కణ విభజన మరియు హోమియోస్టాసిస్‌ను నిర్వహించడానికి స్రావ మార్గంలో ప్రోటీన్ల క్రమబద్ధీకరణ చాలా అవసరం. షెల్-మధ్యవర్తిత్వ క్రమబద్ధీకరణతో పాటు, స్రావ రవాణా ప్రక్రియలో కైనేసిన్ క్రమబద్ధీకరణలో లిపిడ్ల పాత్ర అనేది చాలా కాలంగా ఉన్న ఒక ప్రాథమిక ప్రశ్న, దీనికి ఇంకా సమాధానం లభించలేదు. ఇక్కడ, మేము ఇన్ వివోలో నిరూపించడానికి 3D ఏకకాల బహుళ-రంగు అధిక-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్‌ను నిర్వహిస్తాము. దీని ద్వారా, చాలా పొడవైన సెరమైడ్ లిపిడ్ భాగాలతో కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన గ్లైకోసిల్ఫాస్ఫాటిడైల్ ఇనోసిటాల్-స్థిరీకరించబడిన ప్రోటీన్లు, ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్లు ఉపయోగించే దానికంటే భిన్నమైన ప్రత్యేక ఎండోప్లాస్మిక్ నెట్ ఎగ్జిట్ సైట్‌గా సమూహాలుగా ఏర్పడి వర్గీకరించబడతాయని మేము చూపిస్తాము. అదనంగా, ఈ క్రమబద్ధీకరణ ఎంపికకు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్ పొరలోని సెరమైడ్ గొలుసు పొడవు కీలకమని మేము చూపిస్తాము. మా అధ్యయనం, స్రావ మార్గంలో లిపిడ్ గొలుసు పొడవు ఆధారంగా ప్రోటీన్ కార్గోలను ఎంపిక చేసిన ఎగుమతి సైట్‌లుగా వర్గీకరించడానికి మొట్టమొదటి ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో సాక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది.
యూకారియోటిక్ కణాలలో, ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్ (ER)లో సంశ్లేషణ చేయబడిన ప్రోటీన్లు, వాటి సరైన కణ గమ్యస్థానానికి చేరవేయడం కోసం స్రావక మార్గం ద్వారా రవాణా సమయంలో క్రమబద్ధీకరించబడతాయి (1). కోట్-మధ్యవర్తిత్వ క్రమబద్ధీకరణతో పాటు, కొన్ని లిపిడ్లు కూడా నిర్దిష్ట ప్రోటీన్లను నిర్దిష్ట పొర డొమైన్లలో సమూహపరచడం ద్వారా ఎంపిక చేసిన నిష్క్రమణ బిందువులుగా పనిచేస్తాయని చాలా కాలంగా ఊహించబడింది (2-5). అయితే, ఈ సాధ్యమయ్యే లిపిడ్-ఆధారిత యంత్రాంగాన్ని నిరూపించడానికి ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో ఆధారాలు ఇప్పటికీ లేవు. ఈ ప్రాథమిక సమస్యను పరిష్కరించడానికి, గ్లైకోసిల్ఫాస్ఫాటిడైల్ఇనోసిటాల్ (GPI) యాంకర్డ్ ప్రోటీన్లు (GPI-APలు) ER నుండి విభిన్నంగా ఎలా ఎగుమతి చేయబడతాయో మేము ఈస్ట్‌లో అధ్యయనం చేసాము. GPI-APలు అనేవి వివిధ రకాల లిపిడ్-అనుసంధానిత కణ ఉపరితల ప్రోటీన్లు (6, 7). GPI-AP అనేది గ్లైకోలిపిడ్ భాగం (GPI యాంకర్) ద్వారా ప్లాస్మా పొర యొక్క బయటి పొరలకు జోడించబడిన ఒక స్రావక ప్రోటీన్. అవి ER ల్యూమెన్‌లో సంరక్షక పోస్ట్-ట్రాన్స్‌లేషనల్ మార్పులుగా GPI యాంకర్లను అంగీకరిస్తాయి (8). అటాచ్మెంట్ తర్వాత, GPI-AP ER నుండి ప్లాస్మా పొర వరకు గోల్గి ఉపకరణం (5, 9) గుండా వెళుతుంది. GPI యాంకర్ల ఉనికి, స్రావక మార్గం (5, 9, 10) వెంట ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావక ప్రోటీన్ల (ఇతర ప్లాస్మా పొర ప్రోటీన్లతో సహా) నుండి GPI-AP విడిగా రవాణా చేయబడటానికి కారణమవుతుంది. ఈస్ట్ కణాలలో, GPI-APలు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్‌లో ఇతర స్రావక ప్రోటీన్ల నుండి వేరు చేయబడతాయి, ఆపై కోట్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్ II (COPII) (6, 7) చే చుట్టబడిన ప్రత్యేక వెసికిల్స్‌లోకి ప్యాక్ చేయబడతాయి. ER ఎగుమతి ప్రక్రియలో ఈ వర్గీకరణ ప్రక్రియ యొక్క నిర్ధారకాలు అస్పష్టంగా ఉన్నాయి, కానీ ఈ యంత్రాంగానికి లిపిడ్లు, ముఖ్యంగా GPI యాంకర్ యొక్క లిపిడ్ భాగం యొక్క నిర్మాణాత్మక పునర్నిర్మాణం అవసరం కావచ్చని ఊహించబడింది (5, 8). ఈస్ట్‌లో, GPI అటాచ్ అయిన వెంటనే GPI లిపిడ్ పునర్నిర్మాణం ప్రారంభమవుతుంది మరియు చాలా సందర్భాలలో, ఇది సెరమైడ్ 26-కార్బన్ పొడవైన గొలుసు సంతృప్త కొవ్వు ఆమ్లం (C26:0)కు బంధించడానికి కారణమవుతుంది (11, 12). ఇప్పటివరకు ఈస్ట్ కణాలచే ఉత్పత్తి చేయబడిన ప్రధాన సెరమైడ్ C26 సెరమైడ్. ఇది ERలో సంశ్లేషణ చేయబడుతుంది మరియు దానిలో ఎక్కువ భాగం COPII వెసికిల్స్ ద్వారా గోల్గి ఉపకరణానికి ఎగుమతి చేయబడుతుంది (13). GPI-AP యొక్క ER ఎగుమతికి ప్రత్యేకంగా కొనసాగుతున్న సెరమైడ్ సంశ్లేషణ అవసరం (14, 15), మరియు గోల్గి ఉపకరణంలో సెరమైడ్ ఇనోసిటాల్ ఫాస్ఫేట్ సెరమైడ్ (IPC)గా మారడం GPI యాంకర్ సంశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది (16). కృత్రిమ పొరలతో చేసిన బయోఫిజికల్ అధ్యయనాలు చాలా పొడవైన ఎసైల్ చైన్ సెరమైడ్‌లు కలిసిపోయి ప్రత్యేకమైన భౌతిక లక్షణాలతో క్రమబద్ధమైన డొమైన్‌లను ఏర్పరుస్తాయని చూపించాయి (17, 18). ఈ డేటా, C26 సెరమైడ్ మరియు C26 సెరమైడ్‌తో కూడిన GPI-AP తమ భౌతిక లక్షణాలను ఉపయోగించి, సాపేక్షంగా చిందరవందరగా ఉండే ER పొర లిపిడ్ వాతావరణంలో క్రమబద్ధమైన ప్రాంతాలుగా లేదా ప్రదేశాలుగా కలిసిపోతాయనే పరికల్పనకు దారితీస్తుంది. ఇది ప్రధానంగా చిన్న మరియు అసంతృప్త గ్లిసరోలిపిడ్‌లతో (C16:1 మరియు C18:1) కూడి ఉంటుంది (19, 20). ఈ ప్రాంతాలు నిర్దిష్ట ER నిష్క్రమణ స్థానాలపై (ERES) ఎంపికగా దృష్టి సారిస్తాయి, ఇక్కడ సెరమైడ్ మరియు సెరమైడ్-ఆధారిత GPI-AP లను అదే ప్రత్యేక COPII వెసికిల్‌లో గోల్గికి సహ-రవాణా చేయవచ్చు (5).
ఈ అధ్యయనంలో, ఫ్లోరోసెంట్ లేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లను ఏకకాలంలో గమనించగల అత్యాధునిక మైక్రోస్కోపీ టెక్నిక్ అయిన సూపర్-రిజల్యూషన్ కాన్ఫోకల్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ మైక్రోస్కోపీ (SCLIM)ని ఉపయోగించి మేము ఈ లిపిడ్-ఆధారిత యంత్రాంగాన్ని నేరుగా పరీక్షించాము. మూడు-రంగు మరియు త్రిమితీయ (3D) చిత్రాలు జీవ కణాలలో అత్యంత అధిక రిజల్యూషన్ మరియు వేగాన్ని కలిగి ఉంటాయి (21, 22).
S. cerevisiae లో ER నుండి బయటకు వచ్చిన తర్వాత ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావిత ప్రోటీన్ల నుండి C26 సెరమైడ్ సమూహంతో సాధారణ GPI-AP ఎలా స్క్రీన్ చేయబడిందో మరింతగా నిర్వచించడానికి మేము మొదట SCLIM టెక్నాలజీని వర్తింపజేసాము. ER యొక్క వర్గీకరణను తనిఖీ చేయడానికి, మేము ఇన్ వివోలో ERES లోకి ప్రవేశించే కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన కార్గోను నేరుగా దృశ్యమానం చేయగల జన్యు వ్యవస్థను ఉపయోగించాము (7, 23). కార్గోగా, మేము గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) తో లేబుల్ చేయబడిన C26 సెరమైడ్-ఆధారిత GPI-AP Gas1 మరియు నియర్-ఇన్‌ఫ్రారెడ్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (iRFP) తో లేబుల్ చేయబడిన ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావిత ప్రోటీన్ Mid2 లను ఎంచుకున్నాము, ఈ రెండూ ప్లాస్మా పొరను లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి (24–26). sec31-1 ఉష్ణోగ్రత-సున్నిత మ్యూటెంట్‌లో, ఈ రెండు కార్గోలు గెలాక్టోస్-ప్రేరేపిత ప్రమోటర్ మరియు ఒక రాజ్యాంగ ERES మార్కర్ కింద వ్యక్తీకరించబడతాయి. అత్యధిక ఉష్ణోగ్రత (37°C) వద్ద, sec31-1 మ్యుటేషన్ COPII కోట్ కాంపోనెంట్ Sec31 యొక్క పనితీరును ప్రభావితం చేసి COPII మొలకెత్తడాన్ని మరియు ER ఎగుమతిని నిరోధించడం వలన, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన కార్గో ER వద్ద పేరుకుపోతుంది (23). తక్కువ ఉష్ణోగ్రతకు (24°C) చల్లబరిచిన తర్వాత, sec31-1 మ్యుటెంట్ కణాలు స్రావక ప్రాంతం నుండి కోలుకున్నాయి, మరియు పేరుకుపోయిన కొత్త సింథటిక్ కార్గో ER నుండి ఎగుమతి కావడం ప్రారంభమైంది. CLIM విజువలైజేషన్ ప్రకారం, 37°C వద్ద ఇంక్యుబేషన్ చేసి, ఆపై 24°C వద్ద 5 నిమిషాలు ఉంచిన తర్వాత కూడా, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFPలలో ఎక్కువ భాగం sec31-1 మ్యుటెంట్ కణాల ERలో పేరుకుపోయి ఉన్నాయని చూపించింది (మూర్తి 1). Mid2-iRFP మొత్తం ER పొరపై విస్తరించి ఉండగా, Gas1-GFP విచ్ఛిన్నమైన ER పొర ప్రాంతంలో కేంద్రీకృతమై, పేరుకుపోయి ఉండటం వలన, వాటి పంపిణీ పూర్తిగా భిన్నంగా ఉంటుంది (మూర్తి 1, A నుండి C మరియు మూవీ S1). అదనంగా, చిత్రం 1Dలో చూపిన విధంగా, Gas1-GFP క్లస్టర్‌లో Mid2-iRFP లేదు. ఈ ఫలితాలు GPI-AP మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్లు ప్రారంభంలోనే వేర్వేరు ER పొర ప్రాంతాలలోకి వేరు చేయబడ్డాయని సూచిస్తున్నాయి. Gas1-GFP క్లస్టర్, mCherry యొక్క COPII కోట్ ప్రోటీన్ Sec13తో లేబుల్ చేయబడిన ఒక నిర్దిష్ట ERESకు ఆనుకొని ఉంది (చిత్రం 1, E మరియు F, మరియు మూవీ S1) (23).
