కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులలో ప్రేగు నుండి ఉత్పన్నమయ్యే ట్రిప్టోఫాన్ మెటబొలైట్ అయిన ఇండోల్-3-ప్రొపియోనిక్ యాసిడ్ (IPA) యొక్క సీరం స్థాయిలు తక్కువగా ఉంటాయని మేము గతంలో నివేదించాము. ఈ అధ్యయనంలో, మేము సీరం IPA స్థాయిలకు సంబంధించి ఊబకాయం ఉన్న కాలేయాలలో ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ మరియు DNA మిథైలోమ్‌ను, అలాగే ఇన్ విట్రోలో హెపాటిక్ స్టెల్లేట్ కణాల (HSCs) ఫినోటైపిక్ నిష్క్రియాశీలతను ప్రేరేపించడంలో IPA పాత్రను పరిశోధించాము.
ఈ అధ్యయనంలో, కుయోపియో బారియాట్రిక్ సర్జరీ సెంటర్ (KOBS)లో బారియాట్రిక్ సర్జరీ చేయించుకున్న, టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ (T2DM) లేని 116 మంది ఊబకాయ రోగులు (వయస్సు 46.8 ± 9.3 సంవత్సరాలు; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) పాల్గొన్నారు. రక్తంలో ప్రసరించే IPA స్థాయిలను లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) ద్వారా కొలిచారు, టోటల్ RNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ విశ్లేషణ చేశారు, మరియు ఇన్ఫినియం హ్యూమన్‌మిథైలేషన్450 బీడ్‌చిప్‌ను ఉపయోగించి DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణ నిర్వహించారు. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాల కోసం మానవ హెపాటిక్ స్టెల్లేట్ కణాలను (LX-2) ఉపయోగించారు.
సీరం IPA స్థాయిలు కాలేయంలోని అపోప్టోటిక్, మైటోఫాజిక్ మరియు దీర్ఘాయువు మార్గాలలో పాల్గొనే జన్యువుల వ్యక్తీకరణతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి. కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ మరియు DNA మిథైలేషన్ ప్రొఫైల్స్‌లో AKT సెరైన్/థ్రియోనిన్ కినేస్ 1 (AKT1) జన్యువు అత్యంత సమృద్ధిగా మరియు ఆధిపత్యంగా సంకర్షణ చెందే జన్యువుగా ఉంది. IPA చికిత్స, LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్ మరియు మనుగడను నియంత్రించే జన్యువుల వ్యక్తీకరణను మాడ్యులేట్ చేయడం ద్వారా అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించింది, మైటోకాండ్రియల్ శ్వాసక్రియను తగ్గించింది మరియు కణ స్వరూపాన్ని, మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్‌ను మార్చింది.
ఈ డేటా మొత్తం కలిపి చూస్తే, IPAకు సంభావ్య చికిత్సా ప్రభావాలు ఉన్నాయని, అది అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించి, HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియాత్మక స్థితికి మార్చగలదని, తద్వారా HSC క్రియాశీలత మరియు మైటోకాండ్రియల్ జీవక్రియకు అంతరాయం కలిగించడం ద్వారా కాలేయ ఫైబ్రోసిస్‌ను నిరోధించే అవకాశాన్ని విస్తరింపజేయగలదని సూచిస్తున్నాయి.
ఊబకాయం మరియు మెటబాలిక్ సిండ్రోమ్ యొక్క ప్రాబల్యం, జీవక్రియ సంబంధిత కొవ్వు కాలేయ వ్యాధి (MASLD) యొక్క పెరుగుతున్న సంభవంతో ముడిపడి ఉంది; ఈ వ్యాధి సాధారణ జనాభాలో 25% నుండి 30% మందిని ప్రభావితం చేస్తుంది [1]. MASLD యొక్క వ్యాధిజనకత యొక్క ప్రధాన పరిణామం కాలేయ ఫైబ్రోసిస్, ఇది ఫైబరస్ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) యొక్క నిరంతర సంచయనం ద్వారా వర్గీకరించబడిన ఒక డైనమిక్ ప్రక్రియ [2]. కాలేయ ఫైబ్రోసిస్‌లో పాల్గొనే ప్రధాన కణాలు హెపాటిక్ స్టెల్లేట్ కణాలు (HSCs), ఇవి నాలుగు తెలిసిన ఫినోటైప్‌లను ప్రదర్శిస్తాయి: నిశ్చల, క్రియాశీల, నిష్క్రియాత్మక మరియు వృద్ధాప్య [3, 4]. HSCలు క్రియాశీలమై, నిశ్చల రూపం నుండి అధిక శక్తి అవసరాలు కలిగిన ప్రొలిఫెరేటివ్ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ లాంటి కణాలుగా రూపాంతరం చెందగలవు, వీటిలో α-స్మూత్ మజిల్ యాక్టిన్ (α-SMA) మరియు టైప్ I కొల్లాజెన్ (Col-I) యొక్క వ్యక్తీకరణ పెరుగుతుంది [5, 6]. కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ తిరోగమనం సమయంలో, క్రియాశీల HSCలు అపోప్టోసిస్ లేదా నిష్క్రియాత్మకత ద్వారా తొలగించబడతాయి. ఈ ప్రక్రియలలో ఫైబ్రోజెనిక్ జన్యువుల డౌన్‌రెగ్యులేషన్ మరియు ప్రోసర్వైవల్ జన్యువుల మాడ్యులేషన్ (NF-κB మరియు PI3K/Akt సిగ్నలింగ్ మార్గాలు వంటివి) [7, 8], అలాగే మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ మరియు ఫంక్షన్‌లో మార్పులు [9] ఉన్నాయి.
