంతం లేదా నిర్దిష్ట ERESతో అనుబంధించబడిన క్లస్టర్‌లో ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్ Mid2-iRFP లేదని సూచిస్తున్నాయి, ఇది C26 సెరామైడ్-ఆధారిత GPI-AP క్లస్టర్ సంబంధిత ERESలోకి ప్రవేశించడానికి దోహదపడుతుందని మరియు అదే సమయంలో, ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్‌ను మినహాయించాలని సూచిస్తుంది. స్రావాలు ఈ నిర్దిష్ట ERESలోకి ప్రవేశిస్తాయి (చిత్రాలు 1 మరియు 2). దీనికి విరుద్ధంగా, ER పొరలో C18-C16 సెరామైడ్‌ల ఉనికి GPI-AP ప్రాంతాలు లేదా సమూహాలను ఏర్పరచడానికి కారణం కాదు, కాబట్టి అవి ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రవించే ప్రోటీన్‌లను అదే ERESలోకి మినహాయించవు లేదా భర్తీ చేయవు (చిత్రాలు 3 మరియు 4). . అందువల్ల, నిర్దిష్ట ERES తో అనుసంధానించబడిన ప్రోటీన్ల క్లస్టరింగ్‌ను సులభతరం చేయడం ద్వారా C26 సెరామైడ్ విభజన మరియు వర్గీకరణను నడిపిస్తుందని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము.
ఒక నిర్దిష్ట ER ప్రాంతంలో ఈ C26 సిరమైడ్-ఆధారిత క్లస్టరింగ్‌ను ఎలా సాధించాలి? పొర సిరమైడ్ పార్శ్వంగా విడిపోయే ధోరణి GPI-AP మరియు C26 సిరమైడ్ చిన్న మరియు తక్షణమే ఆర్డర్ చేయబడిన లిపిడ్‌లను ఏర్పరచడానికి కారణం కావచ్చు, ఇవి చిన్న మరియు అసంతృప్త గ్లిసరోలిపిడ్‌లను కలిగి ఉన్న ER పొర యొక్క మరింత క్రమరహిత లిపిడ్ వాతావరణంలో ఉంటాయి. నాణ్యమైన క్లస్టర్‌లు (17, 18). ఈ చిన్న తాత్కాలిక క్లస్టర్‌లను p24 కాంప్లెక్స్‌కు బంధించిన తర్వాత పెద్ద, మరింత స్థిరమైన క్లస్టర్‌లుగా మరింత విలీనం చేయవచ్చు (34). దీనికి అనుగుణంగా, C26 Gas1-GFP పెద్ద కనిపించే క్లస్టర్‌లను ఏర్పరచడానికి p24 కాంప్లెక్స్‌తో సంకర్షణ చెందాల్సిన అవసరం ఉందని మేము చూపించాము (చిత్రం 3). p24 కాంప్లెక్స్ అనేది ఈస్ట్ (35)లోని నాలుగు వేర్వేరు p24 ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌లతో కూడిన హెటెరోజైగస్ ఒలిగోమర్, ఇది మల్టీవాలెంట్ బైండింగ్‌ను అందిస్తుంది, ఇది చిన్న GPI-AP క్లస్టర్‌ల క్రాస్-లింకింగ్‌కు దారితీస్తుంది, తద్వారా పెద్ద స్థిరమైన క్లస్టర్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తుంది (34). GPI-AP ల యొక్క ప్రోటీన్ ఎక్టోడొమైన్‌ల మధ్య పరస్పర చర్య కూడా వాటి సముదాయానికి దోహదం చేస్తుంది, క్షీరద ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాలలో వాటి గోల్గి రవాణా సమయంలో చూపబడింది (36). అయితే, C18-C16 సెరామైడ్ ER పొరలో ఉన్నప్పుడు, p24 కాంప్లెక్స్ Gas1-GFP కి బంధించినప్పుడు, పెద్ద ప్రత్యేక సమూహాలు ఏర్పడవు. అంతర్లీన యంత్రాంగం పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సిరామైడ్ యొక్క నిర్దిష్ట భౌతిక మరియు రసాయన లక్షణాలపై ఆధారపడి ఉండవచ్చు. కృత్రిమ పొరల యొక్క బయోఫిజికల్ అధ్యయనాలు పొడవైన (C24) మరియు చిన్న (C18-C16) ఎసిల్ గొలుసు సిరామైడ్‌లు రెండూ దశ విభజనకు కారణమవుతున్నప్పటికీ, పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సిరామైడ్‌లు (C24) మాత్రమే అధిక వక్రత మరియు ఫిల్మ్ బెండింగ్‌ను ప్రోత్సహించి ఫిల్మ్‌ను తిరిగి ఆకృతి చేయగలవని చూపిస్తున్నాయి. పరస్పర సూచన ద్వారా (17, 37, 38). Emp24 యొక్క మానవ హోమోలాగ్ అయిన TMED2 యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్, సైటోప్లాస్మిక్ లోబుల్స్‌లో C18 సిరామైడ్-ఆధారిత స్పింగోమైలిన్‌తో ఎంపిక చేసుకుని సంకర్షణ చెందుతుందని చూపబడింది (39). మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ (MD) సిమ్యులేషన్‌లను ఉపయోగించి, C18 మరియు C26 సిరామైడ్‌లు రెండూ Emp24 ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ లోబుల్స్ చుట్టూ పేరుకుపోతాయని మరియు వాటికి సారూప్య