sec31-1 కణాలు గెలాక్టోస్-ప్రేరిత స్రావాలను, ఒక పొడవైన ఎసిల్ చైన్ (C26) సెరమైడ్ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్ Mid2-iRFP (TMP, నీలం) లను వ్యక్తీకరిస్తాయి మరియు ఈ నిర్మాణాత్మక ERES లేబులింగ్ Sec13-mCherry (ERES, మెజెంటా) ను 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, 24°C కి మార్చి, 5 నిమిషాల తర్వాత SCLIM ద్వారా చిత్రీకరించారు. (A నుండి C వరకు) ఒక తలం యొక్క విలీనమైన లేదా ఒకే 2D చిత్రాన్ని (A), 10 z-సెక్షన్‌ల యొక్క 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రాన్ని (B) లేదా కార్గో మరియు ERES మార్కర్‌ల యొక్క 3D కణ అర్ధగోళ చిత్రాన్ని (C) చూపుతుంది. స్కేల్ బార్ 1μm (A మరియు B). స్కేల్ యూనిట్ 0.551μm (C). Gas1-GFP వివిక్త ER ప్రాంతాలు లేదా సమూహాలలో గుర్తించబడింది, అయితే Mid2-iRFP ER పొర అంతటా గుర్తించబడి పంపిణీ చేయబడింది (C). (D) ఈ గ్రాఫ్, ఎడమ వైపున ఉన్న తెల్లని బాణం గీత వెంబడి Gas1-GFP క్లస్టర్‌లోని Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP యొక్క సాపేక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను చూపుతుంది. AU, ఆర్బిట్రరీ యూనిట్. (E మరియు F) వస్తువులు మరియు ERES గుర్తును కలిపే 3D చిత్రాన్ని సూచిస్తాయి. నిర్దిష్ట ERES సమీపంలో Gas1-GFP క్లస్టర్‌లు కనుగొనబడ్డాయి. స్కేల్ యూనిట్ 0.551μm. (F) తెల్లని ఘన బాణం గుర్తు ERESతో అనుబంధించబడిన Gas1-GFP క్లస్టర్‌ను సూచిస్తుంది. మధ్య మరియు కుడి ప్యానెల్‌లు విలీనం చేయబడిన విస్తరించిన 3D చిత్రాన్ని మరియు ఎంచుకున్న Gas1-GFP క్లస్టర్ యొక్క తిప్పబడిన వీక్షణను చూపుతాయి.
Gas1-GFP క్లస్టర్‌కు మరియు ఒక నిర్దిష్ట ERESకు మధ్య ఉన్న సన్నిహిత ప్రాదేశిక సంబంధం, Gas1-GFP ఎంపిక చేసిన ERESలోకి ప్రవేశించగలదని సూచిస్తుంది. ఇది ER నుండి బయటకు వెళ్ళడానికి Mid2-iRFP ఉపయోగించే ఎంపికకు భిన్నమైనది. ఈ అవకాశాన్ని పరిశీలించడానికి, మేము ఒకటి లేదా రెండు కార్గోల కోసం మాత్రమే ERES నిష్పత్తిని లెక్కించాము (పటం 2, A నుండి C). చాలా ERESలలో (70%) ఒకే రకమైన కార్గో మాత్రమే ఉందని మేము కనుగొన్నాము. పటం 2C యొక్క దిగువ చిత్రం, కేవలం Gas1-GFP (పటం 1) లేదా కేవలం Mid2-iRFP (పటం 2) ఉన్న ERESలకు రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపుతుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, సుమారు 20% ERESలలో రెండు కార్గోలు ఒకే ప్రాంతంలో అతివ్యాప్తి చెంది ఉన్నాయి. కొన్ని ERESలలో (10%) రెండు రకాల కార్గోలు ఉన్నాయని కనుగొనబడింది, కానీ అవి స్పష్టంగా వేర్వేరు ప్రాంతాలలో విడిగా ఉన్నాయి. అందువల్ల, ఈ గణాంక విశ్లేషణ ప్రకారం, ER నుండి ఎగుమతి అయిన తర్వాత, GPI-AP Gas1-GFP మరియు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గో Mid2-iRFP వేర్వేరు ERESలుగా విభజించబడతాయి (పటం 2D). ఈ క్రమబద్ధీకరణ సామర్థ్యం మునుపటి జీవరసాయన విశ్లేషణ (6) మరియు రూపాత్మక నిర్ధారణ (7) లతో చాలా స్థిరంగా ఉంది. ERES లోకి ప్రవేశించే క్వారంటైన్ చేయబడిన కార్గో యొక్క ప్రవర్తనను కూడా మనం గమనించవచ్చు (మూర్తి 2E మరియు మూవీ S2). మూర్తి 2E చూపిస్తుంది, Gas1-GFP (ప్యానెల్ 3) లేదా Mid2-iRFP (ప్యానెల్ 4) లలో ఒక చిన్న భాగం మాత్రమే ఒక వైపు నుండి ERES లోకి ప్రవేశించి, ఒక ప్రత్యేక ప్రాంతంలో పరిమితం చేయబడింది. మూర్తి 2E యొక్క ప్యానెల్ 5 చూపిస్తుంది, Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP కొన్నిసార్లు ఒకే ERES లో కనిపిస్తాయి, కానీ అవి వేర్వేరు వైపుల నుండి ప్రవేశించి, వేర్వేరు COPII వెసికిల్స్‌ను సూచించే ప్రత్యేక ప్రాంతాలలో కేంద్రీకృతమై ఉంటాయి. C26 సెరమైడ్-ఆధారిత GPI-AP Gas1 యొక్క గమనించిన విభజన మరియు వర్గీకరణ సెలెక్టివ్ ERES గా నిర్దిష్టమైనదని మేము నిర్ధారించాము, ఎందుకంటే మరొక ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావ కార్గో, GFP-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్లాస్మా మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్ Axl2 (27), Mid2-iRFP మాదిరిగానే ప్రవర్తనను చూపుతుంది. (చిత్రం S1 మరియు మూవీ S3). కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Axl2-GFP, Mid2-iRFP లాగా ER పొర అంతటా పంపిణీ చేయబడుతుంది (పటం S1, A మరియు B), మరియు చాలా ERESలలో Mid2-iRFPతో సహ-స్థానీకరించబడుతుంది (పటం S1, B నుండి D). పటం 1. S1Cలోని ప్యానెల్స్ 1 మరియు 2, రెండు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గోలు అతివ్యాప్తి చెందే ERES యొక్క రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపుతాయి. ఈ సందర్భాలలో, రెండు వస్తువులు కలిసి ERESలోకి ప్రవేశిస్తాయి (పటం S1E, ప్యానెల్ 3 మరియు మూవీ S3).
గెలాక్టోస్ ప్రేరిత స్రావాలైన Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (TMP, నీలం) మరియు నిరంతర ERES లేబులింగ్ Sec13-mCherry (ERES, ముదురు గులాబీ) లను వ్యక్తీకరించే sec31-1 కణాలను 37 °C వద్ద ఉంచారు. అక్కడ 30 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేసిన తర్వాత, స్రావ నిరోధాన్ని విడుదల చేయడానికి 24 °C కి మార్చి, 20 నిమిషాల తర్వాత SCLIM తో చిత్రీకరించారు. (A నుండి C వరకు) ERES ద్వారా గుర్తించబడిన కార్గో మరియు 10 z-సెక్షన్‌ల యొక్క ప్రాతినిధ్య 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రాలు (A; స్కేల్ బార్, 1μm) లేదా 3D కణ అర్ధగోళ చిత్రాలు (B మరియు C; స్కేల్ యూనిట్, 0.456μm). (B)లోని దిగువ ప్యానెల్ మరియు (C)లోని ప్యానెల్, ERES (ముదురు గులాబీ)లో ఉన్న వస్తువులను [Gas1-GFP (బూడిద రంగు) మరియు Mid2-iRFP (లేత నీలం)] మాత్రమే ప్రదర్శించడానికి ప్రాసెస్ చేయబడిన చిత్రాలను చూపుతాయి. (C) తెరిచిన బాణం: ERES కేవలం ఒక కార్గో భాగాన్ని (1 నుండి 4) మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది. బూడిద రంగు బాణం: ERES వేరు చేయబడిన కార్గోను (5) కలిగి ఉంటుంది. తెల్లని నిరంతర బాణం: ERES కలిసి ఉన్న కార్గోను కలిగి ఉంటుంది. కింద: ఎంచుకున్న ఒకే ERES కేవలం Gas1-GFP (1) లేదా Mid2-iRFP (2) లను మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది. స్కేల్ బార్, 100 nm. (D) (C)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. కేవలం ఒక కార్గో (Gas1-GFP లేదా Mid2-iRFP), వేరు చేయబడిన కార్గో మరియు అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గోను కలిగి ఉన్న ERES యొక్క సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, 54 కణాలలో n=432. ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకల జతకాని t పరీక్ష. *** P = 0.0002. (E) (C)తో గుర్తించబడిన క్వారంటైన్ చేయబడిన కార్గో యొక్క ఎంచుకున్న ERES యొక్క 3D చిత్రం. Gas1-GFP (ఆకుపచ్చ) (3) లేదా Mid2-iRFP (నీలం) (4) ఒక వైపు నుండి ERES (మెజెంటా)లోకి ప్రవేశించి, ERES లోపల ఒక చిన్న ప్రాంతానికి పరిమితం చేయబడింది. కొన్నిసార్లు, రెండు రకాల కార్గోలు ఒకే ERES (5) లోకి ఒకే వైపు నుండి ప్రవేశించి, ERES లోపల ఒక ప్రత్యేకమైన ప్రాంతానికి పరిమితం చేయబడతాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm.