MASLDతో సహా మానవ జీవక్రియ వ్యాధులలో ప్రేగులలో ఉత్పత్తి అయ్యే ట్రిప్టోఫాన్ మెటబొలైట్ ఇండోల్-3-ప్రొపియోనిక్ యాసిడ్ (IPA) యొక్క సీరం స్థాయిలు తగ్గినట్లు కనుగొనబడింది [10–13]. IPA ఆహార పీచుపదార్థాల తీసుకోవడంతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, దాని యాంటీఆక్సిడెంట్ మరియు యాంటీ ఇన్ఫ్లమేటరీ ప్రభావాలకు ప్రసిద్ధి చెందింది, మరియు వివో మరియు విట్రోలో ఆహారం-ప్రేరిత నాన్-ఆల్కహాలిక్ స్టీటోహెపటైటిస్ (NASH) ఫినోటైప్‌ను తగ్గిస్తుంది [11–14]. కుయోపియో బారియాట్రిక్ సర్జరీ స్టడీ (KOBS)లో కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ లేని ఊబకాయ రోగుల కంటే కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులలో సీరం IPA స్థాయిలు తక్కువగా ఉన్నాయని ప్రదర్శించిన మా మునుపటి అధ్యయనం నుండి కొంత ఆధారం లభించింది. ఇంకా, మానవ హెపాటిక్ స్టెల్లేట్ సెల్ (LX-2) నమూనాలో కణ సంశ్లేషణ, కణ వలస మరియు హెమటోపోయిటిక్ మూల కణ క్రియాశీలత యొక్క సాంప్రదాయ గుర్తులుగా ఉండే జన్యువుల వ్యక్తీకరణను IPA చికిత్స తగ్గించగలదని మరియు ఇది సంభావ్య హెపాటోప్రొటెక్టివ్ మెటబొలైట్ అని మేము చూపించాము [15]. అయితే, HSC అపోప్టోసిస్ మరియు మైటోకాండ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను ఉత్తేజపరచడం ద్వారా IPA కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ తిరోగమనాన్ని ఎలా ప్రేరేపిస్తుందనేది అస్పష్టంగానే ఉంది.
ఇక్కడ, ఊబకాయం ఉండి, టైప్ 2 డయాబెటిస్ లేని (KOBS) వ్యక్తుల కాలేయంలో, సీరం IPA అపోప్టోసిస్, మైటోఫేజీ మరియు దీర్ఘాయువు మార్గాలలో సమృద్ధిగా ఉన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణతో సంబంధం కలిగి ఉందని మేము ప్రదర్శిస్తున్నాము. అంతేకాకుండా, IPA నిష్క్రియా మార్గం ద్వారా క్రియాశీలక హెమటోపోయిటిక్ మూల కణాల (HSCs) నిర్మూలన మరియు క్షీణతను ప్రేరేపించగలదని మేము కనుగొన్నాము. ఈ ఫలితాలు IPA యొక్క ఒక నూతన పాత్రను వెల్లడిస్తున్నాయి, ఇది కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ తిరోగమనాన్ని ప్రోత్సహించడానికి ఒక సంభావ్య చికిత్సా లక్ష్యంగా మారుతుంది.
KOBS కోహోర్ట్‌లో గతంలో చేసిన ఒక అధ్యయనంలో, లివర్ ఫైబ్రోసిస్ లేని రోగులతో పోలిస్తే లివర్ ఫైబ్రోసిస్ ఉన్న రోగులలో సర్క్యులేటింగ్ IPA స్థాయిలు తక్కువగా ఉన్నాయని తేలింది [15]. టైప్ 2 డయాబెటిస్ యొక్క సంభావ్య గందరగోళ ప్రభావాన్ని మినహాయించడానికి, మేము కొనసాగుతున్న KOBS అధ్యయనం నుండి టైప్ 2 డయాబెటిస్ లేని 116 మంది ఊబకాయ రోగులను (సగటు వయస్సు ± SD: 46.8 ± 9.3 సంవత్సరాలు; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (పట్టిక 1) అధ్యయన జనాభాగా నియమించుకున్నాము [16]. పాల్గొన్న వారందరూ లిఖితపూర్వక సమాచార సమ్మతిని ఇచ్చారు మరియు హెల్సింకి ప్రకటన (54/2005, 104/2008 మరియు 27/2010)కు అనుగుణంగా నార్త్ సావో కౌంటీ హాస్పిటల్ యొక్క ఎథిక్స్ కమిటీ ద్వారా అధ్యయన ప్రోటోకాల్ ఆమోదించబడింది.
బారియాట్రిక్ శస్త్రచికిత్స సమయంలో కాలేయ బయాప్సీ నమూనాలను సేకరించి, గతంలో వివరించిన ప్రమాణాల ప్రకారం [17, 18] అనుభవజ్ఞులైన పాథాలజిస్టులచే హిస్టోలాజికల్‌గా అంచనా వేశారు. అంచనా ప్రమాణాలు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1లో సంగ్రహించబడ్డాయి మరియు గతంలో వివరించబడ్డాయి [19].
మెటబొలోమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం ఉపవాస సీరం నమూనాలను అన్‌టార్గెటెడ్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) ద్వారా విశ్లేషించారు (n = 116). గతంలో వివరించిన విధంగా¹⁹, నమూనాలను UHPLC-qTOF-MS సిస్టమ్ (1290 LC, 6540 qTOF-MS, అజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, వాల్డ్‌బ్రోన్, కార్ల్స్‌రూ, జర్మనీ) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ఐసోప్రొపైల్ ఆల్కహాల్ (IPA) గుర్తింపు రిటెన్షన్ సమయం మరియు MS/MS స్పెక్ట్రమ్‌ను స్వచ్ఛమైన ప్రమాణాలతో పోల్చడంపై ఆధారపడింది. అన్ని తదుపరి విశ్లేషణలలో IPA సిగ్నల్ తీవ్రత (పీక్ ఏరియా) పరిగణించబడింది [20].
ఇల్యూమినా హైసీక్ 2500 ఉపయోగించి మొత్తం కాలేయ RNA సీక్వెన్సింగ్ నిర్వహించబడింది మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా డేటా ప్రీప్రాసెస్ చేయబడింది [19, 21, 22]. మైటోమైనర్ 4.0 డేటాబేస్ [23] నుండి ఎంపిక చేయబడిన 1957 జన్యువులను ఉపయోగించి మైటోకాండ్రియా పనితీరు/బయోజెనిసిస్‌ను ప్రభావితం చేసే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల యొక్క లక్షిత డిఫరెన్షియల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణను మేము నిర్వహించాము. గతంలో వివరించిన అదే పద్ధతిని ఉపయోగించి ఇన్ఫినియం హ్యూమన్‌మిథైలేషన్450 బీడ్‌చిప్ (ఇల్యూమినా, శాన్ డియాగో, CA, USA) ఉపయోగించి కాలేయ DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది [24, 25].