ప్రాధాన్యతలు ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (చిత్రం S6). Emp24 యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ పొరలో లిపిడ్‌ల అసమాన పంపిణీకి దారితీస్తుందని ఇది సూచిస్తుందని గమనించాలి. ఇది క్షీరద కణాల ఆధారంగా ఇటీవలి ఫలితం. ఇలాంటి MD సిమ్యులేషన్‌లు ఈథర్ లిపిడ్‌ల ఉనికిని కూడా చూపుతాయి (40). అందువల్ల, ER26 యొక్క రెండు లోబుల్స్‌లో C26 సిరామైడ్ స్థానికంగా సమృద్ధిగా ఉందని మేము ఊహిస్తున్నాము. లూమినల్ లోబుల్స్‌లోని GPI-AP నేరుగా మల్టీవాలెంట్ p24 తో బంధించినప్పుడు మరియు సైటోప్లాస్మిక్ లోబుల్స్‌లో p24 చుట్టూ C26 సెరామైడ్ పేరుకుపోయినప్పుడు, అది దానితో పాటు వచ్చే ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది మరియు పొర వక్రత వేళ్ల ద్వారా ఉత్పత్తి అవుతుంది (41), దీని వలన GPI-AP ERES ప్రక్కనే ఉన్న వివిక్త ప్రాంతాలుగా విడిపోతుంది, ఇది ER పొర యొక్క అత్యంత వక్ర ప్రాంతాలకు కూడా అనుకూలంగా ఉంటుంది (42). మునుపటి నివేదికలు ప్రతిపాదిత యంత్రాంగాన్ని సమర్థించాయి (43, 44). ప్లాస్మా పొరపై ఒలిగోలెక్టిన్లు, వ్యాధికారకాలు లేదా సిరామైడ్-ఆధారిత గ్లైకోస్ఫింగోలిపిడ్‌లకు (GSL) ప్రతిరోధకాల యొక్క మల్టీవాలెంట్ బైండింగ్ పెద్ద GSL అగ్రిగేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది, దశ విభజనను పెంచుతుంది మరియు పొర వైకల్యం మరియు అంతర్గతీకరణకు కారణమవుతుంది (44). ఇవాబుచి మొదలైనవి (43) పొడవైన (C24) కానీ పొట్టిగా లేని (C16) ఎసిల్ గొలుసుల సమక్షంలో, GSL లాక్టోసిల్సెరమైడ్‌కు కట్టుబడి ఉన్న మల్టీవాలెంట్ లిగాండ్ పెద్ద సమూహాలు మరియు పొర ఇన్వాజినేషన్ ఏర్పడటానికి ప్రేరేపించిందని మరియు కరపత్రాలపై సైటోప్లాజం లిన్-మధ్యవర్తిత్వ సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ కపుల్డ్ న్యూట్రోఫిల్స్‌లో ఎసిల్ గొలుసుల ద్వారా ఇంటర్‌డిజిటేట్ చేయబడిందని కనుగొనబడింది.
క్షీరద ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాలలో, యాంటీ-గోల్గి నెట్‌వర్క్ (TGN) యొక్క సాంద్రత అపియల్ ప్లాస్మా పొర స్థాయికి GPI-AP యొక్క విభజన మరియు క్రమబద్ధీకరణను నియంత్రిస్తుంది (10, 45). ఈ సంకలనం GPI-AP ఒలిగోమెరైజేషన్ (36) ద్వారా నడపబడుతుంది, అయితే ఇది ఈస్ట్‌లో మనం కనుగొనే సిరామైడ్ గొలుసు పొడవుపై కూడా ఆధారపడి ఉండవచ్చు. క్షీరద GPI-AP ఈథర్ లిపిడ్-ఆధారిత యాంకర్‌ను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, మరియు దాని రసాయన నిర్మాణం చాలా పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సిరామైడ్ నుండి చాలా భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ, ఇటీవలి అధ్యయనంలో రెండు లిపిడ్‌లు పరిణామాత్మకంగా ఒకేలాంటి భౌతిక మరియు రసాయన లక్షణాలను కలిగి ఉన్నాయని మరియు పనితీరును కలిగి ఉన్నాయని కనుగొన్నారు (40). అందువల్ల, క్షీరద కణాలలో ఈథర్ లిపిడ్ భాగం ఈస్ట్‌లోని C26 సిరామైడ్‌తో సమానంగా ఉండవచ్చు మరియు దాని పాత్ర GPI-AP సంకలనం మరియు క్రమబద్ధీకరణను ప్రోత్సహించడానికి పొరలోని లాంగ్-చైన్ సిరామైడ్‌తో అనుబంధించడం. ఈ అవకాశాన్ని ఇంకా నేరుగా పరీక్షించాల్సి ఉన్నప్పటికీ, మునుపటి పరిశోధనలు గోల్గి శరీరానికి పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సిరమైడ్ రవాణా సైటోప్లాస్మిక్ బదిలీ ప్రోటీన్ల ద్వారా నిర్వహించబడదని, కానీ ఈస్ట్ వంటి GPI యాంకర్ల సంశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుందని మద్దతు ఇస్తున్నాయి. అందువల్ల, పరిణామాత్మక సంప్రదాయవాద యంత్రాంగం ఒకే రవాణా వెసికిల్‌లో చాలా పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సిరమైడ్ మరియు GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) లను ఎంపిక చేసుకుని సహ-రవాణా చేయగలదు.