తరువాత, ER పొరలో ఉండే పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్ (C26), Gas1 యొక్క నిర్దిష్ట సమూహీకరణ మరియు సెలెక్టివ్ ERES లోకి దాని క్రమబద్ధీకరణను నడిపిస్తుందనే పరికల్పనను మేము పరీక్షించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మేము సవరించిన ఈస్ట్ స్ట్రెయిన్ GhLag1 ను ఉపయోగించాము, దీనిలో రెండు ఎండోజెనస్ సెరమైడ్ సింథేస్‌లు Lag1 మరియు Lac1 స్థానంలో GhLag1 (పత్తి యొక్క Lag1 హోమోలాగ్) ను ఉంచాము, దీని ఫలితంగా వైల్డ్ టైప్ కంటే తక్కువ సెల్ మెంబ్రేన్ సెరమైడ్ ఉన్న ఈస్ట్ స్ట్రెయిన్ ఏర్పడింది (చిత్రం 3A) (28). మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) విశ్లేషణలో వైల్డ్-టైప్ స్ట్రెయిన్‌లలో, మొత్తం సెరమైడ్‌లో 95% చాలా పొడవైన (C26) చైన్ సెరమైడ్ అని, అయితే GhLag1లో, 85% సెరమైడ్ చాలా పొడవైనది (C18 మరియు C16), కేవలం 2% సెరమైడ్ మాత్రమే చాలా పొడవైన (C26) చైన్ సెరమైడ్ అని తేలింది. ఇప్పటివరకు GhLag1 పొరలో C18 మరియు C16 సెరమైడ్‌లు ప్రధాన సెరమైడ్‌లుగా గుర్తించబడినప్పటికీ, MS విశ్లేషణలో GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లో వ్యక్తీకరించబడిన Gas1-GFP యొక్క GPI యాంకర్‌లో C26 సెరమైడ్ ఉందని కూడా నిర్ధారించబడింది, ఇది వైల్డ్-టైప్ లిపిడ్‌లతో పోల్చదగినది. నాణ్యత ఒకే విధంగా ఉంటుంది (Fig. 3A) (26). అందువల్ల, దీని అర్థం సెరమైడ్ రీమోడలింగ్ ఎంజైమ్ Cwh43, C26 సెరమైడ్ పట్ల అత్యంత ఎంపిక చేసుకునే స్వభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది, ఇది GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లోని తక్కువ మొత్తంలో ఉన్న C26 సెరమైడ్ నుండి GPI యాంకర్‌ను ప్రాధాన్యతగా చేర్చుకుంటుంది. S2 (29). అయినప్పటికీ, GhLag1 యొక్క కణ పొరలో ప్రాథమికంగా C18-C16 సెరమైడ్ మాత్రమే ఉంటుంది, అయితే Gas1-GFPలో ఇప్పటికీ C26 సెరమైడ్ ఉంటుంది. ఈ వాస్తవం, ERలోని పొర సెరమైడ్ యొక్క ఎసిల్ చైన్ పొడవు సమస్యను ప్రత్యేకంగా పరిష్కరించడానికి ఈ స్ట్రెయిన్‌ను ఒక ఆదర్శవంతమైన సాధనంగా చేస్తుంది. తరగతి మరియు క్రమబద్ధీకరణ యొక్క ఊహాజనిత పాత్ర. తరువాత, మేము మొదటగా, సాంప్రదాయ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా, sec31-1 యొక్క ఉష్ణోగ్రత-సున్నిత మ్యూటెంట్ అల్లెల్‌తో కూడిన GhLag1లో C26 Gas1-GFP సమూహాలుగా పేరుకుపోయే సామర్థ్యాన్ని అధ్యయనం చేసాము, ఇక్కడ ER పొర సెరమైడ్‌లో పొడవైన (C18-C16) గొలుసు మాత్రమే ఉంటుంది (పటం 3). మేము గమనించినదేమిటంటే, sec31-1లో, చాలా వరకు Gas1-GFP సమూహాలుగా కేంద్రీకృతమై ఉంది, అయితే పొడవైన (C18-C16) సెరమైడ్ ER పొరతో ఉన్న sec31-1 GhLag1లోని Gas1-GFP ప్రధానంగా సమూహాలుగా ఏర్పడకుండా, మొత్తం ER పొర అంతటా విస్తరించి ఉంది. కచ్చితంగా చెప్పాలంటే, C26 సెరమైడ్-ఆధారిత సమూహీకరణ నిర్దిష్ట ERES (పటం 1)తో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉన్నందున, ఈ ప్రక్రియలో ER ఎగుమతి ప్రోటీన్ యంత్రాంగం యొక్క పనితీరు కూడా పాలుపంచుకుంటుందేమోనని మేము తదుపరి పరిశోధించాము. GPI-AP, ER ఎగుమతి కోసం ఒక ప్రత్యేకమైన COPII వ్యవస్థను ఉపయోగిస్తుంది, ఇది GPI యాంకర్ యొక్క గ్లైకాన్ భాగాన్ని Ted1 నిర్మాణాత్మకంగా పునర్నిర్మించడం ద్వారా చురుకుగా నియంత్రించబడుతుంది (30, 31). పునఃసంయోజక GPI-గ్లైకాన్‌ను అప్పుడు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కార్గో రిసెప్టర్ p24 కాంప్లెక్స్ గుర్తిస్తుంది, ఇది ప్రధాన COPII కార్గో బైండింగ్ సబ్‌యూనిట్ Sec24 యొక్క నిర్దిష్ట ఐసోఫార్మ్ అయిన Lst1ను ఎంపికగా నియమించుకుంటుంది, దీనివల్ల GPI-AP-రిచ్ COPII వెసికిల్స్ ఏర్పడతాయి, ఇవి అవసరం (31-33). అందువల్ల, మేము ఈ సింగిల్ ప్రోటీన్‌ల (p24 కాంప్లెక్స్ కాంపోనెంట్ Emp24, GPI-గ్లైకాన్ రీమోడలింగ్ ఎంజైమ్ Ted1 మరియు నిర్దిష్ట COPII సబ్‌యూనిట్ Lst1) తొలగింపును sec31-1 మ్యూటెంట్ స్ట్రెయిన్‌తో కలిపి ఒక డబుల్ మ్యూటెంట్‌ను నిర్మించాము మరియు Gas1-క్లస్టర్ GFPని ఏర్పరచడం సాధ్యమేనా అని అధ్యయనం చేసాము (చిత్రం 3). మేము గమనించినదేమిటంటే, sec31-1emp24Δ మరియు sec31-1ted1Δ లలో, Gas1-GFP ప్రధానంగా సమూహాలుగా ఏర్పడకుండా ER పొర అంతటా విస్తరించి ఉంది, ఇది గతంలో sec31-1 GhLag1 లో చూసినట్లే ఉంది, అయితే sec31-1lst1Δ లో, Gas1-GFP sec31-1 లాగా ఉంది. ఈ ఫలితాలు సూచించేదేమిటంటే, ER పొరలో C26 సెరమైడ్ ఉండటంతో పాటు, Gas1-GFP సమూహాలుగా ఏర్పడటానికి p24 కాంప్లెక్స్‌కు బంధించడం కూడా అవసరం, మరియు దీనికి నిర్దిష్ట Lst1 నియామకం అవసరం లేదు. ఆ తర్వాత, ER పొరలోని సెరమైడ్ యొక్క గొలుసు పొడవు Gas1-GFP, p24కు బంధించడాన్ని నియంత్రించగలదనే అవకాశాన్ని మేము పరిశోధించాము. అయితే, పొరలో C18-C16 సెరమైడ్ ఉండటం అనేది p24 కాంప్లెక్స్ ద్వారా పునర్నిర్మించబడిన GPI-గ్లైకాన్‌లను (పటాలు S3 మరియు S4, A మరియు B) లేదా GPI-APకు బంధించడాన్ని మరియు GPI-APను ఎగుమతి చేసే సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేయదని మేము కనుగొన్నాము. COPII ఉపరకం Lst1ను నియమించుకోండి (పటం S4C). అందువల్ల, C26 సెరమైడ్-ఆధారిత క్లస్టరింగ్‌కు వివిధ ER ఎగుమతి ప్రోటీన్ యంత్రాంగాలతో ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు అవసరం లేదు, కానీ లిపిడ్ పొడవు ద్వారా నడిచే ప్రత్యామ్నాయ క్రమబద్ధీకరణ యంత్రాంగానికి మద్దతు ఇస్తుంది. అప్పుడు, Gas1-GFPని సెలెక్టివ్ ERESగా సమర్థవంతంగా వర్గీకరించడానికి ER పొరలోని సెరమైడ్ ఎసిల్ గొలుసు పొడవు ముఖ్యమైనదా కాదా అని మేము విశ్లేషించాము. పొట్టి-గొలుసు సెరమైడ్ ఉన్న GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లోని Gas1 ER నుండి బయటకు వెళ్లి ప్లాస్మా పొరలోకి ప్రవేశిస్తుంది కాబట్టి (పటం S5), క్రమబద్ధీకరణ సెరమైడ్ ఎసిల్ గొలుసు పొడవు ద్వారా నడపబడితే, GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లోని Gas1 దారి మళ్లించబడి, అదే పొరతో ERES వస్తువులను దాటగలదని మేము నమ్ముతున్నాము.
(ఎ) GhLag1 యొక్క కణ త్వచం ప్రధానంగా పొట్టి C18-C16 సెరమైడ్‌లను కలిగి ఉంటుంది, అయితే Gas1-GFP యొక్క GPI యాంకర్ వైల్డ్-టైప్ కణాల మాదిరిగానే C26 IPCని కలిగి ఉంటుంది. పైన: మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) ద్వారా వైల్డ్-టైప్ (Wt) మరియు GhLag1p స్ట్రెయిన్‌ల కణ త్వచంలోని సెరమైడ్ యొక్క ఎసైల్ చైన్ పొడవు విశ్లేషణ. ఈ డేటా మొత్తం సెరమైడ్ శాతాన్ని సూచిస్తుంది. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు. ఎర్రర్ బార్ = SD. టూ-టెయిల్డ్ అన్‌పెయిర్డ్ t టెస్ట్. **** P ＜0.0001. కింది ప్యానెల్: వైల్డ్-టైప్ మరియు GhLag1p స్ట్రెయిన్‌లలో వ్యక్తమయ్యే Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI యాంకర్‌లో ఉన్న IPC యొక్క ఎసైల్ చైన్ పొడవు యొక్క MS విశ్లేషణ. ఈ డేటా మొత్తం IPC సిగ్నల్ శాతాన్ని సూచిస్తుంది. ఐదు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు. ఎర్రర్ బార్ = SD. టూ-టెయిల్డ్ అన్‌పెయిర్డ్ t టెస్ట్. ns, ముఖ్యం కాదు. P = 0.9134. (B) గెలాక్టోస్-ప్రేరిత Gas1-GFPని వ్యక్తీకరించే sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ మరియు sec31-1lst1Δ కణాల ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లను 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆ తర్వాత సాధారణ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీని నిర్వహించడానికి 24°Cకి తగ్గించారు. తెల్లని బాణం: ER Gas1-GFP క్లస్టర్. ఖాళీ బాణం: క్లస్టర్ కాని Gas1-GFP మొత్తం ER పొరపై విస్తరించి, ER యొక్క లక్షణమైన న్యూక్లియర్ రింగ్ స్టెయినింగ్‌ను చూపుతోంది. స్కేల్ బార్, 5μm. (C) (B)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. చుక్కల వంటి Gas1-GFP నిర్మాణం ఉన్న కణాల సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, n≥300 కణాలు. ఎర్రర్ బార్ = SD. టూ-టెయిల్డ్ అన్‌పెయిర్డ్ t పరీక్ష. **** P ＜0.0001.