మానవ హెపాటిక్ స్టెల్లేట్ కణాలను (LX-2) ప్రొఫెసర్ స్టెఫానో రోమియో దయతో అందించారు మరియు వాటిని DMEM/F12 మీడియంలో (బయోవెస్ట్, L0093-500, 1% పెన్/స్ట్రెప్; లోంజా, DE17-602E, 2% FBS; గిబ్కో, 10270-106) కల్చర్ చేసి, నిర్వహించారు. IPA యొక్క వర్కింగ్ డోస్‌ను ఎంచుకోవడానికి, LX-2 కణాలకు DMEM/F12 మీడియంలో 24 గంటల పాటు IPA యొక్క వివిధ గాఢతలతో (10 μM, 100 μM మరియు 1 mM; సిగ్మా, 220027) చికిత్స చేశారు. అంతేకాకుండా, HSCలను నిష్క్రియం చేసే IPA సామర్థ్యాన్ని పరిశోధించడానికి, LX-2 కణాలకు సీరమ్-రహిత మీడియంలో 24 గంటల పాటు 5 ng/ml TGF-β1 (R&D సిస్టమ్స్, 240-B-002/CF) మరియు 1 mM IPAతో కలిపి చికిత్స చేశారు. సంబంధిత వాహన నియంత్రణల కొరకు, TGF-β1 చికిత్సకు 0.1% BSA కలిగిన 4 nM HCL ను మరియు IPA చికిత్సకు 0.05% DMSO ను ఉపయోగించారు, మరియు సంయుక్త చికిత్స కోసం ఈ రెండింటినీ కలిపి ఉపయోగించారు.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ఉపయోగించి అపోప్టోసిస్‌ను అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, LX-2 (1 × 105 కణాలు/వెల్) ను 12-వెల్ ప్లేట్లలో రాత్రిపూట కల్చర్ చేసి, ఆపై IPA లేదా IPA మరియు TGF-β1 యొక్క బహుళ మోతాదులతో ట్రీట్ చేశారు. మరుసటి రోజు, తేలియాడే మరియు అంటుకొని ఉన్న కణాలను సేకరించి, ట్రిప్సినైజ్ చేసి, PBS తో కడిగి, Annexin V బైండింగ్ బఫర్‌లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, FITC-Annexin V మరియు 7-AAD తో 15 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు.
మైటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos (MTR) (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA) ఉపయోగించి జీవకణాలలోని మైటోకాండ్రియా ఆక్సీకరణ చర్య కోసం రంగు వేయబడ్డాయి. MTR పరీక్షల కోసం, LX-2 కణాలను IPA మరియు TGF-β1 లతో సమాన సాంద్రతలలో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 24 గంటల తర్వాత, జీవకణాలను ట్రిప్సినైజ్ చేసి, PBS తో కడిగి, ఆపై 100 μM MTR తో సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో 37 °C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు, ఇది గతంలో వివరించిన విధంగా [26]. లైవ్ సెల్ మార్ఫాలజీ విశ్లేషణ కోసం, కణ పరిమాణం మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతను వరుసగా ఫార్వర్డ్ స్కాటర్ (FSC) మరియు సైడ్ స్కాటర్ (SSC) పారామితులను ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.
మొత్తం డేటా (30,000 ఈవెంట్‌లు) నోవోసైట్ క్వాంటియాన్ (అజిలెంట్) ఉపయోగించి సేకరించబడింది మరియు నోవోఎక్స్‌ప్రెస్® 1.4.1 లేదా ఫ్లోజో V.10 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, సీహార్స్ XF సెల్ మైటో స్ట్రెస్‌తో కూడిన సీహార్స్ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ ఫ్లక్స్ అనలైజర్ (అజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, శాంటా క్లారా, CA) ఉపయోగించి ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు (OCR) మరియు ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ ఆమ్లీకరణ రేటు (ECAR)లను నిజ సమయంలో కొలిచారు. క్లుప్తంగా, 2 × 104 LX-2 కణాలను XF96 సెల్ కల్చర్ ప్లేట్లపై ఒక్కో వెల్‌కు విత్తారు. రాత్రిపూట ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, కణాలకు ఐసోప్రొపనాల్ (IPA) మరియు TGF-β1తో చికిత్స చేశారు (సప్లిమెంటరీ మెథడ్స్ 1). సీహార్స్ XF సెల్ ఎనర్జీ ఫినోటైప్ టెస్ట్ రిపోర్ట్ జనరేటర్‌ను కలిగి ఉన్న సీహార్స్ XF వేవ్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ జరిగింది. దీని నుండి, బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్ (BHI) లెక్కించబడింది [27].
మొత్తం RNA cDNA గా ప్రతిలేఖనం చేయబడింది. నిర్దిష్ట పద్ధతుల కోసం, సూచన [15] చూడండి. మానవ 60S రైబోసోమల్ ఆమ్ల ప్రోటీన్ P0 (RPLP0) మరియు సైక్లోఫిలిన్ A1 (PPIA) mRNA స్థాయిలను రాజ్యాంగ జన్యు నియంత్రణలుగా ఉపయోగించారు. క్వాన్‌స్టూడియో 6 ప్రో రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్, ల్యాండ్స్‌మీర్, నెదర్లాండ్స్) ను టాక్‌మాన్™ ఫాస్ట్ అడ్వాన్స్‌డ్ మాస్టర్ మిక్స్ కిట్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్) లేదా సెన్సిఫాస్ట్ SYBR లో-ROX కిట్ (బయోలైన్, BIO 94050) తో ఉపయోగించారు, మరియు సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణ రెట్లు తులనాత్మక Ct విలువ సైక్లింగ్ పారామితులు (ΔΔCt) మరియు ∆∆Ct పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించబడింది. ప్రైమర్‌ల వివరాలు అనుబంధ పట్టికలు S2 మరియు S3 లో అందించబడ్డాయి.
గతంలో వివరించిన విధంగా [28], DNeasy బ్లడ్ అండ్ టిష్యూ కిట్ (Qiagen) ఉపయోగించి న్యూక్లియర్ DNA (ncDNA) మరియు మైటోకాండ్రియల్ DNA (mtDNA) లను సంగ్రహించారు. సప్లిమెంటరీ మెథడ్స్ 2లో వివరించిన విధంగా, ప్రతి టార్గెట్ mtDNA ప్రాంతానికి మరియు మూడు న్యూక్లియర్ DNA ప్రాంతాల జ్యామితీయ సగటుకు (mtDNA/ncDNA) గల నిష్పత్తిని లెక్కించడం ద్వారా mtDNA యొక్క సాపేక్ష పరిమాణాన్ని లెక్కించారు. mtDNA మరియు ncDNA కోసం ప్రైమర్‌ల వివరాలు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S4లో అందించబడ్డాయి.
