కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులలో గట్-డిరైవ్డ్ ట్రిప్టోఫాన్ మెటాబోలైట్ ఇండోల్-3-ప్రొపియోనిక్ యాసిడ్ (IPA) యొక్క సీరం స్థాయిలు తక్కువగా ఉన్నాయని మేము గతంలో నివేదించాము. ఈ అధ్యయనంలో, సీరం IPA స్థాయిలకు సంబంధించి ఊబకాయం ఉన్న కాలేయాలలో ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ మరియు DNA మిథైలోమ్‌ను, అలాగే ఇన్ విట్రోలో హెపాటిక్ స్టెలేట్ కణాల (HSCs) ఫినోటైపిక్ ఇనాక్టివేషన్‌ను ప్రేరేపించడంలో IPA పాత్రను మేము పరిశోధించాము.
ఈ అధ్యయనంలో టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ (T2DM) లేని (వయస్సు 46.8 ± 9.3 సంవత్సరాలు; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) 116 మంది ఊబకాయ రోగులు ఉన్నారు, వారు కుయోపియో బారియాట్రిక్ సర్జరీ సెంటర్ (KOBS)లో బారియాట్రిక్ సర్జరీ చేయించుకున్నారు. ప్రసరణ IPA స్థాయిలను లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) ద్వారా కొలుస్తారు, మొత్తం RNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది మరియు ఇన్ఫినియం హ్యూమన్మెథైలేషన్450 బీడ్చిప్ ఉపయోగించి DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాల కోసం మానవ హెపాటిక్ స్టెలేట్ కణాలు (LX-2) ఉపయోగించబడ్డాయి.
కాలేయంలో అపోప్టోటిక్, మైటోఫాజిక్ మరియు దీర్ఘాయువు మార్గాల్లో పాల్గొన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణతో సీరం IPA స్థాయిలు పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి. AKT సెరైన్/థ్రెయోనిన్ కినేస్ 1 (AKT1) జన్యువు కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ మరియు DNA మిథైలేషన్ ప్రొఫైల్‌లలో అత్యంత సమృద్ధిగా మరియు ఆధిపత్యంగా సంకర్షణ చెందే జన్యువు. IPA చికిత్స అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించింది, మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ తగ్గింది మరియు LX-2 కణాల ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్ మరియు మనుగడను నియంత్రించడానికి తెలిసిన జన్యువుల వ్యక్తీకరణను మాడ్యులేట్ చేయడం ద్వారా కణ స్వరూపం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌ను మార్చింది.
కలిసి చూస్తే, ఈ డేటా IPA సంభావ్య చికిత్సా ప్రభావాలను కలిగి ఉందని మరియు అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించగలదని మరియు HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియాత్మక స్థితి వైపు మార్చగలదని మద్దతు ఇస్తుంది, తద్వారా HSC క్రియాశీలత మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియలో జోక్యం చేసుకోవడం ద్వారా కాలేయ ఫైబ్రోసిస్‌ను నిరోధించే అవకాశాన్ని విస్తరిస్తుంది.
ఊబకాయం మరియు జీవక్రియ సిండ్రోమ్ యొక్క ప్రాబల్యం జీవక్రియ సంబంధిత కొవ్వు కాలేయ వ్యాధి (MASLD) పెరుగుదలతో ముడిపడి ఉంది; ఈ వ్యాధి సాధారణ జనాభాలో 25% నుండి 30% మందిని ప్రభావితం చేస్తుంది [1]. MASLD ఎటియాలజీ యొక్క ప్రధాన పరిణామం లివర్ ఫైబ్రోసిస్, ఇది ఫైబరస్ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) యొక్క నిరంతర సంచితం ద్వారా వర్గీకరించబడిన డైనమిక్ ప్రక్రియ [2]. లివర్ ఫైబ్రోసిస్‌లో పాల్గొన్న ప్రధాన కణాలు హెపాటిక్ స్టెలేట్ కణాలు (HSCలు), ఇవి నాలుగు తెలిసిన ఫినోటైప్‌లను ప్రదర్శిస్తాయి: క్వైసెంట్, యాక్టివేట్, ఇనాక్టివేటెడ్ మరియు సెనెసెంట్ [3, 4]. HSCలను యాక్టివేట్ చేయవచ్చు మరియు α-స్మూత్ మజిల్ ఆక్టిన్ (α-SMA) మరియు టైప్ I కొల్లాజెన్ (Col-I) [5, 6] యొక్క పెరిగిన వ్యక్తీకరణతో, అధిక శక్తి డిమాండ్‌లతో ప్రోలిఫెరేటివ్ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ లాంటి కణాలలోకి క్వైసెంట్ రూపం నుండి ట్రాన్స్‌డిఫరెన్సియేట్ చేయవచ్చు. లివర్ ఫైబ్రోసిస్ రివర్సల్ సమయంలో, యాక్టివేట్ చేయబడిన HSCలు అపోప్టోసిస్ లేదా ఇనాక్టివేషన్ ద్వారా తొలగించబడతాయి. ఈ ప్రక్రియలలో ఫైబ్రోజెనిక్ జన్యువుల నియంత్రణను తగ్గించడం మరియు ప్రోసర్వైవల్ జన్యువుల మాడ్యులేషన్ (NF-κB మరియు PI3K/Akt సిగ్నలింగ్ మార్గాలు వంటివి) [7, 8], అలాగే మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ మరియు ఫంక్షన్‌లో మార్పులు [9] ఉన్నాయి.
పేగులో ఉత్పత్తి అయ్యే ట్రిప్టోఫాన్ మెటాబోలైట్ ఇండోల్-3-ప్రొపియోనిక్ యాసిడ్ (IPA) యొక్క సీరం స్థాయిలు, MASLD [10–13]తో సహా మానవ జీవక్రియ వ్యాధులలో తగ్గుతున్నట్లు కనుగొనబడింది. IPA ఆహార ఫైబర్ తీసుకోవడంతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, దాని యాంటీఆక్సిడెంట్ మరియు యాంటీ ఇన్ఫ్లమేటరీ ప్రభావాలకు ప్రసిద్ధి చెందింది మరియు వివో మరియు ఇన్ విట్రోలో ఆహారం-ప్రేరిత నాన్-ఆల్కహాలిక్ స్టీటోహెపటైటిస్ (NASH) ఫినోటైప్‌ను తగ్గిస్తుంది [11–14]. మా మునుపటి అధ్యయనం నుండి కొన్ని ఆధారాలు వచ్చాయి, ఇది కుయోపియో బారియాట్రిక్ సర్జరీ స్టడీ (KOBS)లో లివర్ ఫైబ్రోసిస్ లేని ఊబకాయం ఉన్న రోగుల కంటే లివర్ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులలో సీరం IPA స్థాయిలు తక్కువగా ఉన్నాయని నిరూపించింది. ఇంకా, IPA చికిత్స మానవ హెపాటిక్ స్టెలేట్ సెల్ (LX-2) మోడల్‌లో సెల్ అడెషన్, సెల్ మైగ్రేషన్ మరియు హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ యాక్టివేషన్ యొక్క క్లాసికల్ మార్కర్‌లైన జన్యువుల వ్యక్తీకరణను తగ్గించగలదని మరియు ఇది సంభావ్య హెపాటోప్రొటెక్టివ్ మెటాబోలైట్ [15] అని మేము చూపించాము. అయితే, HSC అపోప్టోసిస్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను యాక్టివేట్ చేయడం ద్వారా IPA లివర్ ఫైబ్రోసిస్ రిగ్రెషన్‌ను ఎలా ప్రేరేపిస్తుందో అస్పష్టంగానే ఉంది.
ఇక్కడ, సీరం IPA అనేది ఊబకాయం ఉన్న కానీ టైప్ 2 డయాబెటిస్ (KOBS) లేని వ్యక్తుల కాలేయంలో అపోప్టోసిస్, మైటోఫాగి మరియు దీర్ఘాయువు మార్గాలలో సమృద్ధిగా ఉన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణతో సంబంధం కలిగి ఉందని మేము ప్రదర్శిస్తాము. ఇంకా, IPA నిష్క్రియాత్మక మార్గం ద్వారా యాక్టివేటెడ్ హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCs) యొక్క క్లియరెన్స్ మరియు క్షీణతను ప్రేరేపించగలదని మేము కనుగొన్నాము. ఈ ఫలితాలు IPA కోసం ఒక కొత్త పాత్రను వెల్లడిస్తాయి, ఇది కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ రిగ్రెషన్‌ను ప్రోత్సహించడానికి సంభావ్య చికిత్సా లక్ష్యంగా మారుతుంది.
KOBS కోహోర్ట్‌లో మునుపటి అధ్యయనం ప్రకారం, లివర్ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులకు లివర్ ఫైబ్రోసిస్ లేని రోగులతో పోలిస్తే తక్కువ ప్రసరణ IPA స్థాయిలు ఉన్నాయని తేలింది [15]. టైప్ 2 డయాబెటిస్ యొక్క సంభావ్య గందరగోళ ప్రభావాన్ని మినహాయించడానికి, మేము కొనసాగుతున్న KOBS అధ్యయనం నుండి టైప్ 2 డయాబెటిస్ లేని 116 మంది ఊబకాయ రోగులను (సగటు వయస్సు ± SD: 46.8 ± 9.3 సంవత్సరాలు; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (టేబుల్ 1) అధ్యయన జనాభాగా నియమించుకున్నాము [16]. పాల్గొనే వారందరూ వ్రాతపూర్వక సమాచార సమ్మతిని ఇచ్చారు మరియు హెల్సింకి డిక్లరేషన్ (54/2005, 104/2008 మరియు 27/2010) ప్రకారం నార్త్ సావో కౌంటీ హాస్పిటల్ యొక్క ఎథిక్స్ కమిటీ ద్వారా అధ్యయన ప్రోటోకాల్ ఆమోదించబడింది.