ఈ సమస్యను నేరుగా పరిష్కరించడానికి, మేము sec31-1 ఉష్ణోగ్రత-సున్నిత మ్యూటెంట్ అల్లెల్‌తో GhLag1లో Gas1-GFP మరియు Mid2-iRFP యొక్క SCLIM విజువలైజేషన్‌ను నిర్వహించాము (పటం 4 మరియు మూవీ S4). ERను 37°C వద్ద ఉంచి, ఆ తర్వాత 24°C వద్ద విడుదల చేసినప్పుడు, సాంప్రదాయ మైక్రోస్కోప్‌ల ద్వారా గమనించినట్లుగా, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFPలో ఎక్కువ భాగం ER పొర అంతటా గుంపులుగా ఏర్పడకుండా విస్తరించి ఉంది (పటం 4, A మరియు B). అదనంగా, అధిక శాతం ERES (67%)లో రెండు రకాల కార్గోలు కలిసి ఉన్నాయి (పటం 4D). పటం 4Cలోని ప్యానెల్స్ 1 మరియు 2, Gas1-GFP మరియు Mid2-GFP ఒకదానిపై ఒకటి అతివ్యాప్తి చెందిన ERES యొక్క రెండు సాధారణ ఉదాహరణలను చూపుతాయి. అంతేకాకుండా, ఈ రెండు కార్గోలు ఒకే ERESలోకి చేర్చబడ్డాయి (పటం 4E, ప్యానెల్ 3 మరియు మూవీ S4). అందువల్ల, ER పొరలోని సెరమైడ్ ఎసిల్ చైన్ పొడవు, ER ప్రోటీన్ల సమూహీకరణ మరియు వర్గీకరణకు ఒక ముఖ్యమైన నిర్ణాయకం అని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
గాలక్టోస్-ప్రేరిత స్రావాలు, Gas1-GFP (GPI-AP, ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (TMP, నీలం) మరియు కాన్‌స్టిట్యూటివ్ ERES-లేబుల్డ్ Sec13-mCherry (ERES, మెజెంటా) లను వ్యక్తీకరించే Sec31-1 GhLag1 కణాలను 37°C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేయండి. 30 నిమిషాల పాటు కొనసాగించి, స్రావాలను విడుదల చేయడానికి 24°C కి తగ్గించి, 20 నిమిషాల తర్వాత SCLIM తో ఇమేజ్ చేయండి. (A నుండి C వరకు) కార్గో మరియు ERES ద్వారా గుర్తించబడిన 10 z-సెక్షన్‌ల యొక్క ప్రాతినిధ్య 2D ప్రొజెక్షన్ చిత్రాలు (A; స్కేల్ బార్, 1μm) లేదా 3D కణ అర్ధగోళ చిత్రాలు (B మరియు C; స్కేల్ యూనిట్, 0.45μm). (B)లోని దిగువ ప్యానెల్ మరియు (C)లోని ప్యానెల్, ERES (మెజెంటా)లో ఉన్న వస్తువులను [Gas1-GFP (బూడిద రంగు) మరియు Mid2-iRFP (లేత నీలం)] మాత్రమే ప్రదర్శించడానికి ప్రాసెస్ చేయబడిన చిత్రాలను చూపుతాయి. (C) తెలుపు రంగుతో నింపిన బాణం: ERES, వస్తువులు అతివ్యాప్తి చెందాయి. తెరిచిన బాణం: ERESలో ఒకే ఒక అంశం ఉంది. దిగువ ప్యానెల్: ఎంచుకున్న ERESలో (C)లో గుర్తించబడిన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న వస్తువులు (1 మరియు 2) ఉన్నాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm. (D) (C)లో వివరించిన ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ యొక్క పరిమాణీకరణ. sec31-1 మరియు sec31-1 GhLag1 యూనిట్లలో, ఒకే ఒక కార్గో (Gas1-GFP లేదా Mid2-iRFP) చేర్చబడింది, మరియు వివిక్త కార్గో మరియు అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గో కోసం ERES యొక్క సగటు శాతం. మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో, 54 కణాలలో n = 432 (sec31-1) మరియు 47 కణాలలో n = 430 (sec31-1 GhLag1). ఎర్రర్ బార్ = SD. రెండు-తోకల జతకాని t పరీక్ష. *** P = 0.0002 (sec31-1) మరియు ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)లో గుర్తించబడిన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్గో (3)తో ఎంచుకున్న ERES యొక్క 3D చిత్రం. Gas1-GFP (ఆకుపచ్చ) మరియు Mid2-iRFP (నీలం) లు ఒకే వైపు నుండి ERES (మెజెంటా) ను సమీపించి, అదే ERES పరిమిత ప్రాంతంలో ఉంటాయి. స్కేల్ బార్, 100 nm.
ఈ అధ్యయనం, లిపిడ్-ఆధారిత ప్రోటీన్ కార్గోలు స్రావ మార్గంలో ఎంపిక చేసిన ఎగుమతి ప్రదేశాలుగా వర్గీకరించబడతాయని ప్రత్యక్ష ఇన్ వివో సాక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది మరియు వర్గీకరణ ఎంపికకు ఎసిల్ చైన్ పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను వెల్లడిస్తుంది. SCLIM అనే శక్తివంతమైన మరియు అత్యాధునిక మైక్రోస్కోపీ పద్ధతిని ఉపయోగించి, మేము ఈస్ట్‌లో కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన Gas1-GFP (చాలా పొడవైన ఎసిల్ చైన్ (C26) సెరమైడ్ లిపిడ్ భాగాన్ని కలిగి ఉన్న ఒక ప్రధాన ప్లాస్మా మెంబ్రేన్ GPI-AP) ను ప్రదర్శించాము. వివిక్త ER లలో సమూహంగా ఉన్న ప్రాంతాలు నిర్దిష్ట ERES లతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి, అయితే ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావ ప్రోటీన్లు ER పొర అంతటా పంపిణీ చేయబడతాయి (మూర్తి 1). అదనంగా, ఈ రెండు రకాల వస్తువులు వేర్వేరు ERES లలోకి ఎంపికగా ప్రవేశిస్తాయి (మూర్తి 2). పొరలోని సెల్యులార్ సెరమైడ్ యొక్క ఎసిల్ చైన్ పొడవు C26 నుండి C18-C16 కు తగ్గించబడినప్పుడు, Gas1-GFP సమూహం వివిక్త ER ప్రాంతంలోకి విచ్ఛిన్నమవుతుంది మరియు Gas1-GFP అదే ERES ద్వారా ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌తో కలిసి ER నుండి బయటకు వెళ్ళడానికి మళ్ళించబడుతుంది (మూర్తి 3 మరియు మూర్తి 4).
GPI-AP, ER నుండి బయటకు వెళ్ళడానికి ఒక ప్రత్యేకమైన ప్రోటీన్ యంత్రాంగాన్ని ఉపయోగించినప్పటికీ, C26 సెరమైడ్-ఆధారిత విభజన అనేది ERES ప్రత్యేకతకు దారితీసే భేదాత్మక ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలపై ఆధారపడదని మేము కనుగొన్నాము (పటాలు S4 మరియు S5). దానికి బదులుగా, మా పరిశోధనలు లిపిడ్-ఆధారిత ప్రోటీన్ సమూహాలుగా ఏర్పడటం మరియు తదనంతరం ఇతర కార్గోలను మినహాయించడం ద్వారా నడిచే ఒక ప్రత్యామ్నాయ వర్గీకరణ యంత్రాంగానికి మద్దతు ఇస్తున్నాయి. మా పరిశీలనల ప్రకారం, ఒక నిర్దిష్ట ERESతో సంబంధం ఉన్న Gas1-GFP ప్రాంతం లేదా సమూహంలో ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావిత ప్రోటీన్ Mid2-iRFP ఉండదు. ఇది C26 సెరమైడ్-ఆధారిత GPI-AP సమూహం, సంబంధిత ERESలోకి వాటి ప్రవేశాన్ని సులభతరం చేస్తుందని, అదే సమయంలో, ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావాలను ఈ ప్రత్యేక ERESలోకి ప్రవేశించకుండా మినహాయిస్తుందని సూచిస్తుంది (పటాలు 1 మరియు 2). దీనికి విరుద్ధంగా, ER పొరలో C18-C16 సెరమైడ్‌లు ఉండటం వల్ల GPI-AP ప్రాంతాలు లేదా సమూహాలుగా ఏర్పడదు, కాబట్టి అవి ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ స్రావిత ప్రోటీన్‌లను అదే ERESలోకి మినహాయించవు లేదా వాటి స్థానంలోకి రావు (పటాలు 3 మరియు 4). అందువల్ల, నిర్దిష్ట ERES లకు అనుసంధానించబడిన ప్రోటీన్ల సమూహాన్ని సులభతరం చేయడం ద్వారా C26 సెరమైడ్ విభజన మరియు వర్గీకరణను నడిపిస్తుందని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము.