కణాల మధ్య మరియు కణాల లోపల ఉండే మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లను దృశ్యమానం చేయడానికి, సజీవ కణాలకు మైటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos (MTR) (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA) తో రంగు వేశారు. LX-2 కణాలను (1 × 104 కణాలు/వెల్) సంబంధిత గ్లాస్-బాటమ్డ్ కల్చర్ ప్లేట్లలో (ఇబిడి GmbH, మార్టిన్స్‌రీడ్, జర్మనీ) గ్లాస్ స్లైడ్‌లపై కల్చర్ చేశారు. 24 గంటల తర్వాత, సజీవ LX-2 కణాలను 37 °C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు 100 μM MTR తో ఇంక్యుబేట్ చేశారు మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా [29] కణ కేంద్రకాలకు DAPI (1 μg/ml, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) తో రంగు వేశారు. 63×NA 1.3 ఆబ్జెక్టివ్‌ను ఉపయోగించి, 37 °C వద్ద 5% CO2 తో తేమతో కూడిన వాతావరణంలో, జీస్ LSM 800 కాన్ఫోకల్ మాడ్యూల్‌తో కూడిన జీస్ యాక్సియో అబ్జర్వర్ ఇన్వర్టెడ్ మైక్రోస్కోప్ (కార్ల్ జీస్ మైక్రోఇమేజింగ్ GmbH, జెనా, జర్మనీ) ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లను దృశ్యమానం చేశారు. మేము ప్రతి నమూనా రకానికి పది Z-సిరీస్ చిత్రాలను సేకరించాము. ప్రతి Z-సిరీస్‌లో 30 విభాగాలు ఉంటాయి, ప్రతి విభాగం 9.86 μm మందంతో ఉంటుంది. ప్రతి నమూనా కోసం, ZEN 2009 సాఫ్ట్‌వేర్ (కార్ల్ జీస్ మైక్రోఇమేజింగ్ GmbH, జెనా, జర్మనీ) ఉపయోగించి పది విభిన్న వీక్షణ క్షేత్రాల చిత్రాలను సేకరించాము మరియు అనుబంధ పద్ధతులు 3లో వివరించిన పారామితుల ప్రకారం ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్ (v1.54d) [30, 31] ఉపయోగించి మైటోకాండ్రియల్ మార్ఫాలజీ విశ్లేషణను నిర్వహించాము.
కణాలను 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్‌లో 2% గ్లుటరాల్డిహైడ్‌తో స్థిరీకరించారు, ఆ తర్వాత 1% ఓస్మియం టెట్రాక్సైడ్ ద్రావణంతో (సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్, MO, USA) స్థిరీకరించారు, క్రమంగా అసిటోన్‌తో (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) నిర్జలీకరణం చేసి, చివరగా ఎపాక్సీ రెసిన్‌లో పొందుపరిచారు. అతి పలుచని సెక్షన్‌లను తయారు చేసి, 1% యురేనిల్ అసిటేట్ (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) మరియు 1% లెడ్ సిట్రేట్ (మెర్క్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ)తో రంగు వేశారు. 80 kV త్వరణ వోల్టేజ్ వద్ద JEM 2100F EXII ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (JEOL Ltd, టోక్యో, జపాన్) ఉపయోగించి అతిసూక్ష్మ నిర్మాణ చిత్రాలను పొందారు.
24 గంటల పాటు IPA తో చికిత్స పొందిన LX-2 కణాల స్వరూపాన్ని, జీస్ ఇన్వర్టెడ్ లైట్ మైక్రోస్కోప్ (జీస్ యాక్సియో వెర్ట్.A1 మరియు యాక్సియోక్యామ్ MRm, జెనా, జర్మనీ) ఉపయోగించి 50x మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద ఫేజ్-కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా విశ్లేషించారు.
క్లినికల్ డేటాను సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం లేదా మధ్యస్థం (అంతర చతుర్థాంశ వ్యాప్తి: IQR) రూపంలో వ్యక్తీకరించారు. మూడు అధ్యయన సమూహాల మధ్య వ్యత్యాసాలను పోల్చడానికి ఏకదిశా విశ్లేషణ వైవిధ్యం (నిరంతర చరరాశులు) లేదా χ² పరీక్ష (వర్గీకరణ చరరాశులు) ఉపయోగించబడ్డాయి. బహుళ పరీక్షల కోసం సరిదిద్దడానికి తప్పుడు పాజిటివ్ రేటు (FDR) ఉపయోగించబడింది, మరియు FDR < 0.05 ఉన్న జన్యువులు గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. CpG DNA మిథైలేషన్‌ను IPA సిగ్నల్ తీవ్రతతో సహసంబంధం చేయడానికి స్పియర్‌మన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది, నామమాత్రపు p విలువలు (p < 0.05) నివేదించబడ్డాయి.
రక్తంలో ప్రసరించే సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న 3093 కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లలో, 268 ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు (నామమాత్రపు p < 0.01), 119 మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు (నామమాత్రపు p < 0.05), మరియు 4350 CpGల కోసం వెబ్-ఆధారిత జన్యు సమితి విశ్లేషణ సాధనం (వెబ్‌గెస్టాల్ట్) ఉపయోగించి మార్గ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువులను కనుగొనడానికి ఉచితంగా లభించే వెన్నీ DB (వెర్షన్ 2.1.0) సాధనాన్ని, మరియు ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను దృశ్యమానం చేయడానికి స్ట్రింగ్‌DB (వెర్షన్ 11.5) ను ఉపయోగించారు.
LX-2 ప్రయోగం కోసం, డాగోస్టినో-పియర్సన్ పరీక్షను ఉపయోగించి నమూనాలను సాధారణత కోసం పరీక్షించారు. కనీసం మూడు జీవసంబంధమైన పునరావృతాల నుండి డేటాను పొందారు మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షతో వన్-వే ANOVAకు గురిచేశారు. 0.05 కంటే తక్కువ p-విలువ గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించబడింది. డేటా సగటు ± SDగా ప్రదర్శించబడింది మరియు ప్రయోగాల సంఖ్య ప్రతి చిత్రంలో సూచించబడింది. అన్ని విశ్లేషణలు మరియు గ్రాఫ్‌లు విండోస్ కోసం గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8 స్టాటిస్టికల్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను (గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ సాఫ్ట్‌వేర్ ఇంక్., వెర్షన్ 8.4.3, శాన్ డియాగో, USA) ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి.
మొదట, మేము సీరం IPA స్థాయిలకు మరియు కాలేయం, మొత్తం శరీరం, మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లకు మధ్య ఉన్న సంబంధాన్ని పరిశోధించాము. మొత్తం ట్రాన్స్క్రిప్ట్ ప్రొఫైల్‌లో, సీరం IPA స్థాయిలతో అత్యంత బలమైన సంబంధం ఉన్న జన్యువు MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; మైటోజెన్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినేస్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినేస్ 3); మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్క్రిప్ట్ ప్రొఫైల్‌లో, అత్యంత బలమైన సంబంధం ఉన్న జన్యువు AKT1 (FDR = 0.7621; AKT సెరైన్/థ్రియోనిన్ కినేస్ 1) (అదనపు ఫైల్ 1 మరియు అదనపు ఫైల్ 2).