బారియాట్రిక్ సర్జరీ సమయంలో లివర్ బయాప్సీ నమూనాలను పొందారు మరియు గతంలో వివరించిన ప్రమాణాల ప్రకారం అనుభవజ్ఞులైన పాథాలజిస్టులచే హిస్టోలాజికల్‌గా అంచనా వేయబడ్డారు [17, 18]. అంచనా ప్రమాణాలు అనుబంధ పట్టిక S1లో సంగ్రహించబడ్డాయి మరియు గతంలో వివరించబడ్డాయి [19].
జీవక్రియ విశ్లేషణ (n = 116) కోసం లక్ష్యరహిత ద్రవ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) ద్వారా ఉపవాస సీరం నమూనాలను విశ్లేషించారు. గతంలో వివరించిన విధంగా నమూనాలను UHPLC-qTOF-MS వ్యవస్థ (1290 LC, 6540 qTOF-MS, ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, వాల్డ్‌బ్రాన్, కార్ల్స్రూ, జర్మనీ) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ఐసోప్రొపైల్ ఆల్కహాల్ (IPA) గుర్తింపు నిలుపుదల సమయం మరియు MS/MS స్పెక్ట్రమ్‌ను స్వచ్ఛమైన ప్రమాణాలతో పోల్చడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. అన్ని తదుపరి విశ్లేషణలలో IPA సిగ్నల్ తీవ్రత (పీక్ ఏరియా) పరిగణించబడింది [20].
ఇల్యూమినా హైసెక్ 2500 ఉపయోగించి మొత్తం లివర్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ సీక్వెన్సింగ్ నిర్వహించబడింది మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా డేటా ప్రీప్రాసెస్ చేయబడింది [19, 21, 22]. మిటోమైనర్ 4.0 డేటాబేస్ [23] నుండి ఎంపిక చేయబడిన 1957 జన్యువులను ఉపయోగించి మైటోకాన్డ్రియల్ ఫంక్షన్/బయోజెనిసిస్‌ను ప్రభావితం చేసే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల యొక్క లక్ష్య అవకలన వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణను మేము నిర్వహించాము. గతంలో వివరించిన అదే పద్ధతిని ఉపయోగించి ఇన్ఫినియం హ్యూమన్‌మెథైలేషన్ 450 బీడ్‌షిప్ (ఇల్యూమినా, శాన్ డియాగో, CA, USA) ఉపయోగించి లివర్ DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము [24, 25].
మానవ హెపాటిక్ స్టెలేట్ కణాలు (LX-2) ప్రొఫెసర్ స్టెఫానో రోమియో దయతో అందించారు మరియు DMEM/F12 మాధ్యమంలో (బయోవెస్ట్, L0093-500, 1% పెన్/స్ట్రెప్; లోన్జా, DE17-602E, 2% FBS; గిబ్కో, 10270-106) కల్చర్ చేయబడ్డాయి మరియు నిర్వహించబడ్డాయి. IPA యొక్క పని మోతాదును ఎంచుకోవడానికి, LX-2 కణాలను DMEM/F12 మాధ్యమంలో 24 గంటలకు వివిధ సాంద్రతలలో IPA (10 μM, 100 μM మరియు 1 mM; సిగ్మా, 220027) తో చికిత్స చేశారు. ఇంకా, HSC లను నిష్క్రియం చేయడానికి IPA సామర్థ్యాన్ని పరిశోధించడానికి, LX-2 కణాలను 5 ng/ml TGF-β1 (R&D వ్యవస్థలు, 240-B-002/CF) మరియు 1 mM IPA తో సీరం-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటలకు సహ-చికిత్స చేశారు. సంబంధిత వాహన నియంత్రణల కోసం, 0.1% BSA కలిగిన 4 nM HCL ను TGF-β1 చికిత్స కోసం మరియు 0.05% DMSO ను IPA చికిత్స కోసం ఉపయోగించారు మరియు రెండింటినీ కలిపి కలయిక చికిత్స కోసం ఉపయోగించారు.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం 7-AAD (బయోలెజెండ్, శాన్ డియాగో, CA, USA, Cat# 640922) తో FITC అనెక్సిన్ V అపెప్టోసిస్ డిటెక్షన్ కిట్ ఉపయోగించి అపెప్టోసిస్‌ను అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, LX-2 (1 × 105 కణాలు/బావి) ను 12-బావి ప్లేట్లలో రాత్రిపూట కల్చర్ చేసి, ఆపై బహుళ మోతాదుల IPA లేదా IPA మరియు TGF-β1 తో చికిత్స చేశారు. మరుసటి రోజు, తేలియాడే మరియు అడెరెంట్ కణాలను సేకరించి, ట్రిప్సినైజ్ చేసి, PBS తో కడిగి, అనెక్సిన్ V బైండింగ్ బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చి, FITC-అనెక్సిన్ V మరియు 7-AAD లతో 15 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు.
మిటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos (MTR) (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA) ఉపయోగించి జీవ కణాలలోని మైటోకాండ్రియాను ఆక్సీకరణ కార్యకలాపాల కోసం మరకలు చేశారు. MTR పరీక్షల కోసం, LX-2 కణాలను IPA మరియు TGF-β1 లతో సమాన సాంద్రతలతో పొదిగించారు. 24 గంటల తర్వాత, జీవ కణాలను ట్రిప్సినైజ్ చేసి, PBSతో కడిగి, ఆపై గతంలో వివరించిన విధంగా 20 నిమిషాలు 37 °C వద్ద సీరం-రహిత మాధ్యమంలో 100 μM MTRతో పొదిగించారు [26]. ప్రత్యక్ష కణ స్వరూప విశ్లేషణ కోసం, కణ పరిమాణం మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతను వరుసగా ఫార్వర్డ్ స్కాటర్ (FSC) మరియు సైడ్ స్కాటర్ (SSC) పారామితులను ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.
అన్ని డేటా (30,000 ఈవెంట్‌లు) నోవోసైట్ క్వాంటియాన్ (ఎజిలెంట్) ఉపయోగించి పొందబడ్డాయి మరియు నోవోఎక్స్‌ప్రెస్® 1.4.1 లేదా ఫ్లోజో V.10 సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించి విశ్లేషించబడ్డాయి.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం సీహార్స్ ఎక్స్‌ఎఫ్ సెల్ మిటో స్ట్రెస్‌తో కూడిన సీహార్స్ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ ఫ్లక్స్ అనలైజర్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, శాంటా క్లారా, CA) ఉపయోగించి ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు (OCR) మరియు ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ ఆమ్లీకరణ రేటు (ECAR) లను నిజ సమయంలో కొలుస్తారు. క్లుప్తంగా, 2 × 104 LX-2 కణాలు/బావిని XF96 సెల్ కల్చర్ ప్లేట్‌లపై సీడ్ చేశారు. రాత్రిపూట పొదిగిన తర్వాత, కణాలను ఐసోప్రొపనాల్ (IPA) మరియు TGF-β1 (సప్లిమెంటరీ మెథడ్స్ 1) తో చికిత్స చేశారు. సీహార్స్ ఎక్స్‌ఎఫ్ వేవ్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ జరిగింది, ఇందులో సీహార్స్ ఎక్స్‌ఎఫ్ సెల్ ఎనర్జీ ఫినోటైప్ టెస్ట్ రిపోర్ట్ జనరేటర్ ఉంటుంది. దీని నుండి, బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్ (BHI) లెక్కించబడింది [27].
మొత్తం RNA ను cDNA లోకి లిప్యంతరీకరించారు. నిర్దిష్ట పద్ధతుల కోసం, రిఫరెన్స్ [15] చూడండి. హ్యూమన్ 60S రైబోసోమల్ ఆమ్ల ప్రోటీన్ P0 (RPLP0) మరియు సైక్లోఫిలిన్ A1 (PPIA) mRNA స్థాయిలు కాన్‌స్టిట్యూటివ్ జన్యు నియంత్రణలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి. క్వాంట్‌స్టూడియో 6 ప్రో రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్, ల్యాండ్‌స్మీర్, నెదర్లాండ్స్) ను TaqMan™ ఫాస్ట్ అడ్వాన్స్‌డ్ మాస్టర్ మిక్స్ కిట్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్) లేదా సెన్సిఫాస్ట్ SYBR లో-ROX కిట్ (బయోలిన్, BIO 94050) తో ఉపయోగించారు మరియు సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణ మడతను తులనాత్మక Ct విలువ సైక్లింగ్ పారామితులు (ΔΔCt) మరియు ∆∆Ct పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించారు. ప్రైమర్‌ల వివరాలు అనుబంధ పట్టికలు S2 మరియు S3 లో అందించబడ్డాయి.