ఒక నిర్దిష్ట ER ప్రాంతంలో ఈ C26 సెరమైడ్-ఆధారిత క్లస్టరింగ్‌ను ఎలా సాధించాలి? పొర సెరమైడ్ పార్శ్వంగా వేరుపడే ధోరణి, పొట్టి మరియు అసంతృప్త గ్లిసరోలిపిడ్‌లను కలిగి ఉన్న ER పొర యొక్క మరింత క్రమరహిత లిపిడ్ వాతావరణంలో GPI-AP మరియు C26 సెరమైడ్ చిన్న మరియు తక్షణమే క్రమబద్ధమైన లిపిడ్‌లను ఏర్పరచడానికి కారణం కావచ్చు. నాణ్యమైన క్లస్టర్‌లు (17, 18). ఈ చిన్న తాత్కాలిక క్లస్టర్‌లు p24 కాంప్లెక్స్‌కు బంధించిన తర్వాత పెద్ద, మరింత స్థిరమైన క్లస్టర్‌లుగా మరింతగా కలపబడతాయి (34). దీనికి అనుగుణంగా, పెద్ద కనిపించే క్లస్టర్‌లను ఏర్పరచడానికి C26 Gas1-GFP తప్పనిసరిగా p24 కాంప్లెక్స్‌తో సంకర్షణ చెందాలని మేము చూపించాము (చిత్రం 3). p24 కాంప్లెక్స్ అనేది ఈస్ట్‌లో నాలుగు విభిన్న p24 ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్‌లతో కూడిన ఒక హెటెరోజైగస్ ఒలిగోమర్ (35), ఇది బహుళ బంధాన్ని అందిస్తుంది, ఇది చిన్న GPI-AP క్లస్టర్‌ల క్రాస్-లింకింగ్‌కు దారితీస్తుంది, తద్వారా పెద్ద స్థిరమైన క్లస్టర్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తుంది (34). క్షీరదాల ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాలలో వాటి గోల్గి రవాణా సమయంలో చూపినట్లుగా (36), GPI-APల ప్రోటీన్ ఎక్టోడొమైన్‌ల మధ్య పరస్పర చర్య కూడా వాటి సమూహానికి దోహదపడవచ్చు. అయితే, ER పొరలో C18-C16 సెరమైడ్ ఉన్నప్పుడు, p24 కాంప్లెక్స్ Gas1-GFPకి బంధించినప్పుడు, పెద్ద వేర్వేరు సమూహాలు ఏర్పడవు. అంతర్లీన యంత్రాంగం పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్ యొక్క నిర్దిష్ట భౌతిక మరియు రసాయన లక్షణాలపై ఆధారపడి ఉండవచ్చు. కృత్రిమ పొరల యొక్క బయోఫిజికల్ అధ్యయనాలు పొడవైన (C24) మరియు పొట్టి (C18-C16) ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్‌లు రెండూ దశ విభజనకు కారణం కాగలవని చూపిస్తున్నప్పటికీ, పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్‌లు (C24) మాత్రమే అధిక వక్రతను మరియు ఫిల్మ్ బెండింగ్‌ను ప్రోత్సహించి ఫిల్మ్‌ను పునరాకృతి చేయగలవని చూపిస్తున్నాయి. పరస్పర సూచన ద్వారా (17, 37, 38). Emp24 యొక్క మానవ హోమోలాగ్ అయిన TMED2 యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్, సైటోప్లాస్మిక్ లోబ్యూల్స్‌లో C18 సెరమైడ్-ఆధారిత స్ఫింగోమైలిన్‌తో ఎంపికగా సంకర్షణ చెందుతుందని చూపబడింది (39). మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ (MD) సిమ్యులేషన్‌లను ఉపయోగించి, C18 మరియు C26 సెరమైడ్‌లు రెండూ Emp24 ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ లోబ్యూల్స్ చుట్టూ పేరుకుపోతాయని మరియు అవి సారూప్య ప్రాధాన్యతలను కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి S6). ఇది గమనించదగ్గ విషయం, ఇది Emp24 యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ పొరలో లిపిడ్‌ల అసమాన పంపిణీకి దారితీస్తుందని సూచిస్తుంది. ఇది క్షీరద కణాల ఆధారంగా వచ్చిన ఇటీవలి ఫలితం. ఇలాంటి MD సిమ్యులేషన్‌లు ఈథర్ లిపిడ్‌ల ఉనికిని కూడా చూపుతాయి (40). అందువల్ల, ER26 యొక్క రెండు లోబ్యూల్స్‌లో C26 సెరమైడ్ స్థానికంగా సమృద్ధిగా ఉంటుందని మేము ఊహిస్తున్నాము. ల్యూమినల్ లోబ్యూల్స్‌లోని GPI-AP నేరుగా మల్టీవాలెంట్ p24కు బంధించినప్పుడు మరియు సైటోప్లాస్మిక్ లోబ్యూల్స్‌లో p24 చుట్టూ C26 సెరమైడ్ పేరుకుపోవడం వల్ల, ఇది ఫింగర్స్ (41) ద్వారా ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్ మరియు మెంబ్రేన్ కర్వేచర్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది, దీనివల్ల GPI-AP, ERESకు ఆనుకొని ఉన్న వివిక్త ప్రాంతాలుగా విడిపోతుంది, ఇది ER మెంబ్రేన్ యొక్క అధిక వంపు ప్రాంతాలకు కూడా అనుకూలంగా ఉంటుంది (42). మునుపటి నివేదికలు ప్రతిపాదిత యంత్రాంగానికి మద్దతు ఇచ్చాయి (43, 44). ప్లాస్మా మెంబ్రేన్‌పై ఉన్న సెరమైడ్-ఆధారిత గ్లైకోస్ఫింగోలిపిడ్స్ (GSL)కు ఒలిగోలెక్టిన్‌లు, వ్యాధికారకాలు లేదా యాంటీబాడీల మల్టీవాలెంట్ బైండింగ్, పెద్ద GSL అగ్రిగేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది, ఫేజ్ సెపరేషన్‌ను పెంచుతుంది మరియు మెంబ్రేన్ డిఫార్మేషన్ మరియు ఇంటర్నలైజేషన్‌కు కారణమవుతుంది (44). ఇవాబుచి మొదలైనవారు (43) పొడవైన (C24) కానీ పొట్టి (C16) ఎసిల్ గొలుసులు లేకుండా, GSL లాక్టోసిల్సెరామైడ్‌కు బంధించబడిన మల్టీవాలెంట్ లిగాండ్ పెద్ద సమూహాల ఏర్పాటును మరియు పొర లోపలికి ముడుచుకోవడాన్ని ప్రేరేపిస్తుందని మరియు జతచేయబడిన న్యూట్రోఫిల్‌లలో లీఫ్‌లెట్‌లపై సైటోప్లాజం Lyn-మధ్యవర్తిత్వ సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ ఎసిల్ గొలుసుల ద్వారా అంతరాయం కలిగి ఉంటుందని కనుగొనబడింది.
క్షీరదాల ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాలలో, అపికల్ ప్లాస్మా పొర స్థాయికి యాంటీ-గోల్గి నెట్‌వర్క్ (TGN) యొక్క సాంద్రత GPI-AP యొక్క విభజన మరియు క్రమబద్ధీకరణను నియంత్రిస్తుంది (10, 45). ఈ సమూహీకరణ GPI-AP ఒలిగోమెరైజేషన్ ద్వారా నడపబడుతుంది (36), కానీ ఇది ఈస్ట్‌లో మనం కనుగొనే సెరమైడ్ గొలుసు పొడవుపై కూడా ఆధారపడి ఉండవచ్చు. క్షీరదాల GPI-AP ఈథర్ లిపిడ్-ఆధారిత యాంకర్‌ను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, మరియు దాని రసాయన నిర్మాణం చాలా పొడవైన ఎసిల్ గొలుసు సెరమైడ్ నుండి చాలా భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ, ఇటీవలి అధ్యయనంలో ఈ రెండు లిపిడ్‌లు పరిణామపరంగా సారూప్య భౌతిక మరియు రసాయన లక్షణాలను మరియు పనితీరును కలిగి ఉన్నాయని కనుగొనబడింది (40). అందువల్ల, క్షీరద కణాలలోని ఈథర్ లిపిడ్ భాగం ఈస్ట్‌లోని C26 సెరమైడ్‌ను పోలి ఉండవచ్చు, మరియు దాని పాత్ర పొరలోని పొడవైన గొలుసు సెరమైడ్‌తో కలిసి GPI-AP సమూహీకరణ మరియు క్రమబద్ధీకరణను ప్రోత్సహించడం. ఈ అవకాశాన్ని ఇంకా ప్రత్యక్షంగా పరీక్షించాల్సి ఉన్నప్పటికీ, పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్ యొక్క గోల్గి బాడీకి రవాణా సైటోప్లాస్మిక్ బదిలీ ప్రోటీన్ల ద్వారా జరగదని, కానీ ఈస్ట్ లాగా GPI యాంకర్ల సంశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుందని మునుపటి పరిశోధనలు సమర్థిస్తున్నాయి. అందువల్ల, పరిణామపరంగా సంరక్షించబడిన యంత్రాంగం చాలా పొడవైన ఎసిల్ చైన్ సెరమైడ్ మరియు GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) లను ఒకే రవాణా వెసికిల్‌లో ఎంపికగా సహ-రవాణా చేయగలదని తెలుస్తోంది.
ఈస్ట్ మరియు క్షీరదాల ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణ వ్యవస్థలలో, GPI-AP సమూహీకరణ మరియు ఇతర ప్లాస్మా పొర ప్రోటీన్ల నుండి వేరుచేయడం అన్నీ కణ ఉపరితలానికి చేరడానికి ముందే జరుగుతాయి. పాలడినో మరియు ఇతరులు (48) కనుగొన్నది ఏమిటంటే, క్షీరదాల ధ్రువణ ఎపిథీలియల్ కణాల TGN పై, GPI-AP సమూహీకరణ అనేది GPI-AP లను అపికల్ ప్లాస్మా పొరకు ఎంపికగా వర్గీకరించడానికి అవసరం మాత్రమే కాకుండా, GPI-AP ల సమూహీకరణ వ్యవస్థీకరణను మరియు దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను కూడా నియంత్రిస్తుంది. కణ ఉపరితలం. ఈస్ట్‌లో, ఈ అధ్యయనం ER పై ఉన్న C26 సెరమైడ్-ఆధారిత GPI-AP సమూహం ప్లాస్మా పొరపై GPI-AP యొక్క సమూహ వ్యవస్థీకరణ మరియు క్రియాత్మక కార్యకలాపాలను నియంత్రించగలదని చూపించింది (24, 49). ఈ నమూనాకు అనుగుణంగా, GhLag1 కణాలు GPI నిరోధకాలకు లేదా కణ గోడ సమగ్రతను ప్రభావితం చేసే మందులకు అలెర్జీని కలిగి ఉంటాయి (28), మరియు ఈస్ట్ కణాల సంయోగంలో ప్రొజెక్ట్ చేయబడిన టిప్ సెరామైడ్ యొక్క క్రియాత్మక Gas1-GFP క్లస్టర్‌ల (49) అవసరం hLag1 కణాల యొక్క GPI-AP లోపాన్ని సూచిస్తుంది. ఏదేమైనా, లిపిడ్ పొడవు ఆధారంగా సార్టింగ్ పద్ధతి ద్వారా కణ ఉపరితలం యొక్క క్రియాత్మక సంస్థ ER నుండి ప్రోగ్రామ్ చేయబడిందా అనే దానిపై మరింత పరీక్ష మా భవిష్యత్ పరిశోధన యొక్క అంశం అవుతుంది.
ఈ పనిలో ఉపయోగించిన సాక్రోమైసెస్ సెరెవిసియా జాతులు పట్టిక S1లో జాబితా చేయబడ్డాయి. లైవ్ సెల్ ఇమేజింగ్ కోసం SCLIM యొక్క MMY1583 మరియు MMY1635 జాతులు W303 నేపథ్యంలో నిర్మించబడ్డాయి. ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ ట్యాగ్‌తో Sec13-mCherryని వ్యక్తీకరించే ఈ జాతులు pFA6a ప్లాస్మిడ్‌ను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించి పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR)-ఆధారిత పద్ధతి ద్వారా నిర్మించబడ్డాయి (23). GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌తో లేబుల్ చేయబడిన Mid2-iRFPని వ్యక్తీకరించే జాతి ఈ క్రింది విధంగా నిర్మించబడింది. pKTiRFP-KAN వెక్టర్ నుండి iRFP-KanMx సీక్వెన్స్ యొక్క PCR విస్తరణ (E. O'Shea బహుమతి, యాడ్‌జీన్ ప్లాస్మిడ్ నంబర్ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; పరిశోధన వనరుల ఐడెంటిఫైయర్ (RRID): Addgene_64687) మరియు ఎండోజెనస్ Mid2 యొక్క C-టెర్మినస్‌లోకి చొప్పించబడింది. Mid2-iRFP జన్యు శ్రేణిని విస్తరించి GAL1 ప్రమోటర్‌లోకి క్లోన్ చేసిన తర్వాత, దానిని ఇంటిగ్రేషన్ ప్లాస్మిడ్ pRS306 యొక్క Not I-Sac I సైట్‌లో విలీనం చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్ pRGS7ను URA3 లోకస్‌లో విలీనం చేయడానికి Pst Iతో సరళీకరించారు.