తరువాత మేము గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లను (n = 268; p < 0.01) మరియు మైటోకాండ్రియా-అసోసియేటెడ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లను (n = 119; p < 0.05) విశ్లేషించాము, చివరికి అపోప్టోసిస్‌ను అత్యంత ముఖ్యమైన కానానికల్ మార్గంగా (p = 0.0089) గుర్తించాము. సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న మైటోకాండ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల కోసం, మేము అపోప్టోసిస్ (FDR = 0.00001), మైటోఫేజీ (FDR = 0.00029), మరియు TNF సిగ్నలింగ్ మార్గాలపై (FDR = 0.000006) దృష్టి సారించాము (మూర్తి 1A, పట్టిక 2, మరియు అనుబంధ మూర్తులు 1A-B).
సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న మానవ కాలేయంలోని గ్లోబల్, మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేషన్ యొక్క అతివ్యాప్తి విశ్లేషణ. A అనేది 268 గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు, 119 మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేటెడ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లను సూచిస్తుంది, ఇవి సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న 3092 CpG సైట్‌లకు మ్యాప్ చేయబడ్డాయి (గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు మరియు DNA మిథైలేటెడ్ కోసం p విలువలు < 0.01, మరియు మైటోకాండ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల కోసం p విలువలు < 0.05). ప్రధాన అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు మధ్యలో చూపబడ్డాయి (AKT1 మరియు YKT6). B అనేది, ఆన్‌లైన్ సాధనం StringDBని ఉపయోగించి సీరం IPA స్థాయిలతో గణనీయంగా సంబంధం ఉన్న 56 అతివ్యాప్తి చెందుతున్న జన్యువుల (నల్ల గీత ప్రాంతం) నుండి, ఇతర జన్యువులతో అత్యధిక ఇంటరాక్షన్ స్కోర్ (0.900) ఉన్న 13 జన్యువుల ఇంటరాక్షన్ మ్యాప్‌ను నిర్మించింది. ఆకుపచ్చ: జీన్ ఆంటాలజీ (GO) సెల్యులార్ కాంపోనెంట్: మైటోకాండ్రియా (GO:0005739)కు మ్యాప్ చేయబడిన జన్యువులు. డేటా ఆధారంగా (టెక్స్ట్ మైనింగ్, ప్రయోగాలు, డేటాబేస్‌లు మరియు సహ-వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా) ఇతర ప్రోటీన్‌లతో పరస్పర చర్యలకు AKT1 అత్యధిక స్కోరు (0.900) కలిగిన ప్రోటీన్. నెట్‌వర్క్ నోడ్‌లు ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి మరియు అంచులు ప్రోటీన్‌ల మధ్య కనెక్షన్‌లను సూచిస్తాయి.
గట్ మైక్రోబయోటా మెటబొలైట్స్ DNA మిథైలేషన్ ద్వారా ఎపిజెనెటిక్ కూర్పును నియంత్రించగలవు కాబట్టి [32], సీరం IPA స్థాయిలు కాలేయ DNA మిథైలేషన్‌తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయో లేదో మేము పరిశోధించాము. సీరం IPA స్థాయిలతో సంబంధం ఉన్న రెండు ప్రధాన మిథైలేషన్ సైట్‌లు ప్రోలిన్-సెరిన్-రిచ్ రీజియన్ 3 (C19orf55) మరియు హీట్ షాక్ ప్రోటీన్ ఫ్యామిలీ B (స్మాల్) మెంబర్ 6 (HSPB6) సమీపంలో ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (అదనపు ఫైల్ 3). 4350 CpG (p < 0.01) యొక్క DNA మిథైలేషన్ సీరం IPA స్థాయిలతో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉంది మరియు దీర్ఘాయువు నియంత్రణ మార్గాలలో (p = 0.006) సమృద్ధిగా ఉంది (మూర్తి 1A, పట్టిక 2, మరియు అనుబంధ మూర్తి 1C).
మానవ కాలేయంలో సీరం IPA స్థాయిలు, గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్, మైటోకాండ్రియా-అసోసియేటెడ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ మరియు DNA మిథైలేషన్ మధ్య ఉన్న సంబంధాల వెనుక ఉన్న జీవసంబంధమైన యంత్రాంగాలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము మునుపటి పాత్వే విశ్లేషణలో గుర్తించిన జన్యువులపై ఓవర్‌ల్యాప్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము (పటం 1A). 56 ఓవర్‌ల్యాపింగ్ జన్యువుల (పటం 1Aలోని నల్ల గీత లోపల ఉన్నవి) పాత్వే ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ ఫలితాలు, అపోప్టోసిస్ పాత్వే (p = 0.00029) మూడు విశ్లేషణలకు ఉమ్మడిగా ఉన్న రెండు జన్యువులను హైలైట్ చేసిందని చూపించాయి: AKT1 మరియు YKT6 (YKT6 v-SNARE హోమోలాగ్), ఇది వెన్ రేఖాచిత్రంలో చూపబడింది (అనుబంధ పటం 2 మరియు పటం 1A). ఆసక్తికరంగా, AKT1 (cg19831386) మరియు YKT6 (cg24161647) సీరం IPA స్థాయిలతో సానుకూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (అదనపు ఫైల్ 3). జన్యు ఉత్పత్తుల మధ్య సంభావ్య ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను గుర్తించడానికి, మేము 56 అతివ్యాప్త జన్యువులలో అత్యధిక ఉమ్మడి ప్రాంత స్కోరు (0.900) ఉన్న 13 జన్యువులను ఇన్‌పుట్‌గా ఎంచుకుని, ఒక పరస్పర చర్య పటాన్ని నిర్మించాము. విశ్వాస స్థాయి (మార్జినల్ కాన్ఫిడెన్స్) ప్రకారం, అత్యధిక స్కోరు (0.900) ఉన్న AKT1 జన్యువు అగ్రస్థానంలో ఉంది (పటం 1B).