ఈస్ట్ మరియు క్షీరద ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణ వ్యవస్థలలో, GPI-AP అగ్రిగేషన్ మరియు ఇతర ప్లాస్మా పొర ప్రోటీన్ల నుండి వేరుచేయడం అన్నీ కణ ఉపరితలాన్ని చేరుకోవడానికి ముందే జరుగుతాయి. పలాడినో మరియు ఇతరులు (48) క్షీరద ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాల TGNలో, GPI-AP క్లస్టరింగ్ అనేది GPI-APలను ఎపికల్ ప్లాస్మా పొరకు ఎంపిక చేసిన వర్గీకరణకు మాత్రమే కాకుండా, GPI-APల క్లస్టరింగ్ సంస్థను మరియు దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను కూడా నియంత్రిస్తుందని కనుగొన్నారు. సెల్ ఉపరితలం. ఈస్ట్‌లో, ఈ అధ్యయనం ERలోని C26 సిరామైడ్-ఆధారిత GPI-AP క్లస్టర్ ప్లాస్మా పొరపై GPI-AP యొక్క క్లస్టర్ సంస్థ మరియు క్రియాత్మక కార్యకలాపాలను నియంత్రించగలదని చూపించింది (24, 49). ఈ నమూనాకు అనుగుణంగా, GhLag1 కణాలు GPI నిరోధకాలు లేదా సెల్ గోడ సమగ్రతను ప్రభావితం చేసే ఔషధాలకు అలెర్జీని కలిగి ఉంటాయి (28), మరియు ఈస్ట్ కణాల సంయోగంలో అంచనా వేయబడిన చిట్కా సిరామైడ్ యొక్క క్రియాత్మక గ్యాస్1-GFP క్లస్టర్‌ల (49) అవసరం Gని సూచిస్తుంది hLag1 కణాల యొక్క శారీరక పరిణామాలు. GPI-AP లోపం. అయితే, కణ ఉపరితలం యొక్క క్రియాత్మక సంస్థ ER నుండి లిపిడ్ పొడవు ఆధారంగా క్రమబద్ధీకరణ పద్ధతి ద్వారా ప్రోగ్రామ్ చేయబడిందో లేదో మరింత పరీక్షించడం మా భవిష్యత్ పరిశోధన యొక్క అంశం అవుతుంది.
ఈ పనిలో ఉపయోగించిన సాక్రోరోమైసెస్ సెరెవిసియా జాతులు టేబుల్ S1లో జాబితా చేయబడ్డాయి. లైవ్ సెల్ ఇమేజింగ్ కోసం SCLIM యొక్క MMY1583 మరియు MMY1635 జాతులు W303 నేపథ్యంలో నిర్మించబడ్డాయి. ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ ట్యాగ్‌తో Sec13-mCherryని వ్యక్తీకరించే ఈ జాతులు pFA6a ప్లాస్మిడ్‌తో పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR)-ఆధారిత పద్ధతిని ఉపయోగించి నిర్మించబడ్డాయి (23). GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌తో లేబుల్ చేయబడిన Mid2-iRFPని వ్యక్తీకరించే జాతి ఈ క్రింది విధంగా నిర్మించబడింది. pKTiRFP-KAN వెక్టర్ నుండి iRFP-KanMx సీక్వెన్స్ యొక్క PCR విస్తరణ (E. O'Shea బహుమతి, Addgene ప్లాస్మిడ్ సంఖ్య 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; పరిశోధన వనరుల గుర్తింపుదారుడు (RRID): Addgene_64687) మరియు ఎండోజెనస్ Mid2 యొక్క C-టెర్మినస్‌లోకి చొప్పించబడింది. Mid2-iRFP జన్యు శ్రేణిని విస్తరించి GAL1 ప్రమోటర్‌లోకి క్లోన్ చేసిన తర్వాత, అది ఇంటిగ్రేషన్ ప్లాస్మిడ్ pRS306 యొక్క నాట్ I-Sac I సైట్‌లోకి విలీనం చేయబడింది. ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్ pRGS7, URA3 లోకస్‌లోకి అనుసంధానించడానికి Pst Iతో లీనియరైజ్ చేయబడింది.
Gas1-GFP ఫ్యూజన్ జన్యువు సెంట్రోమీర్ (CEN) ప్లాస్మిడ్‌లో GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది, ఇది ఈ క్రింది విధంగా నిర్మించబడింది. Gas1-GFP శ్రేణిని pRS416-GAS1-GFP ప్లాస్మిడ్ (24) (L. పోపోలో బహుమతి) నుండి PCR ద్వారా విస్తరించారు మరియు CEN ప్లాస్మిడ్ pBEVY-GL LEU2 (C బహుమతి) యొక్క Xma I–Xho I సైట్‌లోకి క్లోన్ చేశారు. మిల్లర్; యాడ్‌జీన్ ప్లాస్మిడ్ సంఖ్య 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: యాడ్‌జీన్_51225). ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్‌కు pRGS6 అని పేరు పెట్టారు. Axl2-GFP ఫ్యూజన్ జన్యువు కూడా pBEVY-GL LEU2 వెక్టర్ యొక్క GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు దాని నిర్మాణం ఈ క్రింది విధంగా ఉంటుంది. PCR ద్వారా pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ప్లాస్మిడ్ (23) నుండి Axl2-GFP శ్రేణిని విస్తరించారు మరియు pBEVY-GL LEU2 వెక్టర్ యొక్క బామ్ HI-Pst I సైట్‌లోకి క్లోన్ చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్‌కు pRGS12 అని పేరు పెట్టారు. ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల క్రమం టేబుల్ S2లో జాబితా చేయబడింది.
ఈ జాతికి 0.2% అడెనిన్ మరియు 2% గ్లూకోజ్ [YP-డెక్స్ట్రోస్ (YPD)], 2% రాఫినోజ్ [YP-రాఫినోజ్] రిచ్ ఈస్ట్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ ప్రోటీన్ p (YP) మీడియం (1 % ఈస్ట్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ మరియు 2% ప్రోటీన్ ept). (YPR)] లేదా 2% గెలాక్టోస్ [YP-గెలాక్టోస్ (YPG)] కార్బన్ సోర్స్‌గా లేదా సింథటిక్ మినిమల్ మీడియం (0.15% ఈస్ట్ నైట్రోజన్ బేస్ మరియు 0.5% అమ్మోనియం సల్ఫేట్)లో పోషకాహారానికి అవసరమైన తగిన అమైనో ఆమ్లాలు మరియు బేస్‌లను భర్తీ చేయడానికి మరియు కార్బన్ సోర్స్‌గా 2% గ్లూకోజ్ (సింథటిక్ గ్లూకోజ్ కనిష్ట మాధ్యమం) లేదా 2% గెలాక్టోస్ (సింథటిక్ గెలాక్టోస్ కనిష్ట మాధ్యమం) కలిగి ఉంటుంది.
రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ కోసం, GAL1 ప్రమోటర్ కింద నిర్మాణాన్ని వ్యక్తీకరించే ఉష్ణోగ్రత-సెన్సిటివ్ sec31-1 మ్యూటాంట్ కణాలను YPR మాధ్యమంలో రాత్రిపూట 24°C నుండి మిడ్-లాగ్ దశ వరకు పెంచారు. YPGలో 24°C వద్ద 1 గంట పాటు ఇండక్షన్ చేసిన తర్వాత, కణాలను SGలో 37°C వద్ద 30 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై స్రావం బ్లాక్ నుండి విడుదల చేయడానికి 24°Cకి బదిలీ చేశారు. గ్లాస్ స్లైడ్‌పై కణాలను అమర్చడానికి కాన్కనావాలిన్ A ఉపయోగించబడింది మరియు SCLIM ద్వారా చిత్రీకరించబడింది. SCLIM అనేది ఒలింపస్ IX-71 ఇన్వర్టెడ్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్ మరియు UPlanSApo 100×1.4 న్యూమరికల్ ఎపర్చర్ ఆయిల్ లెన్స్ (ఒలింపస్), హై-స్పీడ్ మరియు హై-సిగ్నల్-టు-నాయిస్ రేషియో రొటేటింగ్ డిస్క్ కన్ఫోకల్ స్కానర్ (యోకోగావా ఎలక్ట్రిక్), కస్టమ్ స్పెక్ట్రోమీటర్ మరియు కస్టమ్ కూలింగ్ కలయిక. సిస్టమ్ యొక్క ఇమేజ్ ఇంటెన్సిఫైయర్ (హమామట్సు ఫోటోనిక్స్) ×266.7 తుది మాగ్నిఫికేషన్‌తో మాగ్నిఫైయింగ్ లెన్స్ సిస్టమ్‌ను మరియు ఎలక్ట్రాన్‌లను గుణించే ఛార్జ్-కపుల్డ్ డివైస్ కెమెరాను అందించగలదు (హమామట్సు ఫోటోనిక్స్) (21). ఇమేజ్ అక్విజిషన్ కస్టమ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (యోకోగావా ఎలక్ట్రిక్) ద్వారా నిర్వహించబడుతుంది. 3D చిత్రాల కోసం, ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్‌ను నిలువుగా వైబ్రేట్ చేయడానికి మేము కస్టమ్-మేడ్ పైజోఎలెక్ట్రిక్ యాక్యుయేటర్‌ను ఉపయోగించాము మరియు ఆప్టికల్ భాగాలను స్టాక్‌లో 100 nm దూరంలో సేకరించాము. Z-స్టాక్ ఇమేజ్ 3D వోక్సెల్ డేటాగా మార్చబడుతుంది మరియు తిరిగే డిస్క్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ కోసం ఉపయోగించే సైద్ధాంతిక పాయింట్ స్ప్రెడ్ ఫంక్షన్ వోలోసిటీ సాఫ్ట్‌వేర్ (పెర్కిన్ఎల్మర్) ద్వారా డీకాన్వల్యూషన్ ప్రాసెసింగ్ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది. సహ-స్థాన విశ్లేషణ కోసం స్వయంచాలకంగా థ్రెషోల్డ్ కోసం వోలోసిటీ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించడం ద్వారా, కార్గోతో సహా ERESని కొలుస్తారు. MetaMorph సాఫ్ట్‌వేర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ఉపయోగించి లైన్ స్కాన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది.
గణాంక ప్రాముఖ్యతను నిర్ణయించడానికి గ్రాప్‌ప్యాడ్ ప్రిజం సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి. రెండు తోకల విద్యార్థుల టి-పరీక్ష మరియు సాధారణ వన్-వే విశ్లేషణ ఆఫ్ వేరియెన్స్ (ANOVA) పరీక్ష కోసం, సమూహాల మధ్య తేడాలు P <0.05 (*) పై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతాయని భావిస్తారు.
Gas1-GFP యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ కోసం, లాగ్ ఫేజ్ కణాలను YPDలో రాత్రిపూట పెంచి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించి, ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, కనీసం 15 నిమిషాలు మంచు మీద పొదిగించి, ఆపై గతంలో వివరించిన విధంగా మైక్రోస్కోప్ కింద కొనసాగారు. చెక్ (24). ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్, L5 (GFP) ఫిల్టర్, హమామట్సు కెమెరా మరియు అప్లికేషన్ సూట్ X (LAS X) సాఫ్ట్‌వేర్‌తో అమర్చబడిన లైకా DMi8 మైక్రోస్కోప్ (HCX PL APO 1003/1.40 ఆయిల్ PH3 CS) సముపార్జన కోసం ఉపయోగించబడింది. .
నమూనాలను 65°C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు SDS నమూనా బఫర్‌తో డీనాచర్ చేశారు, ఆపై SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ (PAGE) ద్వారా వేరు చేశారు. ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ విశ్లేషణ కోసం, ప్రతి లేన్‌కు 10 μl నమూనా లోడ్ చేయబడింది. ప్రాథమిక యాంటీబాడీ: 1:3000 పలుచనతో కుందేలు పాలీక్లోనల్ యాంటీ-గ్యాస్1, 1:500 పలుచనతో కుందేలు పాలీక్లోనల్ యాంటీ-ఎమ్‌పి24, మరియు 1:3000 పలుచనతో కుందేలు పాలీక్లోనల్ యాంటీ-జిఎఫ్‌పి (హెచ్. రీజ్‌మాన్ నుండి బహుమతి) ఉపయోగించండి. మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీ-పిజికె1 యాంటీబాడీని 1:5000 పలుచనతో (జె. డి లా క్రూజ్ నుండి బహుమతి) ఉపయోగించారు. ద్వితీయ యాంటీబాడీ: హార్స్‌రాడిష్ పెరాక్సిడేస్ (హెచ్‌ఆర్‌పి) కంజుగేటెడ్ మేక యాంటీ-రాబిట్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ జి (ఐజిజి) 1:3000 (పియర్స్) పలుచనతో ఉపయోగించబడుతుంది. HRP-కంజుగేటెడ్ మేక యాంటీ-మౌస్ IgGని 1:3000 (పియర్స్) డైల్యూషన్ వద్ద ఉపయోగించారు. సూపర్ సిగ్నల్ వెస్ట్ పికో రియాజెంట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) యొక్క కెమిలుమినిసెన్స్ పద్ధతి ద్వారా రోగనిరోధక ప్రతిస్పందన జోన్ గమనించబడింది.