Gas1-GFP ఫ్యూజన్ జన్యువు, ఈ క్రింది విధంగా నిర్మించబడిన సెంట్రోమియర్ (CEN) ప్లాస్మిడ్‌లోని GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది. Gas1-GFP సీక్వెన్స్‌ను pRS416-GAS1-GFP ప్లాస్మిడ్ (24) (L. పోపోలో బహుమతి) నుండి PCR ద్వారా విస్తరించబడింది మరియు CEN ప్లాస్మిడ్ pBEVY-GL LEU2 (C. మిల్లర్ బహుమతి; యాడ్‌జీన్ ప్లాస్మిడ్ నంబర్ 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225) యొక్క Xma I–Xho I సైట్‌లో క్లోన్ చేయబడింది. ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్‌కు pRGS6 అని పేరు పెట్టారు. Axl2-GFP ఫ్యూజన్ జన్యువు కూడా pBEVY-GL LEU2 వెక్టర్ యొక్క GAL1 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు దాని నిర్మాణం ఈ క్రింది విధంగా ఉంటుంది. Axl2-GFP సీక్వెన్స్‌ను pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ప్లాస్మిడ్ (23) నుండి PCR ద్వారా యాంప్లిఫై చేసి, pBEVY-GL LEU2 వెక్టర్ యొక్క Bam HI-Pst I సైట్‌లో క్లోన్ చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన ప్లాస్మిడ్‌కు pRGS12 అని పేరు పెట్టారు. ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల సీక్వెన్స్ టేబుల్ S2లో జాబితా చేయబడింది.
పోషణకు అవసరమైన సరైన అమైనో ఆమ్లాలు మరియు క్షారాలను అందించడానికి, ఈ స్ట్రెయిన్‌కు 0.2% అడెనైన్ మరియు 2% గ్లూకోజ్ [YP-డెక్స్‌ట్రోజ్ (YPD)], 2% రాఫినోజ్ [YP-రాఫినోజ్] అధికంగా ఉన్న యీస్ట్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ ప్రోటీన్ పి (YP) మీడియం (1% యీస్ట్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ మరియు 2% ప్రోటీన్ ఇపిటి (YPR)] లేదా కార్బన్ వనరుగా 2% గెలాక్టోజ్ [YP-గెలాక్టోజ్ (YPG)] లేదా ఒక సింథటిక్ మినిమల్ మీడియం (0.15% యీస్ట్ నైట్రోజన్ బేస్ మరియు 0.5% అమ్మోనియం సల్ఫేట్) జోడించబడింది, మరియు కార్బన్ వనరుగా 2% గ్లూకోజ్ (సింథటిక్ గ్లూకోజ్ మినిమల్ మీడియం) లేదా 2% గెలాక్టోజ్ (సింథటిక్ గెలాక్టోజ్ మినిమల్ మీడియం) కలిగి ఉంది.
రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్ కోసం, GAL1 ప్రమోటర్ కింద కన్‌స్ట్రక్ట్‌ను వ్యక్తీకరించే ఉష్ణోగ్రత-సున్నితమైన sec31-1 మ్యూటెంట్ కణాలను YPR మాధ్యమంలో 24°C వద్ద రాత్రిపూట మిడ్-లాగ్ దశ వరకు పెంచారు. 24°C వద్ద 1 గంట పాటు YPGలో ప్రేరేపించిన తర్వాత, కణాలను SGలో 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై స్రావ నిరోధం నుండి విడుదల చేయడానికి 24°Cకి మార్చారు. కణాలను గ్లాస్ స్లైడ్‌పై స్థిరపరచడానికి కాంకావాలిన్ Aను ఉపయోగించారు మరియు SCLIM ద్వారా చిత్రీకరించారు. SCLIM అనేది ఒలింపస్ IX-71 ఇన్వర్టెడ్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్ మరియు UPlanSApo 100×1.4 న్యూమరికల్ అపర్చర్ ఆయిల్ లెన్స్ (ఒలింపస్), హై-స్పీడ్ మరియు హై-సిగ్నల్-టు-నాయిస్ రేషియో రొటేటింగ్ డిస్క్ కాన్ఫోకల్ స్కానర్ (యోకోగావా ఎలక్ట్రిక్), కస్టమ్ స్పెక్ట్రోమీటర్, మరియు కస్టమ్ కూలింగ్‌ల కలయిక. ఈ సిస్టమ్ యొక్క ఇమేజ్ ఇంటెన్సిఫైయర్ (హమామాట్సు ఫోటోనిక్స్) ×266.7 తుది మాగ్నిఫికేషన్‌తో మాగ్నిఫైయింగ్ లెన్స్ సిస్టమ్‌ను మరియు ఎలక్ట్రాన్‌లను గుణించే ఛార్జ్-కపుల్డ్ డివైస్ కెమెరాను (హమామాట్సు ఫోటోనిక్స్) (21) అందించగలదు. ఇమేజ్ అక్విజిషన్ కస్టమ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (యోకోగావా ఎలక్ట్రిక్) ద్వారా నిర్వహించబడుతుంది. 3D చిత్రాల కోసం, మేము ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్‌ను నిలువుగా వైబ్రేట్ చేయడానికి కస్టమ్-మేడ్ పీజోఎలెక్ట్రిక్ యాక్యుయేటర్‌ను ఉపయోగించాము మరియు 100 nm దూరంలో ఉన్న ఆప్టికల్ భాగాలను ఒక స్టాక్‌లో సేకరించాము. Z-స్టాక్ ఇమేజ్ 3D వోక్సెల్ డేటాగా మార్చబడుతుంది, మరియు రొటేటింగ్ డిస్క్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ కోసం ఉపయోగించే సైద్ధాంతిక పాయింట్ స్ప్రెడ్ ఫంక్షన్‌ను వోలోసిటీ సాఫ్ట్‌వేర్ (పెర్కిన్‌ఎల్‌మర్) ద్వారా డీకన్వల్యూషన్ ప్రాసెసింగ్ కోసం ఉపయోగిస్తారు. సహ-స్థాన విశ్లేషణ కోసం వోలోసిటీ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి ఆటోమేటిక్‌గా థ్రెషోల్డ్ చేయడం ద్వారా, కార్గోతో సహా ERES కొలవబడింది. మెటామార్ఫ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (మాలిక్యులర్ డివైసెస్) ఉపయోగించి లైన్ స్కాన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది.
గణాంక ప్రాముఖ్యతను నిర్ధారించడానికి గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి. రెండు-తోకల స్టూడెంట్ t-పరీక్ష మరియు సాధారణ ఒక-మార్గ విశ్లేషణ వైవిధ్యం (ANOVA) పరీక్ష కోసం, సమూహాల మధ్య తేడాలు P <0.05 (*) పై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని కలిగి ఉన్నట్లుగా పరిగణించబడతాయి.
Gas1-GFP యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ కోసం, లాగ్ ఫేజ్ కణాలను YPDలో రాత్రిపూట పెంచి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించి, ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, కనీసం 15 నిమిషాల పాటు ఐస్‌పై ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై గతంలో వివరించిన విధంగా మైక్రోస్కోప్ కింద పరిశీలించారు (చెక్ (24)). ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్, L5 (GFP) ఫిల్టర్, హమామత్సు కెమెరా మరియు అప్లికేషన్ సూట్ X (LAS X) సాఫ్ట్‌వేర్‌తో కూడిన లీకా DMi8 మైక్రోస్కోప్ (HCX PL APO 1003/1.40 ఆయిల్ PH3 CS) ను చిత్రీకరణ కోసం ఉపయోగించారు.
నమూనాలను 65°C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు SDS శాంపిల్ బఫర్‌తో విరూపణం చేసి, ఆపై SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ (PAGE) ద్వారా వేరు చేశారు. ఇమ్యునోబ్లాటింగ్ విశ్లేషణ కోసం, ప్రతి లేన్‌కు 10 μl నమూనాను లోడ్ చేశారు. ప్రాథమిక యాంటీబాడీ: 1:3000 పలుచనలో రాబిట్ పాలీక్లోనల్ యాంటీ-Gas1, 1:500 పలుచనలో రాబిట్ పాలీక్లోనల్ యాంటీ-Emp24, మరియు 1:3000 పలుచనలో రాబిట్ పాలీక్లోనల్ యాంటీ-GFP (H. రీజ్‌మాన్ నుండి బహుమతి) ఉపయోగించారు. మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీ-Pgk1 యాంటీబాడీని 1:5000 పలుచనలో ఉపయోగించారు (J. డి లా క్రూజ్ నుండి బహుమతి). ద్వితీయ యాంటీబాడీ: 1:3000 పలుచనలో ఉపయోగించిన హార్స్‌రాడిష్ పెరాక్సిడేస్ (HRP) సంయోగం చెందిన గోట్ యాంటీ-రాబిట్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ G (IgG) (పియర్స్). HRP-సంయోగం చెందిన మేక యాంటీ-మౌస్ IgG ని 1:3000 విలీనంలో (పియర్స్) ఉపయోగించారు. సూపర్‌సిగ్నల్ వెస్ట్ పికో రియాజెంట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) యొక్క కెమిల్యూమినిసెన్స్ పద్ధతి ద్వారా రోగనిరోధక ప్రతిస్పందన మండలాన్ని గమనించారు.
(31)లో వివరించినట్లుగా, సుసంపన్నమైన ER ఫ్రాక్షన్‌పై సహజ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ప్రయోగం నిర్వహించబడింది. క్లుప్తంగా, ఈస్ట్ కణాలను TNE బఫర్ [50 mM ట్రిస్-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ఫినైల్‌మిథైల్‌సల్ఫోనిల్ ఫ్లోరైడ్ మరియు ప్రొటీస్ ఇన్హిబిటర్ మిశ్రమం]తో 600 nm (OD600) వద్ద 100 ఆప్టికల్ డెన్సిటీ వద్ద రెండుసార్లు కడగాలి. దీనిని గాజు పూసలతో విచ్ఛిన్నం చేశారు, ఆపై కణ శిధిలాలు మరియు గాజు పూసలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా తొలగించారు. ఆ తర్వాత సూపర్నాటెంట్‌ను 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 17,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. పెల్లెట్‌ను TNEలో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, డిజిటాలిస్ సాపోనిన్‌ను 1% తుది గాఢతకు చేర్చారు. సస్పెన్షన్‌ను 4°C వద్ద 1 గంట పాటు భ్రమణంతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు, ఆపై కరగని భాగాలను 4°C వద్ద 60 నిమిషాల పాటు 13,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా తొలగించారు. Gas1-GFP ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ కోసం, మొదట నమూనాను ఖాళీ అగరోస్ బీడ్స్‌తో (క్రోమోటెక్) 4°C వద్ద 1 గంట పాటు ప్రీ-ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై GFP-ట్రాప్_A (క్రోమోటెక్)తో 4°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయాలి. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయబడిన బీడ్స్‌ను 0.2% డిగాక్సిజెనిన్ కలిగిన TNEతో ఐదుసార్లు కడిగి, SDS శాంపిల్ బఫర్‌తో ఎల్యూట్ చేసి, SDS-PAGEపై వేరుచేసి, ఇమ్యునోబ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు.