మార్గ విశ్లేషణ ఆధారంగా, అపోప్టోసిస్ ప్రధాన మార్గమని మేము కనుగొన్నాము, కాబట్టి ఇన్ విట్రోలో HSCల అపోప్టోసిస్‌ను IPA చికిత్స ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో మేము పరిశోధించాము. IPA యొక్క వివిధ మోతాదులు (10 μM, 100 μM, మరియు 1 mM) LX-2 కణాలకు విషరహితమైనవని మేము గతంలో ప్రదర్శించాము [15]. ఈ అధ్యయనం 10 μM మరియు 100 μM వద్ద IPA చికిత్స జీవించి ఉన్న మరియు నెక్రోటిక్ కణాల సంఖ్యను పెంచిందని చూపించింది. అయితే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, 1 mM IPA గాఢత వద్ద కణాల జీవశక్తి తగ్గింది, అయితే కణ నెక్రోసిస్ రేటు మారలేదు (మూర్తి 2A, B). తరువాత, LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి సరైన గాఢతను కనుగొనడానికి, మేము 10 μM, 100 μM, మరియు 1 mM IPAని 24 గంటల పాటు పరీక్షించాము (మూర్తి 2A-E మరియు అనుబంధ మూర్తి 3A-B). ఆసక్తికరంగా, IPA 10 μM మరియు 100 μM అపోప్టోసిస్ రేటును (%) తగ్గించాయి, అయితే, నియంత్రణతో పోలిస్తే IPA 1 mM ఆలస్య అపోప్టోసిస్ మరియు అపోప్టోసిస్ రేటును (%) పెంచింది మరియు అందువల్ల తదుపరి ప్రయోగాల కోసం ఎంపిక చేయబడింది (మూర్తులు 2A–D).
IPA, LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది. ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా అపోప్టోటిక్ రేటు మరియు కణ స్వరూపాన్ని లెక్కించడానికి యాన్నెక్సిన్ V మరియు 7-AAD డబుల్ స్టెయినింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. BA కణాలను 10 μM, 100 μM మరియు 1 mM IPA తో 24 గంటల పాటు లేదా F–H TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. A: జీవించి ఉన్న కణాలు (యాన్నెక్సిన్ V -/ 7AAD-); B: నెక్రోటిక్ కణాలు (యాన్నెక్సిన్ V -/ 7AAD+); C, F: ప్రారంభ దశ (యాన్నెక్సిన్ V +/ 7AAD-); D, G: చివరి దశ (యాన్నెక్సిన్ V+/7AAD.+); E, H: అపోప్టోటిక్ రేటులో మొత్తం ప్రారంభ మరియు చివరి దశ అపోప్టోటిక్ కణాల శాతం (%). డేటాను మీన్ ± SD గా వ్యక్తీకరించారు, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలు. బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షతో వన్-వే ANOVA ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు జరిపబడ్డాయి. *p < 0.05; ****p < 0.0001
మేము ఇంతకు ముందు చూపినట్లుగా, 5 ng/ml TGF-β1 సాంప్రదాయ మార్కర్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను పెంచడం ద్వారా HSC క్రియాశీలతను ప్రేరేపిస్తుంది [15]. LX-2 కణాలకు 5 ng/ml TGF-β1 మరియు 1 mM IPA కలిపి చికిత్స చేశారు (Fig. 2E–H). TGF-β1 చికిత్స అపోప్టోసిస్ రేటును మార్చలేదు, అయితే, TGF-β1 చికిత్సతో పోలిస్తే IPA సహ-చికిత్స ఆలస్య అపోప్టోసిస్ మరియు అపోప్టోసిస్ రేటు (%) ను పెంచింది (Fig. 2E–H). ఈ ఫలితాలు 1 mM IPA, TGF-β1 ప్రేరణతో సంబంధం లేకుండా LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహించగలదని సూచిస్తున్నాయి.
మేము LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియపై IPA ప్రభావాన్ని మరింతగా పరిశోధించాము. ఫలితాలు ఏమి చూపించాయంటే, నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు 1 mM IPA ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు (OCR) పారామితులను తగ్గించింది: మైటోకాన్డ్రియల్-యేతర శ్వాసక్రియ, బేసల్ మరియు గరిష్ట శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్ మరియు ATP ఉత్పత్తి (చిత్రం 3A, B), అయితే బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్ (BHI) మారలేదు.
IPA, LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియను తగ్గిస్తుంది. మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ వక్రరేఖ (OCR) మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియ పారామితులుగా (మైటోకాన్డ్రియల్-యేతర శ్వాసక్రియ, బేసల్ శ్వాసక్రియ, గరిష్ట శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్, ATP ఉత్పత్తి, SRC మరియు BHI) ప్రదర్శించబడింది. కణాలు A మరియు B లను వరుసగా 10 μM, 100 μM మరియు 1 mM IPA తో 24 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. కణాలు C మరియు D లను వరుసగా సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో 24 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. అన్ని కొలతలు CyQuant కిట్‌ను ఉపయోగించి DNA కంటెంట్‌కు అనుగుణంగా సాధారణీకరించబడ్డాయి. BHI: బయోఎనర్జెటిక్ హెల్త్ ఇండెక్స్; SRC: రెస్పిరేటరీ రిజర్వ్ కెపాసిటీ; OCR: ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటు. డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (SD) గా ప్రదర్శించబడింది, n = 5 స్వతంత్ర ప్రయోగాలు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు జరిగాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; మరియు ***p < 0.001
TGF-β1-ఉత్తేజిత LX-2 కణాల జీవశక్తి ప్రొఫైల్‌పై IPA ప్రభావాన్ని మరింత సమగ్రంగా అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము OCR ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను విశ్లేషించాము (పటం 3C,D). నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే TGF-β1 చికిత్స గరిష్ట శ్వాసక్రియ, శ్వాసక్రియ నిల్వ సామర్థ్యం (SRC) మరియు BHI లను తగ్గించగలదని ఫలితాలు చూపించాయి (పటం 3C,D). అదనంగా, సంయుక్త చికిత్స ప్రాథమిక శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్ మరియు ATP ఉత్పత్తిని తగ్గించింది, కానీ SRC మరియు BHI లు TGF-β1 తో చికిత్స పొందిన వాటి కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉన్నాయి (పటం 3C,D).