(31) లో వివరించినట్లుగా, సుసంపన్నమైన ER భిన్నంపై సహజ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ప్రయోగం జరిగింది. సంక్షిప్తంగా, ఈస్ట్ కణాలను TNE బఫర్ [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ఫినైల్మెథైల్సల్ఫోనిల్ ఫ్లోరైడ్ మరియు ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ మిశ్రమం) తో 600 nm (OD600) వద్ద 100 ఆప్టికల్ సాంద్రత వద్ద రెండుసార్లు కడగాలి. దీనిని గాజు పూసలతో విచ్ఛిన్నం చేశారు, ఆపై కణ శిధిలాలు మరియు గాజు పూసలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా తొలగించారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను 4°C వద్ద 15 నిమిషాలు 17,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. గుళికను TNEలో తిరిగి అమర్చారు మరియు డిజిటాలిస్ సాపోనిన్‌ను 1% తుది సాంద్రతకు జోడించారు. సస్పెన్షన్‌ను 4°C వద్ద భ్రమణంతో 1 గంట పాటు పొదిగించారు, ఆపై కరగని భాగాలను 4°C వద్ద 13,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా 60 నిమిషాలు తొలగించారు. Gas1-GFP ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ కోసం, ముందుగా 4°C వద్ద ఖాళీ అగరోజ్ పూసలతో (ChromoTek) 1 గంట పాటు నమూనాను ముందుగా పొదిగించండి, ఆపై 4°C వద్ద GFP-Trap_A (ChromoTek) తో 3 గంటల పాటు పొదిగించండి. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేటెడ్ పూసలను 0.2% డిగోక్సిజెనిన్ కలిగిన TNE తో ఐదుసార్లు కడిగి, SDS నమూనా బఫర్‌తో తొలగించి, SDS-PAGEలో వేరు చేసి, ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు.
(31) లో వివరించినట్లుగా, సుసంపన్నమైన ER భిన్నంపై క్రాస్-లింకింగ్ నిర్ధారణ జరిగింది. క్లుప్తంగా, సుసంపన్నమైన ER భిన్నాన్ని 0.5 mM డైథియోబిస్ (సుక్సినిమిడిల్ ప్రొపియోనేట్) (పియర్స్, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, రాక్‌ఫోర్డ్, IL, USA; 20°C, 20 నిమిషాలు) తో పొదిగించారు. గ్లైసిన్ (50 mM తుది సాంద్రత, 5 నిమిషాలు, 20°C) జోడించడం ద్వారా క్రాస్‌లింకింగ్ ప్రతిచర్యను చల్లార్చారు.
గతంలో వివరించినట్లుగా (50), వైల్డ్-టైప్ మరియు GhLag1 జాతులలో సిరామైడ్ యొక్క MS విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. సంక్షిప్తంగా, కణాలను YPDలో 30°C వద్ద ఘాతాంక దశకు (3 నుండి 4 OD600 యూనిట్లు/ml) పెంచారు మరియు 25×107 కణాలు సేకరించబడ్డాయి. వాటి జీవక్రియ ట్రైక్లోరోఅసిటిక్ ఆమ్లంతో చల్లబడుతుంది. ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ ద్రావకం [ఇథనాల్, నీరు, ఈథర్, పిరిడిన్ మరియు 4.2 N అమ్మోనియం హైడ్రాక్సైడ్ (15:15:5:1:0.018 v/v)] మరియు 1.2 nmol అంతర్గత ప్రామాణిక C17 సిరామైడ్ (860517, అవంతి పోలార్ లిపిడ్) నాణ్యతను ఉపయోగించండి. సారం యొక్క తేలికపాటి ఆల్కలీన్ జలవిశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మోనోమెథైలమైన్ రియాజెంట్ [మిథనాల్, నీరు, n-బ్యూటనాల్ మరియు మిథైలమైన్ ద్రావణం (4:3:1:5 v/v)]ని ఉపయోగించండి, ఆపై డీసాల్ట్ చేయడానికి నీటి-సంతృప్త n-బ్యూటనాల్‌ను ఉపయోగించండి. చివరగా, సారంను పాజిటివ్ మోడ్ ద్రావకం [క్లోరోఫామ్/మిథనాల్/నీరు (2:7:1) + 5 mM అమ్మోనియం అసిటేట్]లో తిరిగి అమర్చి, మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. స్పింగోలిపిడ్ అణువుల గుర్తింపు మరియు పరిమాణీకరణ కోసం బహుళ-ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ (MRM) నిర్వహించబడింది. TSQ వాంటేజ్ తృతీయ క్వాడ్రూపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లిపిడ్ విశ్లేషణ కోసం రోబోటిక్ నానోఫ్లో అయాన్ సోర్స్ నానోమేట్ HD (అడ్వియన్ బయోసైన్సెస్, ఇథాకా, NY)తో అమర్చబడింది. ప్రతి సిరామైడ్ వర్గానికి తాకిడి శక్తి ఆప్టిమైజ్ చేయబడింది. MS డేటాను పాజిటివ్ మోడ్‌లో పొందారు. ప్రతి జీవ ప్రతిరూపానికి, లిపిడ్ సిగ్నల్ మూడు స్వతంత్ర కొలతల మధ్యస్థం.