గతంలో వివరించిన విధంగా [28] DNeasy బ్లడ్ అండ్ టిష్యూ కిట్ (Qiagen) ఉపయోగించి న్యూక్లియర్ DNA (ncDNA) మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ DNA (mtDNA)లను సంగ్రహించారు. అనుబంధ పద్ధతులు 2లో వివరించిన విధంగా, ప్రతి లక్ష్య mtDNA ప్రాంతం యొక్క నిష్పత్తిని మూడు న్యూక్లియర్ DNA ప్రాంతాల (mtDNA/ncDNA) యొక్క రేఖాగణిత సగటుకు లెక్కించడం ద్వారా mtDNA యొక్క సాపేక్ష మొత్తాన్ని లెక్కించారు. mtDNA మరియు ncDNA కోసం ప్రైమర్‌ల వివరాలు అనుబంధ పట్టిక S4లో అందించబడ్డాయి.
ఇంటర్ సెల్యులార్ మరియు ఇంట్రాసెల్యులార్ మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లను దృశ్యమానం చేయడానికి లైవ్ సెల్స్‌ను మిటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos (MTR) (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA) తో స్టెయిన్ చేశారు. సంబంధిత గ్లాస్-బాటమ్డ్ కల్చర్ ప్లేట్‌లలో (ఇబిడి GmbH, మార్టిన్‌స్రీడ్, జర్మనీ) గాజు స్లైడ్‌లపై LX-2 కణాలు (1 × 104 కణాలు/బావి) కల్చర్ చేయబడ్డాయి. 24 గంటల తర్వాత, లైవ్ LX-2 కణాలను 37 °C వద్ద 20 నిమిషాలు 100 μM MTR తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా సెల్ న్యూక్లియైలను DAPI (1 μg/ml, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) తో స్టెయిన్ చేశారు [29]. 63×NA 1.3 ఆబ్జెక్టివ్‌ని ఉపయోగించి 5% CO2తో తేమతో కూడిన వాతావరణంలో 37 °C వద్ద జీస్ LSM 800 కన్ఫోకల్ మాడ్యూల్‌తో అమర్చబడిన జీస్ ఆక్సియో అబ్జర్వర్ ఇన్వర్టెడ్ మైక్రోస్కోప్ (కార్ల్ జీస్ మైక్రోఇమేజింగ్ GmbH, జెనా, జర్మనీ) ఉపయోగించి మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లను దృశ్యమానం చేశారు. ప్రతి నమూనా రకానికి మేము పది Z-సిరీస్ చిత్రాలను పొందాము. ప్రతి Z-సిరీస్ 30 విభాగాలను కలిగి ఉంటుంది, ఒక్కొక్కటి 9.86 μm మందం కలిగి ఉంటుంది. ప్రతి నమూనా కోసం, ZEN 2009 సాఫ్ట్‌వేర్ (కార్ల్ జీస్ మైక్రోఇమేజింగ్ GmbH, జెనా, జర్మనీ) ఉపయోగించి పది వేర్వేరు వీక్షణ క్షేత్రాల చిత్రాలను పొందారు మరియు అనుబంధ పద్ధతులు 3లో వివరించిన పారామితుల ప్రకారం ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్ (v1.54d) [30, 31] ఉపయోగించి మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణ విశ్లేషణను నిర్వహించారు.
కణాలను 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్‌లో 2% గ్లూటరాల్డిహైడ్‌తో స్థిరపరిచారు, తరువాత 1% ఆస్మియం టెట్రాక్సైడ్ ద్రావణంతో (సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్, MO, USA) స్థిరీకరించారు, క్రమంగా అసిటోన్‌తో (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) నిర్జలీకరణం చేశారు మరియు చివరకు ఎపాక్సీ రెసిన్‌లో పొందుపరిచారు. అల్ట్రాథిన్ విభాగాలను 1% యురేనిల్ అసిటేట్ (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) మరియు 1% లెడ్ సిట్రేట్ (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) తో తయారు చేసి మరకలు వేశారు. 80 kV యాక్సిలరేటింగ్ వోల్టేజ్ వద్ద JEM 2100F EXII ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (JEOL లిమిటెడ్, టోక్యో, జపాన్) ఉపయోగించి అల్ట్రాస్ట్రక్చరల్ చిత్రాలను పొందారు.
24 గంటలు IPA తో చికిత్స చేయబడిన LX-2 కణాల స్వరూపాన్ని 50x మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద ఫేజ్-కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా జీస్ ఇన్వర్టెడ్ లైట్ మైక్రోస్కోప్ (జీస్ ఆక్సియో వెర్ట్.A1 మరియు ఆక్సియోకామ్ MRm, జెనా, జర్మనీ) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.
క్లినికల్ డేటాను సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం లేదా మధ్యస్థం (ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధి: IQR) గా వ్యక్తీకరించారు. మూడు అధ్యయన సమూహాల మధ్య తేడాలను పోల్చడానికి వైవిధ్యం యొక్క వన్-వే విశ్లేషణ (నిరంతర వేరియబుల్స్) లేదా χ² పరీక్ష (వర్గీకరణ వేరియబుల్స్) ఉపయోగించబడ్డాయి. బహుళ పరీక్షల కోసం సరిచేయడానికి తప్పుడు సానుకూల రేటు (FDR) ఉపయోగించబడింది మరియు FDR < 0.05 ఉన్న జన్యువులను గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించారు. నామమాత్రపు p విలువలు (p < 0.05) నివేదించబడిన CpG DNA మిథైలేషన్‌ను IPA సిగ్నల్ తీవ్రతతో పరస్పరం అనుసంధానించడానికి స్పియర్‌మ్యాన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది.
వెబ్ ఆధారిత జన్యు సమితి విశ్లేషణ సాధనం (వెబ్‌గెస్టాల్ట్) ఉపయోగించి 268 ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు (నామినల్ p < 0.01), 119 మైటోకాండ్రియా-అనుబంధ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు (నామినల్ p < 0.05), మరియు ప్రసరణ సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న 3093 లివర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లలో 4350 CpG లను పాత్ వే విశ్లేషణ నిర్వహించారు. ఉచితంగా లభించే వెన్నీ DB (వెర్షన్ 2.1.0) సాధనం అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువులను కనుగొనడానికి ఉపయోగించబడింది మరియు ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను దృశ్యమానం చేయడానికి StringDB (వెర్షన్ 11.5) ఉపయోగించబడింది.
LX-2 ప్రయోగం కోసం, నమూనాలను D'Agostino-Pearson పరీక్షను ఉపయోగించి సాధారణ స్థితి కోసం పరీక్షించారు. కనీసం మూడు జీవ ప్రతిరూపాల నుండి డేటాను పొందారు మరియు Bonferroni పోస్ట్ హాక్ పరీక్షతో వన్-వే ANOVAకి లోబడి ఉంచారు. 0.05 కంటే తక్కువ p-విలువ గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించబడింది. డేటా సగటు ± SDగా ప్రదర్శించబడింది మరియు ప్రతి చిత్రంలో ప్రయోగాల సంఖ్య సూచించబడింది. అన్ని విశ్లేషణలు మరియు గ్రాఫ్‌లు Windows కోసం GraphPad Prism 8 గణాంక సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి (GraphPad Software Inc., వెర్షన్ 8.4.3, శాన్ డియాగో, USA).
మొదట, మేము సీరం IPA స్థాయిలు మరియు కాలేయం, మొత్తం శరీరం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల మధ్య సంబంధాన్ని పరిశోధించాము. మొత్తం ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ ప్రొఫైల్‌లో, సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న బలమైన జన్యువు MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; మైటోజెన్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినేస్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినేస్ 3); మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ ప్రొఫైల్‌లో, బలమైన అనుబంధ జన్యువు AKT1 (FDR = 0.7621; AKT సెరైన్/థ్రెయోనిన్ కినేస్ 1) (అదనపు ఫైల్ 1 మరియు అదనపు ఫైల్ 2).
తరువాత మేము గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ (n = 268; p < 0.01) మరియు మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ (n = 119; p < 0.05) విశ్లేషించాము, చివరికి అపోప్టోసిస్‌ను అత్యంత ముఖ్యమైన కానానికల్ మార్గంగా గుర్తించాము (p = 0.0089). సీరం IPA స్థాయిలతో అనుబంధించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ కోసం, మేము అపోప్టోసిస్ (FDR = 0.00001), మైటోఫాగి (FDR = 0.00029), మరియు TNF సిగ్నలింగ్ పాత్‌వేస్ (FDR = 0.000006) పై దృష్టి పెట్టాము (మూర్తి 1A, పట్టిక 2, మరియు అనుబంధ గణాంకాలు 1A-B).