మేము సీహార్స్ సాఫ్ట్‌వేర్ అందించిన “సెల్యులార్ ఎనర్జీ ఫినోటైప్ టెస్ట్”ను కూడా నిర్వహించాము (అనుబంధ చిత్రం 4A–D). అనుబంధ చిత్రం 3Bలో చూపినట్లుగా, TGF-β1 చికిత్స తర్వాత OCR మరియు ECAR జీవక్రియ సామర్థ్యాలు రెండూ తగ్గాయి, అయితే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే కాంబినేషన్ మరియు IPA చికిత్స సమూహాలలో ఎటువంటి తేడా గమనించబడలేదు. అంతేకాకుండా, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే కాంబినేషన్ మరియు IPA చికిత్స తర్వాత OCR యొక్క బేసల్ మరియు స్ట్రెస్ స్థాయిలు రెండూ తగ్గాయి (అనుబంధ చిత్రం 4C). ఆసక్తికరంగా, కాంబినేషన్ థెరపీతో కూడా ఇలాంటి నమూనానే గమనించబడింది, ఇక్కడ TGF-β1 చికిత్సతో పోలిస్తే ECAR యొక్క బేసల్ మరియు స్ట్రెస్ స్థాయిలలో ఎటువంటి మార్పు గమనించబడలేదు (అనుబంధ చిత్రం 4C). HSCలలో, మైటోకాండ్రియల్ ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌లో తగ్గుదల మరియు TGF-β1 చికిత్సకు గురైన తర్వాత SCR మరియు BHIలను పునరుద్ధరించడానికి కాంబినేషన్ చికిత్సకు ఉన్న సామర్థ్యం జీవక్రియ సామర్థ్యాన్ని (OCR మరియు ECAR) మార్చలేదు. మొత్తంగా తీసుకుంటే, ఈ ఫలితాలు IPA, HSCలలో జీవశక్తిని తగ్గించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, అంటే IPA తక్కువ శక్తివంతమైన ప్రొఫైల్‌ను ప్రేరేపించి, HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియం వైపు మారుస్తుంది (అనుబంధ చిత్రం 4D).
మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు నెట్‌వర్క్ కనెక్షన్‌ల త్రిమితీయ పరిమాణీకరణతో పాటు MTR స్టెయినింగ్ (పటం 4 మరియు అనుబంధ పటం 5) ఉపయోగించి మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌పై IPA ప్రభావాన్ని పరిశోధించడం జరిగింది. పటం 4 ప్రకారం, నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, TGF-β1 చికిత్స సగటు ఉపరితల వైశాల్యం, శాఖల సంఖ్య, మొత్తం శాఖల పొడవు మరియు శాఖల సంధుల సంఖ్యను (పటం 4A మరియు B) తగ్గించింది మరియు మైటోకాన్డ్రియాల నిష్పత్తిని గోళాకారం నుండి మధ్యస్థ స్వరూపానికి మార్చింది (పటం 4C). నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, కేవలం IPA చికిత్స మాత్రమే సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ ఘనపరిమాణాన్ని తగ్గించింది మరియు మైటోకాన్డ్రియాల నిష్పత్తిని గోళాకారం నుండి మధ్యస్థ స్వరూపానికి మార్చింది (పటం 4A). దీనికి విరుద్ధంగా, మైటోకాన్డ్రియల్ పొర పొటెన్షియల్-ఆధారిత MTR (పటం 4A మరియు E) ద్వారా అంచనా వేయబడిన గోళాకారం, సగటు శాఖల పొడవు మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాశీలత మారకుండా ఉన్నాయి మరియు ఈ పారామీటర్లు సమూహాల మధ్య భిన్నంగా లేవు. ఈ ఫలితాలన్నీ కలిపి చూస్తే, TGF-β1 మరియు IPA చికిత్సలు జీవించి ఉన్న LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకారం మరియు పరిమాణంతో పాటు నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతను నియంత్రిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి.
IPA, LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ DNA సమృద్ధిని మారుస్తుంది. A. సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటల పాటు TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPA తో ఇంక్యుబేట్ చేయబడిన సజీవ LX-2 కణాల యొక్క ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ చిత్రాలు. వీటిలో మైటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos తో రంగు వేయబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లు మరియు DAPI తో నీలం రంగులో రంగు వేయబడిన కేంద్రకాలు కనిపిస్తున్నాయి. మొత్తం డేటాలో ప్రతి గ్రూపునకు కనీసం 15 చిత్రాలు ఉన్నాయి. మేము ప్రతి నమూనా రకానికి 10 Z-స్టాక్ చిత్రాలను సేకరించాము. ప్రతి Z-యాక్సిస్ సీక్వెన్స్‌లో 30 స్లైస్‌లు ఉన్నాయి, ఒక్కొక్కటి 9.86 μm మందంతో ఉన్నాయి. స్కేల్ బార్: 10 μm. B. చిత్రానికి అడాప్టివ్ థ్రెషోల్డింగ్‌ను వర్తింపజేయడం ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రతినిధి వస్తువులు (మైటోకాన్డ్రియా మాత్రమే). ప్రతి గ్రూపులోని అన్ని కణాలకు మైటోకాన్డ్రియల్ మార్ఫలాజికల్ నెట్‌వర్క్ కనెక్షన్‌ల పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ మరియు పోలిక చేయబడ్డాయి. C. మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకార నిష్పత్తుల ఫ్రీక్వెన్సీ. 0కి దగ్గరగా ఉన్న విలువలు గోళాకార ఆకృతులను, మరియు 1కి దగ్గరగా ఉన్న విలువలు తంతువుల వంటి ఆకృతులను సూచిస్తాయి. D. మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా మైటోకాండ్రియల్ DNA (mtDNA) పరిమాణాన్ని నిర్ధారించారు. E. మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా ఫ్లో సైటోమెట్రీ (30,000 ఈవెంట్‌లు) ద్వారా మైటోట్రాకర్™ రెడ్ CMXRos విశ్లేషణను నిర్వహించారు. డేటాను మీన్ ± SD, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించారు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ టెస్ట్‌ను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలను నిర్వహించారు. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
తరువాత మేము మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్యకు సూచికగా LX-2 కణాలలో mtDNA కంటెంట్‌ను విశ్లేషించాము. నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంలో mtDNA కంటెంట్ పెరిగింది (పటం 4D). TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంతో పోలిస్తే, సంయుక్త చికిత్స సమూహంలో mtDNA కంటెంట్ తగ్గింది (పటం 4D), ఇది IPA, mtDNA కంటెంట్‌ను మరియు బహుశా మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్యను అలాగే మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియను కూడా తగ్గించవచ్చని సూచిస్తుంది (పటం 3C). అంతేకాకుండా, సంయుక్త చికిత్సలో IPA, mtDNA కంటెంట్‌ను తగ్గించినట్లు కనిపించినప్పటికీ, MTR-మధ్యవర్తిత్వ మైటోకాన్డ్రియల్ కార్యాచరణను ప్రభావితం చేయలేదు (పటాలు 4A–C).