(31) లో వివరించినట్లుగా, Gas1-GFP ని వ్యక్తీకరించే కణాలు (800×107) సహజ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్‌కు గురయ్యాయి. శుద్ధి చేయబడిన Gas1-GFP ని SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేసి పాలీవినైలిడిన్ ఫ్లోరైడ్ (PVDF) పొరకు బదిలీ చేశారు. PVDF ని అమైడ్ బ్లాక్ తో మరక చేయడం ద్వారా ప్రోటీన్ దృశ్యమానం చేయబడింది. Gas1-GFP బ్యాండ్‌ను PVDF నుండి కత్తిరించి 5 సార్లు మిథనాల్ తో మరియు ఒకసారి లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-MS (LC-MS) గ్రేడ్ నీటితో కడగడం జరిగింది. మెమ్బ్రేన్ స్ట్రిప్‌ను 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), బఫర్ మరియు 500μl తాజాగా కరిగించిన 1 M సోడియం నైట్రేట్ మిశ్రమంతో 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు పొదిగించడం ద్వారా, లిపిడ్ భిన్నం Gas1-GFP నుండి విడుదలై లైస్ చేయబడింది (51). ఆ తరువాత, మెమ్బ్రేన్ స్ట్రిప్‌ను LC-MS గ్రేడ్ నీటితో నాలుగు సార్లు కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఎండబెట్టి, విశ్లేషణ వరకు -80°C వద్ద నత్రజని వాతావరణంలో నిల్వ చేశారు. నియంత్రణగా, ప్రతి ప్రయోగానికి PVDF పొర యొక్క ఖాళీ నమూనాను ఉపయోగించారు. Gas1-GFP నుండి సేకరించిన లిపిడ్‌ను MS వివరించిన విధంగా విశ్లేషించింది (50). సంక్షిప్తంగా, GPI-లిపిడ్ కలిగిన PVDF స్ట్రిప్‌లను 75μl నెగటివ్ మోల్డ్ ద్రావకం [క్లోరోఫామ్/మిథనాల్ (1:2) + 5 mM అమ్మోనియం అసిటేట్]లో తిరిగి అమర్చారు మరియు స్పింగోలిపిడ్ జాతుల (TSQ వాంటేజ్) ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ (ESI)-MRM/MS విశ్లేషణలో ఉత్తీర్ణత సాధించారు. ఈ సందర్భంలో, MS డేటాను ప్రతికూల అయాన్ మోడ్‌లో పొందారు.
ముందుగా చెప్పినట్లుగా, GPI యాంకర్ యొక్క లిపిడ్ భాగాన్ని [3H]-ఇనోసిటాల్-లేబుల్ చేయబడిన GPI-AP (16) నుండి వేరు చేశారు. లిపిడ్‌లను ద్రావణి వ్యవస్థను (55:45:10 క్లోరోఫామ్-మిథనాల్-0.25% KCl) ఉపయోగించి సన్నని-పొర క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా వేరు చేసి, FLA-7000 (ఫుజిఫిల్మ్) ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేశారు.
Gas1-GFP (600×107) ను వ్యక్తీకరించే కణాలను TNE బఫర్‌తో TNE బఫర్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, గాజు పూసలతో విరిచి, ఆపై కణ శిధిలాలు మరియు గాజు పూసలను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను 4°C వద్ద 1 గంట పాటు 17,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. గుళికను TNEలో కడిగి, 0.2% డిజిటాలిస్ సాపోనిన్ కలిగిన TNEలో 1 U PI-PLC (ఇన్విట్రోజెన్)తో 37°C వద్ద 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఎంజైమ్ చికిత్స తర్వాత, పొరను 4°C వద్ద 17,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా 1 గంట పాటు తొలగించారు. Gas1-GFP ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయడానికి, సూపర్‌నాటెంట్‌ను రాత్రిపూట 4°C వద్ద GFP-Trap_A (ChromoTek) తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడిన శుద్ధి చేయబడిన Gas1-GFPని కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూతో మరక చేశారు. అక్విడక్ట్ చుట్టూ ఉన్న బూడిద రంగు నుండి గ్యాస్1-GFP స్టెయినింగ్ బ్యాండ్‌ను కత్తిరించారు, ఆపై అయోడోఅసెటమైడ్‌తో ఆల్కైలేషన్ మరియు డైథియోథ్రెయిటాల్‌తో తగ్గింపు తర్వాత, ట్రిప్సిన్‌తో ఇన్-జెల్ జీర్ణక్రియ జరిగింది. GPI-గ్లైకాన్‌లతో ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లు మరియు పెప్టైడ్‌లను సంగ్రహించి పొడి చేయండి. ఎండిన పెప్టైడ్‌ను 20 μl నీటిలో కరిగించారు. LCలోకి ఒక భాగాన్ని (8μl) ఇంజెక్ట్ చేయండి. నిర్దిష్ట ప్రవణత పరిస్థితులలో పెప్టైడ్‌లను వేరు చేయడానికి ఆక్టాడెసిల్సిలేన్ (ODS) కాలమ్ (డెవెలోసిల్ 300ODS-HG-5; లోపలి వ్యాసం 150 mm×1.0 mm; నోమురా కెమికల్, ఐచి ప్రిఫెక్చర్, జపాన్) ఉపయోగించబడింది. మొబైల్ దశ ద్రావకం A (0.08% ఫార్మిక్ ఆమ్లం) మరియు ద్రావకం B (80% అసిటోనిట్రైల్‌లో 0.15% ఫార్మిక్ ఆమ్లం). 50 μl min-1 ప్రవాహ రేటుతో 55 నిమిషాలలోపు ద్రావణి A తో స్తంభాన్ని ఎల్యూట్ చేయడానికి అక్సెలా HPLC వ్యవస్థ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, బోస్టన్, మసాచుసెట్స్) ఉపయోగించబడింది, ఆపై ద్రావణి B యొక్క సాంద్రత 40% కి పెరిగింది. , యునైటెడ్ స్టేట్స్). ESI అయాన్ సోర్స్‌లోకి ఎల్యుయేట్ నిరంతరం ప్రవేశపెట్టబడింది మరియు GPI-గ్లైకాన్‌లతో కూడిన ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లు మరియు పెప్టైడ్‌లను LTQ ఆర్బిట్రాప్ XL (హైబ్రిడ్ లీనియర్ అయాన్ ట్రాప్-ఆర్బిట్రాప్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్; థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) విశ్లేషించింది. MS సెటప్‌లో, కేశనాళిక మూలం యొక్క వోల్టేజ్ 4.5 kV కు సెట్ చేయబడింది మరియు బదిలీ కేశనాళిక యొక్క ఉష్ణోగ్రత 300°C వద్ద ఉంచబడింది. కేశనాళిక వోల్టేజ్ మరియు ట్యూబ్ లెన్స్ వోల్టేజ్ వరుసగా 15 V మరియు 50 V కు సెట్ చేయబడ్డాయి. MS డేటాను 300/m/z ద్రవ్యరాశి/ఛార్జ్ నిష్పత్తి (m/z) 3000 ద్రవ్యరాశి పరిధిలో పాజిటివ్ అయాన్ మోడ్‌లో (60,000 రిజల్యూషన్; మిలియన్‌కు 10 భాగాల ద్రవ్యరాశి ఖచ్చితత్వం) పొందారు. MS/MS డేటాను LTQ ఆర్బిట్రాప్ XL [డేటా ఆధారపడి ఉండే మొదటి 3 అంకెలు, ఘర్షణ ప్రేరిత విచ్ఛేదనం (CID)]లోని అయాన్ ట్రాప్ ద్వారా పొందారు.