సీరం IPA స్థాయిలతో అనుబంధంగా మానవ కాలేయంలో గ్లోబల్, మైటోకాండ్రియా-అనుబంధ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేషన్ యొక్క అతివ్యాప్తి విశ్లేషణ. A అనేది సీరం IPA స్థాయిలతో అనుబంధించబడిన 3092 CpG సైట్‌లకు మ్యాప్ చేయబడిన 268 గ్లోబల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు, 119 మైటోకాండ్రియా-అనుబంధ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేటెడ్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లను సూచిస్తుంది (గ్లోబల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేటెడ్ కోసం p విలువలు <0.01, మరియు మైటోకాండ్రియల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లకు p విలువలు <0.05). ప్రధాన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మధ్యలో చూపబడ్డాయి (AKT1 మరియు YKT6). B ఇతర జన్యువులతో అత్యధిక ఇంటరాక్షన్ స్కోర్ (0.900) ఉన్న 13 జన్యువుల ఇంటరాక్షన్ మ్యాప్‌ను ఆన్‌లైన్ సాధనం StringDB ఉపయోగించి సీరం IPA స్థాయిలతో గణనీయంగా అనుబంధించబడిన 56 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువుల (బ్లాక్ లైన్ ప్రాంతం) నుండి నిర్మించారు. ఆకుపచ్చ: జీన్ ఒంటాలజీ (GO) సెల్యులార్ కాంపోనెంట్‌కు మ్యాప్ చేయబడిన జన్యువులు: మైటోకాండ్రియా (GO:0005739). డేటా ఆధారంగా (టెక్స్ట్ మైనింగ్, ప్రయోగాలు, డేటాబేస్‌లు మరియు సహ-వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా) ఇతర ప్రోటీన్‌లతో పరస్పర చర్యలకు AKT1 అత్యధిక స్కోరు (0.900) కలిగిన ప్రోటీన్. నెట్‌వర్క్ నోడ్‌లు ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి మరియు అంచులు ప్రోటీన్‌ల మధ్య కనెక్షన్‌లను సూచిస్తాయి.
గట్ మైక్రోబయోటా మెటాబోలైట్లు DNA మిథైలేషన్ ద్వారా ఎపిజెనెటిక్ కూర్పును నియంత్రించగలవు కాబట్టి [32], సీరం IPA స్థాయిలు కాలేయ DNA మిథైలేషన్‌తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయా అని మేము పరిశోధించాము. సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న రెండు ప్రధాన మిథైలేషన్ సైట్‌లు ప్రోలిన్-సెరైన్-రిచ్ రీజియన్ 3 (C19orf55) మరియు హీట్ షాక్ ప్రోటీన్ ఫ్యామిలీ B (చిన్న) సభ్యుడు 6 (HSPB6) (అదనపు ఫైల్ 3) సమీపంలో ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము. 4350 CpG (p < 0.01) యొక్క DNA మిథైలేషన్ సీరం IPA స్థాయిలతో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉంది మరియు దీర్ఘాయువు నియంత్రణ మార్గాలలో సమృద్ధిగా ఉంది (p = 0.006) (మూర్తి 1A, పట్టిక 2, మరియు అనుబంధ చిత్రం 1C).
మానవ కాలేయంలో సీరం IPA స్థాయిలు, గ్లోబల్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు, మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేషన్ మధ్య అనుబంధాలకు అంతర్లీనంగా ఉన్న జీవసంబంధమైన విధానాలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము మునుపటి పాత్వే విశ్లేషణలో గుర్తించిన జన్యువుల ఓవర్‌లాప్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము (మూర్తి 1A). 56 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువుల (మూర్తి 1Aలోని నల్ల రేఖ లోపల) పాత్వే సుసంపన్న విశ్లేషణ ఫలితాలు అపోప్టోసిస్ పాత్వే (p = 0.00029) మూడు విశ్లేషణలకు సాధారణమైన రెండు జన్యువులను హైలైట్ చేశాయని చూపించాయి: AKT1 మరియు YKT6 (YKT6 v-SNARE హోమోలాగ్), వెన్ రేఖాచిత్రంలో చూపిన విధంగా (అనుబంధ చిత్రం 2 మరియు చిత్రం 1A). ఆసక్తికరంగా, AKT1 (cg19831386) మరియు YKT6 (cg24161647) సీరం IPA స్థాయిలతో సానుకూలంగా సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (అదనపు ఫైల్ 3). జన్యు ఉత్పత్తుల మధ్య సంభావ్య ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను గుర్తించడానికి, మేము 56 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువులలో అత్యధిక సాధారణ ప్రాంత స్కోరు (0.900) కలిగిన 13 జన్యువులను ఇన్‌పుట్‌గా ఎంచుకున్నాము మరియు పరస్పర చర్య మ్యాప్‌ను నిర్మించాము. విశ్వాస స్థాయి (ఉపాంత విశ్వాసం) ప్రకారం, అత్యధిక స్కోరు (0.900) కలిగిన AKT1 జన్యువు అగ్రస్థానంలో ఉంది (మూర్తి 1B).
పాత్వే విశ్లేషణ ఆధారంగా, అపోప్టోసిస్ ప్రధాన మార్గం అని మేము కనుగొన్నాము, కాబట్టి IPA చికిత్స ఇన్ విట్రోలో HSCల అపోప్టోసిస్‌ను ప్రభావితం చేస్తుందా అని మేము పరిశోధించాము. IPA యొక్క వివిధ మోతాదులు (10 μM, 100 μM, మరియు 1 mM) LX-2 కణాలకు విషపూరితం కాదని మేము గతంలో నిరూపించాము [15]. ఈ అధ్యయనం 10 μM మరియు 100 μM వద్ద IPA చికిత్స ఆచరణీయ మరియు నెక్రోటిక్ కణాల సంఖ్యను పెంచిందని చూపించింది. అయితే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, సెల్ ఎబిబిలిటీ 1 mM IPA సాంద్రత వద్ద తగ్గింది, అయితే సెల్ నెక్రోసిస్ రేటు మారలేదు (మూర్తి 2A, B). తరువాత, LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి సరైన సాంద్రతను కనుగొనడానికి, మేము 24 గంటలకు 10 μM, 100 μM మరియు 1 mM IPA లను పరీక్షించాము (మూర్తి 2A-E మరియు అనుబంధ చిత్రం 3A-B). ఆసక్తికరంగా, IPA 10 μM మరియు 100 μM అపోప్టోసిస్ రేటును (%) తగ్గించాయి, అయితే, IPA 1 mM నియంత్రణతో పోలిస్తే ఆలస్య అపోప్టోసిస్ మరియు అపోప్టోసిస్ రేటును (%) పెంచింది మరియు అందువల్ల తదుపరి ప్రయోగాలకు ఎంపిక చేయబడింది (గణాంకాలు 2A–D).
IPA LX-2 కణాల అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది. ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా అపోప్టోటిక్ రేటు మరియు కణ స్వరూపాన్ని లెక్కించడానికి అనెక్సిన్ V మరియు 7-AAD డబుల్ స్టెయినింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. BA కణాలను 24 గంటలకు 10 μM, 100 μM మరియు 1 mM IPAతో లేదా సీరం-రహిత మాధ్యమంలో F–H TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPAతో 24 గంటలకు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. A: జీవ కణాలు (అనెక్సిన్ V -/ 7AAD-); B: నెక్రోటిక్ కణాలు (అనెక్సిన్ V -/ 7AAD+); C, F: ప్రారంభ (అనెక్సిన్ V +/ 7AAD-); D, G: ఆలస్యం (అనెక్సిన్ V+/7AAD.+); E, H: అపోప్టోటిక్ రేటులో మొత్తం ప్రారంభ మరియు చివరి అపోప్టోటిక్ కణాల శాతం (%). డేటా సగటు ± SD, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా వ్యక్తీకరించబడింది. బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షతో వన్-వే ANOVAను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు నిర్వహించబడ్డాయి. *p < 0.05; ****p < 0.0001
మనం ఇంతకు ముందు చూపినట్లుగా, 5 ng/ml TGF-β1 క్లాసికల్ మార్కర్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను పెంచడం ద్వారా HSC క్రియాశీలతను ప్రేరేపించగలదు [15]. LX-2 కణాలను 5 ng/ml TGF-β1 మరియు 1 mM IPA కలిపి చికిత్స చేశారు (Fig. 2E–H). TGF-β1 చికిత్స అపోప్టోసిస్ రేటును మార్చలేదు, అయితే, TGF-β1 చికిత్సతో పోలిస్తే IPA సహ-చికిత్స ఆలస్య అపోప్టోసిస్ మరియు అపోప్టోసిస్ రేటు (%)ను పెంచింది (Fig. 2E–H). ఈ ఫలితాలు 1 mM IPA TGF-β1 ప్రేరణ నుండి స్వతంత్రంగా LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహించగలదని సూచిస్తున్నాయి.
LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియపై IPA ప్రభావాన్ని మేము మరింత పరిశోధించాము. 1 mM IPA ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు (OCR) పారామితులను తగ్గించిందని ఫలితాలు చూపించాయి: నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే నాన్-మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ, బేసల్ మరియు గరిష్ట శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్ మరియు ATP ఉత్పత్తి (మూర్తి 3A, B), బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్ (BHI) మారలేదు.
LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియను IPA తగ్గిస్తుంది. మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ వక్రరేఖ (OCR) మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ పారామితులుగా (నాన్-మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ, బేసల్ శ్వాసక్రియ, గరిష్ట శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్, ATP ఉత్పత్తి, SRC మరియు BHI) ప్రదర్శించబడుతుంది. A మరియు B కణాలు వరుసగా 24 గంటలకు 10 μM, 100 μM మరియు 1 mM IPA తో పొదిగేవి. C మరియు D కణాలు వరుసగా 24 గంటలకు సీరం-రహిత మాధ్యమంలో TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో పొదిగేవి. సైక్వాంట్ కిట్ ఉపయోగించి అన్ని కొలతలు DNA కంటెంట్‌కు సాధారణీకరించబడ్డాయి. BHI: బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్; SRC: శ్వాసకోశ నిల్వ సామర్థ్యం; OCR: ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు. డేటాను సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (SD), n = 5 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించారు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు నిర్వహించబడ్డాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; మరియు ***p < 0.001
TGF-β1- ఉత్తేజిత LX-2 కణాల బయోఎనర్జెటిక్ ప్రొఫైల్‌పై IPA ప్రభావం గురించి మరింత సమగ్రమైన అవగాహన పొందడానికి, మేము OCR ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ ఆక్సీకరణ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను విశ్లేషించాము (Fig. 3C,D). నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే TGF-β1 చికిత్స గరిష్ట శ్వాసక్రియ, శ్వాసకోశ నిల్వ సామర్థ్యం (SRC) మరియు BHIని తగ్గించగలదని ఫలితాలు చూపించాయి (Fig. 3C,D). అదనంగా, కలయిక చికిత్స బేసల్ శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్ మరియు ATP ఉత్పత్తిని తగ్గించింది, కానీ SRC మరియు BHI TGF-β1 (Fig. 3C,D) తో చికిత్స చేయబడిన వాటి కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉన్నాయి.
మేము సీహార్స్ సాఫ్ట్‌వేర్ అందించిన “సెల్యులార్ ఎనర్జీ ఫినోటైప్ టెస్ట్” కూడా నిర్వహించాము (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4A–D). సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3Bలో చూపినట్లుగా, TGF-β1 చికిత్స తర్వాత OCR మరియు ECAR జీవక్రియ సంభావ్యతలు తగ్గాయి, అయితే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే కలయిక మరియు IPA చికిత్స సమూహాలలో ఎటువంటి తేడా కనిపించలేదు. ఇంకా, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే కలయిక మరియు IPA చికిత్స తర్వాత OCR యొక్క బేసల్ మరియు ఒత్తిడి స్థాయిలు రెండూ తగ్గాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4C). ఆసక్తికరంగా, కాంబినేషన్ థెరపీతో ఇలాంటి నమూనా గమనించబడింది, ఇక్కడ TGF-β1 చికిత్సతో పోలిస్తే ECAR యొక్క బేసల్ మరియు ఒత్తిడి స్థాయిలలో ఎటువంటి మార్పు కనిపించలేదు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4C). HSCలలో, మైటోకాన్డ్రియల్ ఆక్సీకరణ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌లో తగ్గింపు మరియు TGF-β1 చికిత్సకు గురైన తర్వాత SCR మరియు BHIని పునరుద్ధరించే కలయిక చికిత్స సామర్థ్యం జీవక్రియ సామర్థ్యాన్ని (OCR మరియు ECAR) మార్చలేదు. కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు IPA HSCలలో బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను తగ్గించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, IPA తక్కువ శక్తివంతమైన ప్రొఫైల్‌ను ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తుంది, ఇది HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియం వైపు మారుస్తుంది (అనుబంధ మూర్తి 4D).
మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌పై IPA ప్రభావాన్ని మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణం మరియు నెట్‌వర్క్ కనెక్షన్‌ల త్రిమితీయ పరిమాణీకరణ మరియు MTR స్టెయినింగ్ ఉపయోగించి పరిశోధించారు (మూర్తి 4 మరియు అనుబంధ చిత్రం 5). నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1 చికిత్స సగటు ఉపరితల వైశాల్యం, శాఖ సంఖ్య, మొత్తం శాఖ పొడవు మరియు శాఖ జంక్షన్ సంఖ్య (మూర్తి 4A మరియు B) ను తగ్గించిందని మరియు మైటోకాండ్రియా నిష్పత్తిని గోళాకారం నుండి ఇంటర్మీడియట్ పదనిర్మాణానికి మార్చిందని చిత్రం 4 చూపిస్తుంది (మూర్తి 4C). IPA చికిత్స మాత్రమే సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ వాల్యూమ్‌ను తగ్గించింది మరియు నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే మైటోకాండ్రియా నిష్పత్తిని గోళాకారం నుండి ఇంటర్మీడియట్ పదనిర్మాణానికి మార్చింది (మూర్తి 4A). దీనికి విరుద్ధంగా, మైటోకాన్డ్రియల్ పొర సంభావ్య-ఆధారిత MTR (మూర్తి 4A మరియు E) ద్వారా అంచనా వేయబడిన గోళాకారం, సగటు శాఖ పొడవు మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యకలాపాలు మారలేదు మరియు ఈ పారామితులు సమూహాల మధ్య తేడా లేదు. కలిసి తీసుకుంటే, ఈ ఫలితాలు TGF-β1 మరియు IPA చికిత్స మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకారం మరియు పరిమాణాన్ని అలాగే జీవన LX-2 కణాలలో నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతను మాడ్యులేట్ చేస్తున్నట్లు కనిపిస్తున్నాయని సూచిస్తున్నాయి.
LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ DNA సమృద్ధిని IPA మారుస్తుంది. A. సీరం-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటలకు TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో పొదిగిన ప్రత్యక్ష LX-2 కణాల ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ చిత్రాలు Mitotracker™ Red CMXRos తో తడిసిన మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లను మరియు DAPI తో నీలం రంగులో ఉన్న న్యూక్లియైలను చూపుతాయి. అన్ని డేటా సమూహానికి కనీసం 15 చిత్రాలను కలిగి ఉంది. ప్రతి నమూనా రకానికి మేము 10 Z-స్టాక్ చిత్రాలను పొందాము. ప్రతి Z-అక్షం శ్రేణిలో 9.86 μm మందం కలిగిన 30 ముక్కలు ఉన్నాయి. స్కేల్ బార్: 10 μm. B. చిత్రానికి అనుకూల థ్రెషోల్డింగ్‌ను వర్తింపజేయడం ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రతినిధి వస్తువులు (మైటోకాండ్రియా మాత్రమే). ప్రతి సమూహంలోని అన్ని కణాలకు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణ నెట్‌వర్క్ కనెక్షన్‌ల పోలిక నిర్వహించబడ్డాయి. C. మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకార నిష్పత్తుల ఫ్రీక్వెన్సీ. 0కి దగ్గరగా ఉన్న విలువలు గోళాకార ఆకారాలను సూచిస్తాయి మరియు 1కి దగ్గరగా ఉన్న విలువలు ఫిలమెంటస్ ఆకారాలను సూచిస్తాయి. D మైటోకాన్డ్రియల్ DNA (mtDNA) కంటెంట్‌ను మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా నిర్ణయించారు. E Mitotracker™ Red CMXRos విశ్లేషణను మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా ఫ్లో సైటోమెట్రీ (30,000 ఈవెంట్‌లు) ద్వారా నిర్వహించారు. డేటా సగటు ± SD, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించబడింది. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు నిర్వహించబడ్డాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
తరువాత మేము LX-2 కణాలలో mtDNA కంటెంట్‌ను మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్యకు సూచికగా విశ్లేషించాము. నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంలో mtDNA కంటెంట్ పెరిగింది (మూర్తి 4D). TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంతో పోలిస్తే, కాంబినేషన్ ట్రీట్‌మెంట్ గ్రూప్‌లో mtDNA కంటెంట్ తగ్గింది (మూర్తి 4D), IPA mtDNA కంటెంట్‌ను మరియు బహుశా మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్యను అలాగే మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియను తగ్గించవచ్చని సూచిస్తుంది (మూర్తి 3C). అంతేకాకుండా, IPA కాంబినేషన్ ట్రీట్‌మెంట్‌లో mtDNA కంటెంట్‌ను తగ్గించినట్లు అనిపించింది కానీ MTR-మధ్యవర్తిత్వ మైటోకాన్డ్రియల్ యాక్టివిటీని ప్రభావితం చేయలేదు (మూర్తి 4A–C).
LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్, మనుగడ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌తో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల mRNA స్థాయిలతో IPA యొక్క సంబంధాన్ని మేము పరిశోధించాము (మూర్తి 5A–D). నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహం కొల్లాజెన్ రకం I α2 గొలుసు (COL1A2), α-స్మూత్ కండరాల ఆక్టిన్ (αSMA), మ్యాట్రిక్స్ మెటాలోప్రొటీనేస్ 2 (MMP2), మెటాలోప్రొటీనేస్ 1 యొక్క కణజాల నిరోధకం (TIMP1), మరియు డైనమిన్ 1-వంటి జన్యువు (DRP1) వంటి జన్యువుల వ్యక్తీకరణను పెంచింది, ఇది పెరిగిన ఫైబ్రోసిస్ మరియు క్రియాశీలతను సూచిస్తుంది. ఇంకా, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1 చికిత్స న్యూక్లియర్ ప్రెగ్నేన్ X రిసెప్టర్ (PXR), కాస్పేస్ 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-సెల్ α యొక్క నిరోధకం, న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ κ జీన్ లైట్ పెప్టైడ్ (NFκB1A) యొక్క ఎన్‌హాన్సర్ మరియు న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ κB కినేస్ సబ్యూనిట్ β (IKBKB) యొక్క నిరోధకం యొక్క mRNA స్థాయిలను తగ్గించింది (మూర్తి 5A–D). TGF-β1 చికిత్సతో పోలిస్తే, TGF-β1 మరియు IPAతో కలిపి చికిత్స చేయడం వలన COL1A2 మరియు MMP2 యొక్క వ్యక్తీకరణ తగ్గింది, కానీ PXR, TIMP1, B-సెల్ లింఫోమా-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, మరియు IKBKB యొక్క mRNA స్థాయిలు పెరిగాయి. IPA చికిత్స MMP2, Bcl-2-అనుబంధ ప్రోటీన్ X (BAX), AKT1, ఆప్టిక్ అట్రోఫీ ప్రోటీన్ 1 (OPA1), మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ 2 (MFN2) యొక్క వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా తగ్గించింది, అయితే CASP8, NFκB1A, NFκB1B, మరియు IKBKB యొక్క వ్యక్తీకరణ నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే పెరిగింది. అయితే, కాస్పేస్-3 (CASP3), అపోప్టోటిక్ పెప్టిడేస్ యాక్టివేటింగ్ ఫ్యాక్టర్ 1 (APAF1), మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ 1 (MFN1) మరియు ఫిషన్ ప్రోటీన్ 1 (FIS1) యొక్క వ్యక్తీకరణలో ఎటువంటి తేడా కనిపించలేదు. సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు IPA చికిత్స ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్, మనుగడ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌తో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణను మాడ్యులేట్ చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. మా డేటా ప్రకారం IPA చికిత్స LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోసిస్‌ను తగ్గిస్తుంది; అదే సమయంలో, ఇది ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియం వైపు మార్చడం ద్వారా మనుగడను ప్రేరేపిస్తుంది.
LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోబ్లాస్ట్, అపోప్టోటిక్, వయబిలిటీ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను IPA మాడ్యులేట్ చేస్తుంది. సీరం-రహిత మాధ్యమంలో TGF-β1 మరియు IPAతో LX-2 కణాలు 24 గంటల పాటు ప్రేరేపించబడిన తర్వాత హిస్టోగ్రామ్‌లు ఎండోజెనస్ నియంత్రణ (RPLP0 లేదా PPIA)కి సంబంధించి mRNA వ్యక్తీకరణను ప్రదర్శిస్తాయి. A ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లను సూచిస్తుంది, B అపోప్టోటిక్ కణాలను సూచిస్తుంది, C మనుగడలో ఉన్న కణాలను సూచిస్తుంది మరియు D మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ జన్యు వ్యక్తీకరణను సూచిస్తుంది. డేటాను సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (SD), n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించారు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు నిర్వహించబడ్డాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
తరువాత, సెల్ పరిమాణం (FSC-H) మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత (SSC-H) లో మార్పులను ఫ్లో సైటోమెట్రీ (Figure 6A,B) ద్వారా అంచనా వేశారు, మరియు IPA చికిత్స తర్వాత సెల్ స్వరూపంలో మార్పులను ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) మరియు ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 6A-B) ద్వారా అంచనా వేశారు. ఊహించినట్లుగా, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంలోని కణాలు నియంత్రణ సమూహం (Figure 6A,B) తో పోలిస్తే పరిమాణంలో పెరిగాయి, ఇది కఠినమైన ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం (ER*) మరియు ఫాగోలిసోజోమ్‌ల (P) యొక్క క్లాసిక్ విస్తరణను చూపిస్తుంది, ఇది హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) క్రియాశీలతను సూచిస్తుంది (అనుబంధ ఫిగర్ 6A). అయితే, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1 మరియు IPA కలయిక చికిత్స సమూహంలో సెల్ పరిమాణం, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత (Fig. 6A,B), మరియు ER* కంటెంట్ తగ్గాయి (అనుబంధ ఫిగర్ 6A). ఇంకా, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే IPA చికిత్స కణ పరిమాణం, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత (Figs. 6A,B), P మరియు ER* కంటెంట్ (సప్లిమెంటరీ Fig. 6A) ను తగ్గించింది. అదనంగా, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే 24 గంటల IPA చికిత్స తర్వాత అపోప్టోటిక్ కణాల కంటెంట్ పెరిగింది (తెల్ల బాణాలు, అనుబంధ Fig. 6B). సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు 1 mM IPA HSC అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించగలదని మరియు TGF-β1 ద్వారా ప్రేరేపించబడిన కణ పదనిర్మాణ పారామితులలోని మార్పులను తిప్పికొట్టగలదని, తద్వారా HSC నిష్క్రియంతో సంబంధం కలిగి ఉన్న కణ పరిమాణం మరియు సంక్లిష్టతను నియంత్రిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
LX-2 కణాలలో IPA కణ పరిమాణం మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతను మారుస్తుంది. ప్రవాహ సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ యొక్క ప్రాతినిధ్య చిత్రాలు. విశ్లేషణ LX-2 కణాల కోసం ప్రత్యేకమైన గేటింగ్ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించింది: కణ జనాభాను నిర్వచించడానికి SSC-A/FSC-A, డబుల్‌లను గుర్తించడానికి FSC-H/FSC-A మరియు కణ పరిమాణం మరియు సంక్లిష్టత విశ్లేషణ కోసం SSC-H/FSC-H. కణాలను సీరం-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటలు TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో పొదిగించారు. LX-2 కణాలు కణ పరిమాణం మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత విశ్లేషణ కోసం దిగువ ఎడమ క్వాడ్రంట్ (SSC-H-/FSC-H-), ఎగువ ఎడమ క్వాడ్రంట్ (SSC-H+/FSC-H-), దిగువ కుడి క్వాడ్రంట్ (SSC-H-/FSC-H+) మరియు ఎగువ కుడి క్వాడ్రంట్ (SSC-H+/FSC-H+) గా పంపిణీ చేయబడ్డాయి. బి. సెల్ స్వరూపాన్ని FSC-H (ముందుకు స్కాటర్, సెల్ పరిమాణం) మరియు SSC-H (వైపు స్కాటర్, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత) (30,000 ఈవెంట్‌లు) ఉపయోగించి ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు. డేటాను సగటు ± SD, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించారు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు జరిగాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 మరియు ****p < 0.0001
IPA వంటి గట్ మెటాబోలైట్లు పరిశోధన యొక్క హాట్ టాపిక్‌గా మారాయి, గట్ మైక్రోబయోటాలో కొత్త లక్ష్యాలను కనుగొనవచ్చని సూచిస్తున్నాయి. అందువల్ల మానవులలో లివర్ ఫైబ్రోసిస్‌తో మనం లింక్ చేసిన మెటాబోలైట్ అయిన IPA [15], జంతు నమూనాలలో సంభావ్య యాంటీ-ఫైబ్రోటిక్ సమ్మేళనం అని చూపబడింది [13, 14]. ఇక్కడ, టైప్ 2 డయాబెటిస్ (T2D) లేని ఊబకాయం ఉన్న వ్యక్తులలో సీరం IPA మరియు గ్లోబల్ లివర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ మరియు DNA మిథైలేషన్ మధ్య అనుబంధాన్ని మేము మొదటిసారిగా ప్రదర్శిస్తాము, అపోప్టోసిస్, మైటోఫాగి మరియు దీర్ఘాయువు, అలాగే లివర్ హోమియోస్టాసిస్‌ను నియంత్రించే సంభావ్య అభ్యర్థి జన్యువు AKT1ని హైలైట్ చేస్తాము. మా అధ్యయనం యొక్క మరొక కొత్తదనం ఏమిటంటే, LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్, సెల్ మార్ఫాలజీ, మైటోకాన్డ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్ మరియు డైనమిక్స్‌తో IPA చికిత్స యొక్క పరస్పర చర్యను మేము ప్రదర్శించాము, ఇది HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియం వైపు మార్చే తక్కువ శక్తి స్పెక్ట్రమ్‌ను సూచిస్తుంది, ఇది IPAని లివర్ ఫైబ్రోసిస్‌ను మెరుగుపరచడానికి సంభావ్య అభ్యర్థిగా చేస్తుంది.