(31)లో వివరించినట్లుగా, సుసంపన్నమైన ER ఫ్రాక్షన్‌పై క్రాస్-లింకింగ్ నిర్ధారణ జరిగింది. క్లుప్తంగా, సుసంపన్నమైన ER ఫ్రాక్షన్‌ను 0.5 mM డైథియోబిస్(సక్సినిమిడైల్ ప్రొపియోనేట్) (పియర్స్, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, రాక్‌ఫోర్డ్, IL, USA; 20°C, 20 నిమిషాలు) తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. గ్లైసిన్ (50 mM తుది గాఢత, 5 నిమిషాలు, 20°C) కలపడం ద్వారా క్రాస్-లింకింగ్ చర్యను నిలిపివేశారు.
గతంలో వివరించినట్లుగా (50), వైల్డ్-టైప్ మరియు GhLag1 స్ట్రెయిన్‌లలో సెరామైడ్ యొక్క MS విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. క్లుప్తంగా, కణాలను 30°C వద్ద YPDలో ఘాతాంక దశకు (3 నుండి 4 OD600 యూనిట్లు/ml) పెంచారు, మరియు 25×107 కణాలను సేకరించారు. వాటి జీవక్రియను ట్రైక్లోరోఅసిటిక్ ఆమ్లంతో నిరోధించారు. వెలికితీత ద్రావణి [ఇథనాల్, నీరు, ఈథర్, పైరిడిన్ మరియు 4.2 N అమ్మోనియం హైడ్రాక్సైడ్ (15:15:5:1:0.018 v/v)] మరియు 1.2 nmol అంతర్గత ప్రామాణిక C17 సెరామైడ్ (860517, అవంతి పోలార్ లిపిడ్) నాణ్యతను ఉపయోగించండి. వెలికితీత యొక్క తేలికపాటి క్షార జలవిశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మోనోమిథైలమైన్ కారకాన్ని [మిథనాల్, నీరు, n-బ్యూటానాల్ మరియు మిథైలమైన్ ద్రావణం (4:3:1:5 v/v)] ఉపయోగించండి, ఆపై లవణాలను తొలగించడానికి నీటితో సంతృప్తమైన n-బ్యూటానాల్‌ను ఉపయోగించండి. చివరగా, సారాన్ని ఒక పాజిటివ్ మోడ్ ద్రావణిలో [క్లోరోఫామ్/మెథనాల్/నీరు (2:7:1) + 5 mM అమ్మోనియం అసిటేట్] తిరిగి కలిపి, మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. స్ఫింగోలిపిడ్ అణువులను గుర్తించడానికి మరియు వాటి పరిమాణాన్ని నిర్ధారించడానికి మల్టీ-రియాక్షన్ మానిటరింగ్ (MRM) నిర్వహించబడింది. లిపిడ్ విశ్లేషణ కోసం, TSQ వాంటేజ్ టెర్షియరీ క్వాడ్రుపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)కు నానోమేట్ HD (అడ్వియన్ బయోసైన్సెస్, ఇథాకా, NY) అనే రోబోటిక్ నానోఫ్లో అయాన్ సోర్స్ అమర్చబడింది. ప్రతి సెరమైడ్ వర్గానికి కొలిజన్ ఎనర్జీని ఆప్టిమైజ్ చేశారు. MS డేటాను పాజిటివ్ మోడ్‌లో పొందారు. ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్ కోసం, లిపిడ్ సిగ్నల్ అనేది మూడు స్వతంత్ర కొలతల మధ్యస్థం.
(31)లో వివరించినట్లుగా, Gas1-GFPని వ్యక్తీకరించే కణాలను (800×107) సహజ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్‌కు గురిచేశారు. శుద్ధి చేసిన Gas1-GFPని SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేసి, పాలివినైలిడెన్ ఫ్లోరైడ్ (PVDF) పొరపైకి బదిలీ చేశారు. అమైడ్ బ్లాక్‌తో PVDFకి రంగు వేయడం ద్వారా ప్రోటీన్‌ను దృశ్యమానం చేశారు. Gas1-GFP బ్యాండ్‌ను PVDF నుండి కత్తిరించి, 5 సార్లు మెథనాల్‌తో మరియు ఒకసారి లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-MS (LC-MS) గ్రేడ్ నీటితో కడిగారు. పొర స్ట్రిప్‌ను 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), బఫర్ మరియు 500μl తాజాగా కరిగించిన 1 M సోడియం నైట్రైట్ మిశ్రమంతో 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా, లిపిడ్ భాగం Gas1-GFP నుండి విడుదల చేయబడి, గ్లూకోసమైన్ మరియు ఇనోసిటాల్ మధ్య ఇనోసిన్ ఫాస్ఫేట్ సెరమైడ్ విడుదల ద్వారా లైజ్ చేయబడుతుంది (51). ఆ తర్వాత, పొర పట్టీని LC-MS గ్రేడ్ నీటితో నాలుగు సార్లు కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఆరబెట్టి, విశ్లేషణ వరకు -80°C వద్ద నత్రజని వాతావరణంలో నిల్వ చేశారు. నియంత్రణగా, ప్రతి ప్రయోగానికి PVDF పొర యొక్క ఖాళీ నమూనాను ఉపయోగించారు. Gas1-GFP నుండి సంగ్రహించిన లిపిడ్‌ను అప్పుడు వివరించిన విధంగా (50) MS ద్వారా విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, GPI-లిపిడ్‌ను కలిగి ఉన్న PVDF పట్టీలను 75μl నెగటివ్ మోల్డ్ ద్రావణి [క్లోరోఫార్మ్/మెథనాల్ (1:2) + 5 mM అమ్మోనియం అసిటేట్]లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, స్ఫింగోలిపిడ్ జాతుల ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ (ESI)-MRM/MS విశ్లేషణ (TSQ వాంటేజ్) ద్వారా పంపారు. ఈ సందర్భంలో, MS డేటాను నెగటివ్ అయాన్ మోడ్‌లో పొందారు.
ముందుగా చెప్పినట్లుగా, GPI యాంకర్ యొక్క లిపిడ్ భాగం [3H]-ఇనోసిటాల్-లేబుల్ చేయబడిన GPI-AP (16) నుండి వేరు చేయబడింది. లిపిడ్లను ద్రావణి వ్యవస్థ (55:45:10 క్లోరోఫార్మ్-మెథనాల్-0.25% KCl) ఉపయోగించి థిన్-లేయర్ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా వేరు చేసి, FLA-7000 (ఫ్యూజిఫిల్మ్) ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేశారు.
Gas1-GFPని వ్యక్తీకరించే కణాలను (600×107) TNE బఫర్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, గాజు పూసలతో విచ్ఛిన్నం చేసి, ఆపై కణ శిధిలాలు మరియు గాజు పూసలను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఆ తర్వాత సూపర్నాటెంట్‌ను 4°C వద్ద 1 గంట పాటు 17,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. పెల్లెట్‌ను TNEలో కడిగి, 0.2% డిజిటాలిస్ సాపోనిన్ కలిగిన TNEలో 1 U PI-PLC (ఇన్విట్రోజెన్)తో 37°C వద్ద 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఎంజైమ్ చికిత్స తర్వాత, 4°C వద్ద 1 గంట పాటు 17,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయడం ద్వారా మెంబ్రేన్‌ను తొలగించారు. Gas1-GFPని ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయడానికి, సూపర్నాటెంట్‌ను 4°C వద్ద రాత్రంతా GFP-Trap_A (క్రోమోటెక్)తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడిన శుద్ధి చేయబడిన Gas1-GFPకి కూమసీ బ్రిలియంట్ బ్లూతో రంగు వేశారు. అక్వెడక్ట్ చుట్టూ ఉన్న బూడిద రంగు నుండి Gas1-GFP స్టెయినింగ్ బ్యాండ్‌ను కత్తిరించారు, ఆ తర్వాత అయోడోఅసిటమైడ్‌తో ఆల్కైలేషన్ మరియు డైథియోథ్రెయిటాల్‌తో రిడక్షన్ చేశాక, ట్రిప్సిన్‌తో ఇన్-జెల్ డైజెషన్ చేశారు. ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లను మరియు GPI-గ్లైకాన్‌లతో ఉన్న పెప్టైడ్‌లను సంగ్రహించి, ఆరబెట్టారు. ఆరబెట్టిన పెప్టైడ్‌ను 20 μl నీటిలో కరిగించారు. కొంత భాగాన్ని (8μl) LC లోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. నిర్దిష్ట గ్రేడియంట్ పరిస్థితులలో పెప్టైడ్‌లను వేరు చేయడానికి ఆక్టాడెసిల్‌సిలేన్ (ODS) కాలమ్ (డెవెలోసిల్ 300ODS-HG-5; లోపలి వ్యాసం 150 mm×1.0 mm; నోమురా కెమికల్, ఐచి ప్రిఫెక్చర్, జపాన్) ఉపయోగించబడింది. మొబైల్ ఫేజ్ ద్రావణి A (0.08% ఫార్మిక్ ఆమ్లం) మరియు ద్రావణి B (80% అసిటోనైట్రిల్‌లో 0.15% ఫార్మిక్ ఆమ్లం). ఒక అక్సెలా HPLC వ్యవస్థను (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, బోస్టన్, మసాచుసెట్స్) ఉపయోగించి, 5 నిమిషాల పాటు 50 μl min-1 ప్రవాహ రేటుతో 55 నిమిషాలలోపు సాల్వెంట్ A తో కాలమ్‌ను ఎల్యూట్ చేశారు, ఆ తర్వాత సాల్వెంట్ B యొక్క గాఢతను 40% కి పెంచారు. (యునైటెడ్ స్టేట్స్). ఎల్యూయేట్‌ను నిరంతరం ESI అయాన్ సోర్స్‌లోకి ప్రవేశపెట్టారు, మరియు ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లు మరియు GPI-గ్లైకాన్‌లతో కూడిన పెప్టైడ్‌లను LTQ ఆర్బిట్రాప్ XL (హైబ్రిడ్ లీనియర్ అయాన్ ట్రాప్-ఆర్బిట్రాప్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్; థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ద్వారా విశ్లేషించారు. MS సెటప్‌లో, కేశనాళిక సోర్స్ యొక్క వోల్టేజ్‌ను 4.5 kV కి సెట్ చేశారు, మరియు ట్రాన్స్‌ఫర్ కేశనాళిక యొక్క ఉష్ణోగ్రతను 300°C వద్ద ఉంచారు. కేశనాళిక వోల్టేజ్ మరియు ట్యూబ్ లెన్స్ వోల్టేజ్‌లను వరుసగా 15 V మరియు 50 V లకు సెట్ చేశారు. MS డేటాను పాజిటివ్ అయాన్ మోడ్‌లో (రిజల్యూషన్ 60,000; ద్రవ్యరాశి కచ్చితత్వం 10 పార్ట్స్ పర్ మిలియన్) 300/m/z ద్రవ్యరాశి/ఛార్జ్ నిష్పత్తి (m/z) 3000 ద్రవ్యరాశి పరిధిలో పొందారు. MS/MS డేటాను LTQ ఆర్బిట్రాప్ XLలోని అయాన్ ట్రాప్ ద్వారా పొందారు [డేటా ఆధారపడే మొదటి 3 అంకెలు, కొలిజన్ ఇండ్యూస్డ్ డిసోసియేషన్ (CID)].