GROMACS (52) సాఫ్ట్‌వేర్ మరియు MARTINI 2 ఫోర్స్ ఫీల్డ్ (53-55) ఉపయోగించి MD సిమ్యులేషన్‌లు నిర్వహించబడ్డాయి. CHARMM GUI మెంబ్రేన్ బిల్డర్ (56, 57) తర్వాత డయోలియోయిల్‌ఫాస్ఫాటిడైల్‌కోలిన్ (DOPC) మరియు Cer C18 లేదా DOPC మరియు Cer C26 కలిగిన ద్వి పొరను నిర్మించడానికి ఉపయోగించబడింది. స్పింగోసిన్ తోక నుండి అదనపు పూసలను తొలగించడం ద్వారా Cer C26 యొక్క టోపోలాజీ మరియు కోఆర్డినేట్‌లు DXCE నుండి తీసుకోబడ్డాయి. డబుల్ లేయర్‌ను సమతుల్యం చేయడానికి మరియు దానిని అమలు చేయడానికి క్రింద వివరించిన ప్రక్రియను ఉపయోగించండి, ఆపై Emp24 కలిగిన వ్యవస్థను నిర్మించడానికి వ్యవస్థ యొక్క చివరి కోఆర్డినేట్‌లను ఉపయోగించండి. ఈస్ట్ Emp24 (అవశేషాలు 173 నుండి 193 వరకు) యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ డొమైన్‌ను విజువల్ MD (VMD) సాధనం పరమాణు నిర్మాణం (58) ఉపయోగించి α-హెలిక్స్‌గా నిర్మించారు. తరువాత, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న లిపిడ్‌లను తొలగించిన తర్వాత, ప్రోటీన్‌ను ముతకగా గ్రాన్యులేట్ చేసి CHARMM GUIని ఉపయోగించి ద్వి పొరలోకి చొప్పించారు. తుది వ్యవస్థలో 1202 DOPC మరియు 302 Cer C26 లేదా 1197 DOPC మరియు 295 Cer C18 మరియు Emp24 ఉన్నాయి. వ్యవస్థను 0.150M గాఢతకు అయనీకరణం చేయండి. రెండు ద్విపొర కూర్పుల కోసం నాలుగు స్వతంత్ర ప్రతిరూపాలు తయారు చేయబడ్డాయి.
లిపిడ్ బిలేయర్ CHARMM GUI ప్రక్రియను ఉపయోగించి సమతుల్యం చేయబడుతుంది, దీనిలో 405,000 దశలను కనిష్టీకరించడం మరియు తరువాత సమతుల్యం చేయడం జరుగుతుంది, ఇక్కడ స్థాన పరిమితులు క్రమంగా తగ్గించబడతాయి మరియు తొలగించబడతాయి మరియు సమయ దశ 0.005 ps నుండి 0.02 psకి పెరుగుతుంది. సమతౌల్యం తర్వాత, ఇది 0.02 ps సమయ దశతో 6 µsని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. Emp24ని చొప్పించిన తర్వాత, వ్యవస్థను కనిష్టీకరించడానికి మరియు సమతుల్యం చేయడానికి అదే CHARMM GUI ప్రక్రియను ఉపయోగించండి, ఆపై ఉత్పత్తిలో 8 సెకన్ల పాటు అమలు చేయండి.
అన్ని వ్యవస్థలకు, బ్యాలెన్సింగ్ ప్రక్రియలో, పీడనం బెరెండ్సెన్ బారోస్టాట్ (59) ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది మరియు ఉత్పత్తి ప్రక్రియలో, పీడనం పారినెల్లో-రెహ్మాన్ బారోస్టాట్ (60) ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది. అన్ని సందర్భాల్లో, సగటు పీడనం 1 బార్ మరియు సెమీ-ఐసోట్రోపిక్ ప్రెజర్ కప్లింగ్ స్కీమ్ ఉపయోగించబడుతుంది. బ్యాలెన్స్ మరియు ఉత్పత్తి ప్రక్రియలో, ప్రోటీన్, లిపిడ్ మరియు ద్రావణి కణాల ఉష్ణోగ్రతను వరుసగా జత చేయడానికి స్పీడ్ రీకాలిబ్రేషన్‌తో కూడిన థర్మోస్టాట్ (61) ఉపయోగించబడుతుంది. మొత్తం ఆపరేషన్ సమయంలో, లక్ష్య ఉష్ణోగ్రత 310K. 0.005 బఫర్ టాలరెన్స్‌తో వెర్లెట్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగించి జత చేసే జాబితాను రూపొందించడం ద్వారా బంధం కాని పరస్పర చర్యను లెక్కించబడుతుంది. కూలంబ్ టర్మ్‌ను రియాక్షన్ ఫీల్డ్ మరియు 1.1 nm కట్-ఆఫ్ దూరం ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది. వాండర్ వాల్స్ టర్మ్ 1.1 nm కట్-ఆఫ్ దూరంతో కట్-ఆఫ్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగిస్తుంది మరియు వెర్లెట్ కట్-ఆఫ్ స్కీమ్ పొటెన్షియల్ డ్రిఫ్ట్ (62) కోసం ఉపయోగించబడుతుంది.