రక్త ప్రసరణ సీరం IPA తో సంబంధం ఉన్న కాలేయ జన్యువులలో అపోప్టోసిస్, మైటోఫాగి మరియు దీర్ఘాయువు అత్యంత ముఖ్యమైన కానానికల్ మార్గాలు అని మేము కనుగొన్నాము. మైటోకాన్డ్రియల్ నాణ్యత నియంత్రణ (MQC) వ్యవస్థ యొక్క అంతరాయం మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం, మైటోఫాగి మరియు అపోప్టోసిస్‌కు దారితీస్తుంది, తద్వారా MASLD సంభవించడాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది [33, 34]. అందువల్ల, కాలేయంలో అపోప్టోసిస్, మైటోఫాగి మరియు దీర్ఘాయువు ద్వారా సెల్ డైనమిక్స్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ సమగ్రతను నిర్వహించడంలో IPA పాల్గొనవచ్చని మేము ఊహించవచ్చు. YKT6 మరియు AKT1 అనే మూడు పరీక్షలలో రెండు జన్యువులు సాధారణం అని మా డేటా చూపించింది. YKT6 అనేది కణ త్వచం కలయిక ప్రక్రియలో పాల్గొన్న SNARE ప్రోటీన్ అని గమనించడం విలువ. ఇది ఆటోఫాగోజోమ్‌పై STX17 మరియు SNAP29 లతో ఇనిషియేషన్ కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరచడం ద్వారా ఆటోఫాగి మరియు మైటోఫాగిలో పాత్ర పోషిస్తుంది, తద్వారా ఆటోఫాగోజోమ్‌లు మరియు లైసోజోమ్‌ల కలయికను ప్రోత్సహిస్తుంది [35]. ఇంకా, YKT6 ఫంక్షన్ కోల్పోవడం వల్ల బలహీనమైన మైటోఫాగి[36] వస్తుంది, అయితే YKT6 యొక్క నియంత్రణ హెపాటోసెల్యులర్ కార్సినోమా (HCC) పురోగతితో ముడిపడి ఉంటుంది, ఇది పెరిగిన కణాల మనుగడను చూపుతుంది[37]. మరోవైపు, AKT1 అత్యంత ముఖ్యమైన సంకర్షణ జన్యువు మరియు PI3K/AKT సిగ్నలింగ్ మార్గం, కణ చక్రం, కణ వలస, విస్తరణ, ఫోకల్ సంశ్లేషణ, మైటోకాన్డ్రియల్ ఫంక్షన్ మరియు కొల్లాజెన్ స్రావం[38–40] వంటి కాలేయ వ్యాధులలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది. సక్రియం చేయబడిన PI3K/AKT సిగ్నలింగ్ మార్గం హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCs)ని సక్రియం చేయగలదు, ఇవి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మాతృక (ECM) ఉత్పత్తికి బాధ్యత వహించే కణాలు మరియు దాని డైస్రెగ్యులేషన్ కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ సంభవించడానికి మరియు పురోగతికి దోహదం చేస్తుంది[40]. అదనంగా, p53-ఆధారిత సెల్ అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధించే కీలకమైన సెల్ మనుగడ కారకాలలో AKT ఒకటి, మరియు AKT క్రియాశీలత కాలేయ కణ అపోప్టోసిస్ నిరోధంతో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు[41, 42]. పొందిన ఫలితాలు IPA కాలేయ మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత అపోప్టోసిస్‌లో పాల్గొనవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, ఇది అపోప్టోసిస్‌లోకి ప్రవేశించడం లేదా మనుగడ మధ్య హెపటోసైట్‌ల నిర్ణయాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది. ఈ ప్రభావాలను AKT మరియు/లేదా YKT6 అభ్యర్థి జన్యువులు నియంత్రించవచ్చు, ఇవి కాలేయ హోమియోస్టాసిస్‌కు కీలకం.
మా ఫలితాలు 1 mM IPA అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించిందని మరియు TGF-β1 చికిత్సతో సంబంధం లేకుండా LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియను తగ్గించిందని చూపించాయి. ఫైబ్రోసిస్ రిజల్యూషన్ మరియు హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) యాక్టివేషన్‌కు అపోప్టోసిస్ ఒక ప్రధాన మార్గం, మరియు లివర్ ఫైబ్రోసిస్ యొక్క రివర్సిబుల్ ఫిజియోలాజికల్ రెస్పాన్స్‌లో కూడా ఇది ఒక కీలకమైన సంఘటన అని గమనించదగినది [4, 43]. అంతేకాకుండా, కాంబినేషన్ చికిత్స తర్వాత LX-2 కణాలలో BHI పునరుద్ధరణ మైటోకాన్డ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్ నియంత్రణలో IPA యొక్క సంభావ్య పాత్రపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందించింది. విశ్రాంతి మరియు నిష్క్రియాత్మక పరిస్థితులలో, హెమటోపోయిటిక్ కణాలు సాధారణంగా ATPని ఉత్పత్తి చేయడానికి మరియు తక్కువ జీవక్రియ కార్యకలాపాలను కలిగి ఉండటానికి మైటోకాన్డ్రియల్ ఆక్సీకరణ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను ఉపయోగిస్తాయి. మరోవైపు, గ్లైకోలైటిక్ స్థితిలోకి ప్రవేశించడానికి శక్తి డిమాండ్లను భర్తీ చేయడానికి HSC యాక్టివేషన్ మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ మరియు బయోసింథసిస్‌ను పెంచుతుంది [44]. IPA జీవక్రియ సామర్థ్యాన్ని మరియు ECARను ప్రభావితం చేయలేదనే వాస్తవం గ్లైకోలైటిక్ మార్గం తక్కువ ప్రాధాన్యతనిస్తుందని సూచిస్తుంది. అదేవిధంగా, మరొక అధ్యయనం ప్రకారం 1 mM IPA కార్డియోమయోసైట్లు, మానవ హెపటోసైట్ సెల్ లైన్ (Huh7) మరియు మానవ బొడ్డు సిర ఎండోథెలియల్ కణాలు (HUVEC) లలో మైటోకాన్డ్రియల్ రెస్పిరేటరీ చైన్ యాక్టివిటీని మాడ్యులేట్ చేయగలదు; అయితే, కార్డియోమయోసైట్లలోని గ్లైకోలిసిస్‌పై IPA ప్రభావం కనుగొనబడలేదు, IPA ఇతర కణ రకాల బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను ప్రభావితం చేస్తుందని సూచిస్తుంది [45]. అందువల్ల, 1 mM IPA తేలికపాటి రసాయన అన్‌కప్లర్‌గా పనిచేస్తుందని మేము ఊహిస్తున్నాము, ఎందుకంటే ఇది mtDNA మొత్తాన్ని మార్చకుండా ఫైబ్రోజెనిక్ జన్యు వ్యక్తీకరణ, కణ స్వరూపం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను గణనీయంగా తగ్గిస్తుంది [46]. మైటోకాన్డ్రియల్ అన్‌కప్లర్లు కల్చర్-ప్రేరిత ఫైబ్రోసిస్ మరియు HSC యాక్టివేషన్‌ను నిరోధించగలవు [47] మరియు అన్‌కప్లింగ్ ప్రోటీన్లు (UCP) లేదా అడెనిన్ న్యూక్లియోటైడ్ ట్రాన్స్‌లోకేస్ (ANT) వంటి కొన్ని ప్రోటీన్‌ల ద్వారా నియంత్రించబడే లేదా ప్రేరేపించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ ATP ఉత్పత్తిని తగ్గిస్తాయి. కణ రకాన్ని బట్టి, ఈ దృగ్విషయం కణాలను అపోప్టోసిస్ నుండి రక్షించగలదు మరియు/లేదా అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది [46]. అయితే, హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ ఇనాక్టివేషన్‌లో మైటోకాన్డ్రియల్ అన్‌కప్లర్‌గా IPA పాత్రను విశదీకరించడానికి మరిన్ని అధ్యయనాలు అవసరం.
తరువాత మేము మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియలో మార్పులు జీవన LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పదనిర్మాణంలో ప్రతిబింబిస్తాయా అని పరిశోధించాము. ఆసక్తికరంగా, TGF-β1 చికిత్స మైటోకాన్డ్రియల్ నిష్పత్తిని గోళాకార నుండి ఇంటర్మీడియట్‌కు మారుస్తుంది, మైటోకాన్డ్రియల్ శాఖలు తగ్గడం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తిలో కీలకమైన కారకం అయిన DRP1 యొక్క వ్యక్తీకరణ పెరుగుతుంది [48]. ఇంకా, మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మొత్తం నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతతో ముడిపడి ఉంటుంది మరియు ఫ్యూజన్ నుండి ఫిషన్‌కు పరివర్తన హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) క్రియాశీలతకు కీలకం, అయితే మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తి నిరోధం HSC అపోప్టోసిస్‌కు దారితీస్తుంది [49]. అందువల్ల, TGF-β1 చికిత్స తగ్గిన బ్రాంచింగ్‌తో మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతలో తగ్గుదలను ప్రేరేపించవచ్చని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి, ఇది యాక్టివేటెడ్ హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCలు)తో సంబంధం ఉన్న మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తిలో ఎక్కువగా కనిపిస్తుంది. ఇంకా, మా డేటా IPA మైటోకాన్డ్రియా నిష్పత్తిని గోళాకార నుండి ఇంటర్మీడియట్ ఆకారానికి మార్చగలదని, తద్వారా OPA1 మరియు MFN2 యొక్క వ్యక్తీకరణను తగ్గిస్తుందని చూపించింది. OPA1 యొక్క నియంత్రణను తగ్గించడం వల్ల మైటోకాన్డ్రియల్ పొర సంభావ్యత తగ్గుతుందని మరియు సెల్ అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి [50]. MFN2 మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ మరియు అపోప్టోసిస్‌ను మధ్యవర్తిత్వం చేస్తుందని అంటారు[51]. పొందిన ఫలితాలు TGF-β1 మరియు/లేదా IPA ద్వారా LX-2 కణాల ప్రేరణ మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకారం మరియు పరిమాణాన్ని, అలాగే క్రియాశీలత స్థితి మరియు నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతను మాడ్యులేట్ చేస్తున్నట్లు సూచిస్తున్నాయి.