MD అనుకరణలను GROMACS (52) సాఫ్ట్‌వేర్ మరియు MARTINI 2 ఫోర్స్ ఫీల్డ్ (53-55) ఉపయోగించి నిర్వహించారు. తరువాత, డయోలియోల్ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్ (DOPC) మరియు Cer C18 లేదా DOPC మరియు Cer C26 కలిగిన ద్విపొరను నిర్మించడానికి CHARMM GUI మెంబ్రేన్ బిల్డర్ (56, 57) ను ఉపయోగించారు. స్ఫింగోసిన్ తోక నుండి అదనపు పూసలను తొలగించడం ద్వారా Cer C26 యొక్క టోపాలజీ మరియు కోఆర్డినేట్‌లు DXCE నుండి తీసుకోబడ్డాయి. ద్విపొరను సమతుల్యం చేయడానికి మరియు దానిని అమలు చేయడానికి క్రింద వివరించిన ప్రక్రియను ఉపయోగించండి, ఆపై Emp24 కలిగిన వ్యవస్థను నిర్మించడానికి వ్యవస్థ యొక్క చివరి కోఆర్డినేట్‌లను ఉపయోగించండి. ఈస్ట్ Emp24 యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ డొమైన్ (అవశేషాలు 173 నుండి 193 వరకు) విజువల్ MD (VMD) టూల్ మాలిక్యులర్ స్ట్రక్చర్ (58) ఉపయోగించి α-హెలిక్స్‌గా నిర్మించబడింది. తరువాత, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న లిపిడ్‌లను తొలగించిన తర్వాత, ప్రోటీన్‌ను స్థూలంగా కణికీకరించి, CHARMM GUI ఉపయోగించి ద్విపొరలోకి చొప్పించారు. తుది వ్యవస్థలో 1202 DOPC మరియు 302 Cer C26 లేదా 1197 DOPC మరియు 295 Cer C18 మరియు Emp24 ఉంటాయి. వ్యవస్థను 0.150M గాఢతకు అయనీకరణం చేయండి. రెండు బైలేయర్ కూర్పుల కోసం నాలుగు స్వతంత్ర ప్రతిరూపాలు తయారు చేయబడ్డాయి.
లిపిడ్ బైలేయర్‌ను CHARMM GUI ప్రాసెస్ ఉపయోగించి బ్యాలెన్స్ చేస్తారు. ఇందులో 405,000 స్టెప్పులను మినిమైజ్ చేసి, ఆపై బ్యాలెన్స్ చేయడం జరుగుతుంది. ఈ ప్రక్రియలో పొజిషన్ కన్‌స్ట్రెయింట్స్‌ను క్రమంగా తగ్గించి, తొలగిస్తారు మరియు టైమ్ స్టెప్‌ను 0.005 ps నుండి 0.02 ps కు పెంచుతారు. ఈక్విలిబ్రేషన్ తర్వాత, ఇది 0.02 ps టైమ్ స్టెప్‌తో 6 µs ఉత్పత్తి చేస్తుంది. Emp24ను ఇన్సర్ట్ చేసిన తర్వాత, సిస్టమ్‌ను మినిమైజ్ చేసి, బ్యాలెన్స్ చేయడానికి అదే CHARMM GUI ప్రాసెస్‌ను ఉపయోగించి, ఆపై ప్రొడక్షన్‌లో 8 సెకన్ల పాటు రన్ చేయండి.
అన్ని సిస్టమ్‌ల కోసం, బ్యాలెన్సింగ్ ప్రక్రియ సమయంలో, పీడనాన్ని బెరెండ్‌సెన్ బారోస్టాట్ (59) ద్వారా నియంత్రిస్తారు మరియు ఉత్పత్తి ప్రక్రియ సమయంలో, పీడనాన్ని పర్రినెల్లో-రహ్మాన్ బారోస్టాట్ (60) ద్వారా నియంత్రిస్తారు. అన్ని సందర్భాల్లో, సగటు పీడనం 1 బార్ మరియు సెమీ-ఐసోట్రోపిక్ ప్రెజర్ కప్లింగ్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగిస్తారు. బ్యాలెన్స్ మరియు ఉత్పత్తి ప్రక్రియలో, వరుసగా ప్రోటీన్, లిపిడ్ మరియు ద్రావణి కణాల ఉష్ణోగ్రతను కప్లింగ్ చేయడానికి స్పీడ్ రీకాలిబ్రేషన్‌తో కూడిన థర్మోస్టాట్ (61) ఉపయోగించబడుతుంది. మొత్తం ఆపరేషన్ సమయంలో, లక్ష్య ఉష్ణోగ్రత 310K. 0.005 బఫర్ టాలరెన్స్‌తో వెర్లెట్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగించి పెయిరింగ్ లిస్ట్‌ను రూపొందించడం ద్వారా నాన్-బాండింగ్ ఇంటరాక్షన్ లెక్కించబడుతుంది. రియాక్షన్ ఫీల్డ్ మరియు 1.1 nm కట్-ఆఫ్ దూరాన్ని ఉపయోగించి కూలంబ్ టర్మ్ లెక్కించబడుతుంది. వాండర్ వాల్స్ టర్మ్ 1.1 nm కట్-ఆఫ్ దూరంతో కట్-ఆఫ్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగిస్తుంది మరియు పొటెన్షియల్ డ్రిఫ్ట్ (62) కోసం వెర్లెట్ కట్-ఆఫ్ స్కీమ్ ఉపయోగించబడుతుంది.
VMDని ఉపయోగించి, DOPC ఫాస్ఫేట్ పూసలు లేదా సెరమైడ్ AM1 పూసలు మరియు ప్రోటీన్ మధ్య కటాఫ్ తరంగదైర్ఘ్యం 0.7 nm, మరియు ప్రోటీన్‌తో సంకర్షణ చెందే లిపిడ్‌ల సంఖ్య లెక్కించబడుతుంది. కింది సూత్రం ప్రకారం, (63)లో వలె క్షీణత-సుసంపన్నత (DE) కారకాన్ని లెక్కించండి: DE కారకం = (ప్రోటీన్‌లోని మొత్తం లిపిడ్‌ల మొత్తం 0.7) ప్రోటీన్‌లోని 0.7 (మొత్తం లిపిడ్‌లలో Cer మొత్తం)
నివేదించబడిన విలువ సగటుగా పొందబడింది మరియు ఎర్రర్ బార్‌లు SE యొక్క నాలుగు స్వతంత్ర కాపీలు. DE కారకం యొక్క గణాంక ప్రాముఖ్యత t పరీక్ష ద్వారా లెక్కించబడుతుంది [(సగటుDE-కారకం-1)/SE]. వన్-టెయిల్డ్ డిస్ట్రిబ్యూషన్ నుండి P విలువను లెక్కించండి.
ట్రేస్ యొక్క చివరి 250 ns లోపల Emp24 ఉన్న సిస్టమ్ యొక్క 2D లాటరల్ డెన్సిటీ మ్యాప్‌ను లెక్కించడానికి GROMACS టూల్ ఉపయోగించబడింది. సెరమైడ్ యొక్క ఎన్‌రిచ్‌మెంట్/డిప్లీషన్ మ్యాప్‌ను పొందడానికి, Cer యొక్క డెన్సిటీ మ్యాప్‌ను Cer మరియు DOPC మ్యాప్‌ల మొత్తంతో భాగించి, ఆపై శరీరంలోని Cer యొక్క గాఢతతో భాగించబడుతుంది. అదే కలర్ మ్యాప్ స్కేల్ ఉపయోగించబడుతుంది.
ఈ వ్యాసానికి సంబంధించిన అనుబంధ సమాచారం కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ని చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల క్రింద పంపిణీ చేయబడిన ఒక ఓపెన్ యాక్సెస్ వ్యాసం. ఈ లైసెన్స్ ప్రకారం, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు రచన సరైనదనే ప్రాతిపదిక ఉన్నంత వరకు, దీనిని ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగించడానికి, పంపిణీ చేయడానికి మరియు పునరుత్పత్తి చేయడానికి అనుమతి ఉంది. రిఫరెన్స్.
గమనిక: మీరు ఈ పేజీకి సిఫార్సు చేసే వ్యక్తికి, మీరు ఆ ఇమెయిల్‌ను వారు చూడాలని కోరుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలియజేయడం కోసమే మేము మిమ్మల్ని మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను ఇవ్వమని అడుగుతున్నాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సేకరించము.
మీరు సందర్శకులా కాదా అని పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నివారించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
సోఫియా రోడ్రిగ్జ్-గల్లార్డో, కజువో కురోకావా, సుసానా సబిడో-బోజో, అలెజాండ్రో కోర్టెజ్ · గోమెజ్ (అలెజాండ్రో కోర్టెస్-గోమెజ్), అట్సుకో ఇకెడా (అట్సుకో ఇకెడా), వలేరియా జోని (వలేరియా జోని), ఆక్సిలియాడోరా ఎస్ లూరియోజ్, అగ్యిలేరా-రియోరియా), (సెర్గియో లోపెజ్), మిహో వాగా (మిహో వాగా), మిసాకో అర్మాన్ (మిసాకో అర్మాన్), మియాకో రిమాన్ (మియాకో రిమాన్), ప్రోవ్ అకిరా, స్టెఫానో ఫన్నీ, అకిహికో నకనో, మాన్యుయెల్ మునిజ్
3D అధిక-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్, నిర్దిష్ట అవుట్‌పుట్ సైట్‌లలో ప్రోటీన్ సార్టింగ్ కోసం సెరమైడ్ గొలుసు పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను వెల్లడిస్తుంది.
సోఫియా రోడ్రిగ్జ్-గల్లార్డో, కజువో కురోకావా, సుసానా సబిడో-బోజో, అలెజాండ్రో కోర్టెజ్ · గోమెజ్ (అలెజాండ్రో కోర్టెస్-గోమెజ్), అట్సుకో ఇకెడా (అట్సుకో ఇకెడా), వలేరియా జోని (వలేరియా జోని), ఆక్సిలియాడోరా ఎస్ లూరియోజ్, అగ్యిలేరా-రియోరియా), (సెర్గియో లోపెజ్), మిహో వాగా (మిహో వాగా), మిసాకో అర్మాన్ (మిసాకో అర్మాన్), మియాకో రిమాన్ (మియాకో రిమాన్), ప్రోవ్ అకిరా, స్టెఫానో ఫన్నీ, అకిహికో నకనో, మాన్యుయెల్ మునిజ్
3D అధిక-రిజల్యూషన్ రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్, నిర్దిష్ట అవుట్‌పుట్ సైట్‌లలో ప్రోటీన్ సార్టింగ్ కోసం సెరమైడ్ గొలుసు పొడవు యొక్క ప్రాముఖ్యతను వెల్లడిస్తుంది.
©2020 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.