VMD ని ఉపయోగించి, DOPC ఫాస్ఫేట్ పూసలు లేదా సెరామైడ్ AM1 పూసలు మరియు ప్రోటీన్ మధ్య కటాఫ్ తరంగదైర్ఘ్యం 0.7 nm, మరియు ప్రోటీన్‌తో సంకర్షణ చెందే లిపిడ్‌ల సంఖ్యను లెక్కిస్తారు. కింది సూత్రం ప్రకారం, (63)లో ఉన్నట్లుగా క్షీణత-సుసంపన్నత (DE) కారకాన్ని లెక్కించండి: DE కారకం = (ప్రోటీన్‌లోని మొత్తం లిపిడ్‌ల మొత్తం 0.7) ప్రోటీన్ 0.7లో (మొత్తం లిపిడ్‌లలో Cer మొత్తం)
నివేదించబడిన విలువ సగటుగా పొందబడింది మరియు ఎర్రర్ బార్‌లు SE యొక్క నాలుగు స్వతంత్ర కాపీలు. DE కారకం యొక్క గణాంక ప్రాముఖ్యతను t పరీక్ష [(సగటుDE-కారకం-1)/SE] ద్వారా లెక్కించబడుతుంది. ఒక-తోక పంపిణీ నుండి P విలువను లెక్కించండి.
ట్రేస్ యొక్క చివరి 250 ns లోపల Emp24 కలిగి ఉన్న వ్యవస్థ యొక్క 2D పార్శ్వ సాంద్రత మ్యాప్‌ను లెక్కించడానికి GROMACS సాధనం ఉపయోగించబడింది. సెరామైడ్ యొక్క సుసంపన్నత/క్షీణత మ్యాప్‌ను పొందడానికి, Cer యొక్క సాంద్రత మ్యాప్‌ను Cer మరియు DOPC యొక్క మ్యాప్ మొత్తంతో విభజించి, ఆపై శరీరంలోని Cer యొక్క గాఢతతో విభజించారు. అదే రంగు మ్యాప్ స్కేల్ ఉపయోగించబడుతుంది.
ఈ వ్యాసం కోసం అనుబంధ సామగ్రి కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల ప్రకారం పంపిణీ చేయబడిన ఓపెన్ యాక్సెస్ ఆర్టికల్, ఇది ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగం, పంపిణీ మరియు పునరుత్పత్తిని అనుమతిస్తుంది, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు పని సరైనదే అనే ఆవరణలో. సూచన.
గమనిక: మీరు పేజీకి సిఫార్సు చేసిన వ్యక్తికి మీరు ఇమెయిల్ చూడాలనుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలుసుకోవడానికి మాత్రమే మేము మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను అందించమని అడుగుతాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సంగ్రహించము.
మీరు సందర్శకులో ఉన్నారో లేదో పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నిరోధించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
సోఫియా రోడ్రిగ్జ్-గల్లార్డో, కజువో కురోకావా, సుసానా సబిడో-బోజో, అలెజాండ్రో కోర్టెజ్ · గోమెజ్ (అలెజాండ్రో కోర్టెస్-గోమెజ్), అట్సుకో ఇకెడా (అట్సుకో ఇకెడా), వలేరియా జోని (వలేరియా జోని), ఆక్సిలియాడోరా ఎస్ లూరియోజ్, అగ్యిలేరా-రియోరియా), (సెర్గియో లోపెజ్), మిహో వాగా (మిహో వాగా), మిసాకో అర్మాన్ (మిసాకో అర్మాన్), మియాకో రిమాన్ (మియాకో రిమాన్), ప్రోవ్ అకిరా, స్టెఫానో ఫన్నీ, అకిహికో నకనో, మాన్యుయెల్ మునిజ్
ఎంపిక చేసిన అవుట్‌పుట్ సైట్‌లలో ప్రోటీన్ సార్టింగ్ కోసం సిరామైడ్ గొలుసు పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను 3D హై-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ వెల్లడిస్తుంది.
సోఫియా రోడ్రిగ్జ్-గల్లార్డో, కజువో కురోకావా, సుసానా సబిడో-బోజో, అలెజాండ్రో కోర్టెజ్ · గోమెజ్ (అలెజాండ్రో కోర్టెస్-గోమెజ్), అట్సుకో ఇకెడా (అట్సుకో ఇకెడా), వలేరియా జోని (వలేరియా జోని), ఆక్సిలియాడోరా ఎస్ లూరియోజ్, అగ్యిలేరా-రియోరియా), (సెర్గియో లోపెజ్), మిహో వాగా (మిహో వాగా), మిసాకో అర్మాన్ (మిసాకో అర్మాన్), మియాకో రిమాన్ (మియాకో రిమాన్), ప్రోవ్ అకిరా, స్టెఫానో ఫన్నీ, అకిహికో నకనో, మాన్యుయెల్ మునిజ్
ఎంపిక చేసిన అవుట్‌పుట్ సైట్‌లలో ప్రోటీన్ సార్టింగ్ కోసం సిరామైడ్ గొలుసు పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను 3D హై-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ వెల్లడిస్తుంది.
©2020 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.