మా ఫలితాలు TGFβ-1 మరియు IPA ల కలయిక చికిత్స అపోప్టోసిస్-తప్పించుకునే కణాలలో ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్ మరియు మనుగడ-సంబంధిత జన్యువుల mRNA వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడం ద్వారా mtDNA మరియు సెల్ పదనిర్మాణ పారామితులను తగ్గించగలదని సూచిస్తున్నాయి. నిజానికి, IPA AKT1 యొక్క mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిని మరియు COL1A2 మరియు MMP2 వంటి ముఖ్యమైన ఫైబ్రోసిస్ జన్యువులను తగ్గించింది, కానీ అపోప్టోసిస్‌తో సంబంధం ఉన్న CASP8 యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిని పెంచింది. IPA చికిత్స తర్వాత, BAX వ్యక్తీకరణ తగ్గిందని మరియు TIMP1 కుటుంబ ఉపవిభాగాలైన BCL-2 మరియు NF-κB యొక్క mRNA వ్యక్తీకరణ పెరిగిందని మా ఫలితాలు చూపించాయి, ఇది అపోప్టోసిస్‌ను తప్పించుకునే హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCలు)లో IPA మనుగడ సంకేతాలను ప్రేరేపించగలదని సూచిస్తుంది. ఈ అణువులు యాక్టివేట్ చేయబడిన హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్‌లో ప్రో-సర్వైవల్ సిగ్నల్‌లుగా పనిచేస్తాయి, ఇవి యాంటీ-అపోప్టోటిక్ ప్రోటీన్‌ల (Bcl-2 వంటివి) పెరిగిన వ్యక్తీకరణతో, ప్రో-అపోప్టోటిక్ BAX యొక్క తగ్గిన వ్యక్తీకరణతో మరియు TIMP మరియు NF-κB మధ్య సంక్లిష్ట పరస్పర చర్యతో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు [5, 7]. PXR ద్వారా IPA దాని ప్రభావాలను చూపుతుంది మరియు TGF-β1 మరియు IPA లతో కలయిక చికిత్స PXR mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను పెంచిందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది HSC క్రియాశీలతను అణచివేస్తుందని సూచిస్తుంది. సక్రియం చేయబడిన PXR సిగ్నలింగ్ వివో మరియు ఇన్ విట్రో రెండింటిలోనూ HSC క్రియాశీలతను నిరోధిస్తుంది [52, 53]. అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహించడం, ఫైబ్రోసిస్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియను తగ్గించడం మరియు మనుగడ సంకేతాలను పెంచడం ద్వారా IPA సక్రియం చేయబడిన HSC ల క్లియరెన్స్‌లో పాల్గొనవచ్చని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి, ఇవి సక్రియం చేయబడిన HSC ఫినోటైప్‌ను క్రియారహితంగా మార్చే సాధారణ ప్రక్రియలు. అపోప్టోసిస్‌లో IPA యొక్క సంభావ్య యంత్రాంగం మరియు పాత్రకు మరొక సాధ్యమైన వివరణ ఏమిటంటే, ఇది పనిచేయని మైటోకాండ్రియాను ప్రధానంగా మైటోఫాగి (అంతర్గత మార్గం) మరియు బాహ్య TNF సిగ్నలింగ్ మార్గం (టేబుల్ 1) ద్వారా స్కావెంజ్ చేస్తుంది, ఇది NF-κB మనుగడ సిగ్నలింగ్ మార్గం (అనుబంధ చిత్రం 7) తో నేరుగా అనుసంధానించబడి ఉంటుంది. ఆసక్తికరంగా, IPA-సంబంధిత సుసంపన్నమైన జన్యువులు అపోప్టోటిక్ మార్గంలో ప్రో-అపోప్టోటిక్ మరియు ప్రో-సర్వైవల్ సిగ్నల్‌లను ప్రేరేపించగలవు [54], IPA ఈ జన్యువులతో సంకర్షణ చెందడం ద్వారా అపోప్టోటిక్ మార్గం లేదా మనుగడను ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తుంది. అయినప్పటికీ, HSC క్రియాశీలత సమయంలో IPA అపోప్టోసిస్ లేదా మనుగడను ఎలా ప్రేరేపిస్తుంది మరియు దాని యాంత్రిక మార్గాలు అస్పష్టంగానే ఉన్నాయి.
IPA అనేది ఆహార ట్రిప్టోఫాన్ నుండి గట్ మైక్రోబయోటా ద్వారా ఏర్పడిన సూక్ష్మజీవుల జీవక్రియ. ఇది పేగు వాతావరణంలో యాంటీ ఇన్ఫ్లమేటరీ, యాంటీఆక్సిడెంట్ మరియు ఎపిజెనెటిక్ నియంత్రణ లక్షణాలను కలిగి ఉందని అధ్యయనాలు చూపించాయి.[55] IPA పేగు అవరోధ పనితీరును మాడ్యులేట్ చేయగలదని మరియు ఆక్సీకరణ ఒత్తిడిని తగ్గించగలదని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది దాని స్థానిక శారీరక ప్రభావాలకు దోహదం చేస్తుంది.[56] వాస్తవానికి, IPA ప్రసరణ ద్వారా లక్ష్య అవయవాలకు రవాణా చేయబడుతుంది మరియు IPA ట్రిప్టోఫాన్, సెరోటోనిన్ మరియు ఇండోల్ ఉత్పన్నాలతో సారూప్య ప్రధాన జీవక్రియ నిర్మాణాన్ని పంచుకుంటుంది కాబట్టి, IPA జీవక్రియ చర్యలను ప్రదర్శిస్తుంది, ఫలితంగా పోటీ జీవక్రియ విధి ఏర్పడుతుంది.[52] IPA ఎంజైమ్‌లు లేదా గ్రాహకాలపై బైండింగ్ సైట్‌ల కోసం ట్రిప్టోఫాన్-ఉత్పన్న జీవక్రియలతో పోటీ పడవచ్చు, ఇది సాధారణ జీవక్రియ మార్గాలకు అంతరాయం కలిగించవచ్చు. దాని చికిత్సా విండోను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి దాని ఫార్మకోకైనటిక్స్ మరియు ఫార్మకోడైనమిక్స్‌పై తదుపరి అధ్యయనాల అవసరాన్ని ఇది హైలైట్ చేస్తుంది.[57] ఇది హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCలు)లో కూడా సంభవించవచ్చో లేదో చూడాలి.
మా అధ్యయనంలో కొన్ని పరిమితులు ఉన్నాయని మేము అంగీకరిస్తున్నాము. IPA కి సంబంధించిన అనుబంధాలను ప్రత్యేకంగా పరిశీలించడానికి, టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ (T2DM) ఉన్న రోగులను మేము మినహాయించాము. టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ మరియు అధునాతన కాలేయ వ్యాధి ఉన్న రోగులకు మా పరిశోధనల విస్తృత అనువర్తనాన్ని ఇది పరిమితం చేస్తుందని మేము అంగీకరిస్తున్నాము. మానవ సీరంలో IPA యొక్క శారీరక సాంద్రత 1–10 μM [11, 20] అయినప్పటికీ, నెక్రోటిక్ సెల్ జనాభా శాతంలో తేడా లేకుండా, అత్యధిక విషరహిత సాంద్రత [15] మరియు అపోప్టోసిస్ యొక్క అత్యధిక రేటు ఆధారంగా 1 mM IPA గాఢత ఎంపిక చేయబడింది. ఈ అధ్యయనంలో IPA యొక్క సూపర్‌ఫిజియోలాజికల్ స్థాయిలను ఉపయోగించినప్పటికీ, ప్రస్తుతం IPA యొక్క ప్రభావవంతమైన మోతాదుకు సంబంధించి ఏకాభిప్రాయం లేదు [52]. మా ఫలితాలు ముఖ్యమైనవి అయినప్పటికీ, IPA యొక్క విస్తృత జీవక్రియ విధి పరిశోధన యొక్క చురుకైన ప్రాంతంగా మిగిలిపోయింది. అంతేకాకుండా, సీరం IPA స్థాయిలు మరియు కాలేయ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల DNA మిథైలేషన్ మధ్య సంబంధంపై మా పరిశోధనలు హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCలు) నుండి మాత్రమే కాకుండా కాలేయ కణజాలాల నుండి కూడా పొందబడ్డాయి. ట్రాన్స్క్రిప్ట్ విశ్లేషణ నుండి మా మునుపటి ఫలితాల ఆధారంగా మేము మానవ LX-2 కణాలను ఉపయోగించాలని ఎంచుకున్నాము, IPA హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) యాక్టివేషన్‌తో సంబంధం కలిగి ఉందని [15], మరియు HSCలు కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ పురోగతిలో పాల్గొనే ప్రధాన కణాలు. కాలేయం బహుళ కణ రకాలతో కూడి ఉంటుంది, కాబట్టి కాస్పేస్ యాక్టివేషన్ మరియు DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌తో కలిపి హెపాటోసైట్-HSC-ఇమ్యూన్ సెల్ కో-కల్చర్ సిస్టమ్ వంటి ఇతర కణ నమూనాలను అలాగే ప్రోటీన్ స్థాయితో సహా చర్య యొక్క యంత్రాంగాన్ని IPA పాత్ర మరియు ఇతర కాలేయ కణ రకాలతో దాని పరస్పర చర్యను అధ్యయనం చేయడానికి పరిగణించాలి.