మేము LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్, సర్వైవల్ మరియు మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్‌తో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల mRNA స్థాయిలతో IPA యొక్క అనుబంధాన్ని పరిశోధించాము (పటం 5A–D). నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహం కొల్లాజెన్ టైప్ I α2 చైన్ (COL1A2), α-స్మూత్ మజిల్ యాక్టిన్ (αSMA), మ్యాట్రిక్స్ మెటల్లోప్రొటీనేస్ 2 (MMP2), టిష్యూ ఇన్హిబిటర్ ఆఫ్ మెటల్లోప్రొటీనేస్ 1 (TIMP1), మరియు డైనమిన్ 1-లైక్ జీన్ (DRP1) వంటి జన్యువుల వ్యక్తీకరణను పెంచింది, ఇది పెరిగిన ఫైబ్రోసిస్ మరియు యాక్టివేషన్‌ను సూచిస్తుంది. ఇంకా, నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, TGF-β1 చికిత్స న్యూక్లియర్ ప్రెగ్నేన్ X రిసెప్టర్ (PXR), కాస్పేస్ 8 (CASP8), MAPKAPK3, ఇన్హిబిటర్ ఆఫ్ B-సెల్ α, ఎన్‌హాన్సర్ ఆఫ్ న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ κ జీన్ లైట్ పెప్టైడ్ (NFκB1A), మరియు ఇన్హిబిటర్ ఆఫ్ న్యూక్లియర్ ఫ్యాక్టర్ κB కైనేస్ సబ్‌యూనిట్ β (IKBKB) ల mRNA స్థాయిలను తగ్గించింది (పటం 5A–D). TGF-β1 చికిత్సతో పోల్చినప్పుడు, TGF-β1 మరియు IPA ల కలయిక చికిత్స COL1A2 మరియు MMP2 ల వ్యక్తీకరణను తగ్గించింది, కానీ PXR, TIMP1, B-సెల్ లింఫోమా-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, మరియు IKBKB ల mRNA స్థాయిలను పెంచింది. నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, IPA చికిత్స MMP2, Bcl-2-అసోసియేటెడ్ ప్రోటీన్ X (BAX), AKT1, ఆప్టిక్ అట్రోఫీ ప్రోటీన్ 1 (OPA1), మరియు మైటోకాండ్రియల్ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ 2 (MFN2) యొక్క వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా తగ్గించింది, అయితే CASP8, NFκB1A, NFκB1B, మరియు IKBKB యొక్క వ్యక్తీకరణ పెరిగింది. అయితే, కాస్పేస్-3 (CASP3), అపోప్టోటిక్ పెప్టిడేస్ యాక్టివేటింగ్ ఫ్యాక్టర్ 1 (APAF1), మైటోకాండ్రియల్ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ 1 (MFN1), మరియు ఫిషన్ ప్రోటీన్ 1 (FIS1) యొక్క వ్యక్తీకరణలో ఎటువంటి తేడా కనుగొనబడలేదు. సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు IPA చికిత్స ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్, మనుగడ, మరియు మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్‌తో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణను మాడ్యులేట్ చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. మా డేటా ప్రకారం, IPA చికిత్స LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోసిస్‌ను తగ్గిస్తుంది; అదే సమయంలో, ఇది ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియాత్మకత వైపు మార్చడం ద్వారా మనుగడను ప్రేరేపిస్తుంది.
IPA, LX-2 కణాలలో ఫైబ్రోబ్లాస్ట్, అపోప్టోటిక్, వయబిలిటీ మరియు మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను మాడ్యులేట్ చేస్తుంది. సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో 24 గంటల పాటు TGF-β1 మరియు IPAతో LX-2 కణాలను ప్రేరేపించిన తర్వాత, ఎండోజెనస్ కంట్రోల్ (RPLP0 లేదా PPIA)తో పోలిస్తే mRNA వ్యక్తీకరణను హిస్టోగ్రామ్‌లు ప్రదర్శిస్తాయి. A ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లను, B అపోప్టోటిక్ కణాలను, C జీవించి ఉన్న కణాలను మరియు D మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్ జన్యు వ్యక్తీకరణను సూచిస్తాయి. డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (SD)గా ప్రదర్శించబడింది, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలు. వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక పోలికలు జరిగాయి. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
తరువాత, కణ పరిమాణంలో (FSC-H) మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతలో (SSC-H) మార్పులను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా అంచనా వేశారు (పటం 6A,B), మరియు IPA చికిత్స తర్వాత కణ స్వరూపంలో మార్పులను ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) మరియు ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా అంచనా వేశారు (అనుబంధ పటం 6A-B). ఊహించినట్లుగానే, నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంలోని కణాలు పరిమాణంలో పెరిగాయి (పటం 6A,B), రఫ్ ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్ (ER*) మరియు ఫాగోలైసోజోమ్‌ల (P) యొక్క సాంప్రదాయ విస్తరణను చూపించాయి, ఇది హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) క్రియాశీలతను సూచిస్తుంది (అనుబంధ పటం 6A). అయితే, TGF-β1-చికిత్స పొందిన సమూహంతో పోలిస్తే, TGF-β1 మరియు IPA కలయిక చికిత్స సమూహంలో కణ పరిమాణం, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత (పటం 6A,B), మరియు ER* కంటెంట్ తగ్గాయి (అనుబంధ పటం 6A). ఇంకా, నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు IPA చికిత్స కణ పరిమాణాన్ని, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతను (చిత్రాలు 6A,B), P మరియు ER* కంటెంట్‌ను (అనుబంధ చిత్రం 6A) తగ్గించింది. అదనంగా, నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు 24 గంటల IPA చికిత్స తర్వాత అపోప్టోటిక్ కణాల కంటెంట్ పెరిగింది (తెల్ల బాణాలు, అనుబంధ చిత్రం 6B). సమిష్టిగా, ఈ ఫలితాలు 1 mM IPA, HSC అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించగలదని మరియు TGF-β1 ద్వారా ప్రేరేపించబడిన కణ స్వరూప పారామితులలోని మార్పులను తిప్పికొట్టగలదని, తద్వారా కణ పరిమాణం మరియు సంక్లిష్టతను నియంత్రించగలదని సూచిస్తున్నాయి, ఇది HSC నిష్క్రియం కావడంతో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు.
IPA, LX-2 కణాలలో కణ పరిమాణాన్ని మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టతను మారుస్తుంది. ఫ్లో సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ యొక్క ప్రతినిధి చిత్రాలు. ఈ విశ్లేషణలో LX-2 కణాలకు ప్రత్యేకమైన గేటింగ్ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించారు: కణ సమూహాన్ని నిర్వచించడానికి SSC-A/FSC-A, జంటలను గుర్తించడానికి FSC-H/FSC-A, మరియు కణ పరిమాణం మరియు సంక్లిష్టత విశ్లేషణ కోసం SSC-H/FSC-H. కణాలను సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో TGF-β1 (5 ng/ml) మరియు 1 mM IPAతో 24 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. కణ పరిమాణం మరియు సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత విశ్లేషణ కోసం LX-2 కణాలను దిగువ ఎడమ క్వాడ్రంట్ (SSC-H-/FSC-H-), ఎగువ ఎడమ క్వాడ్రంట్ (SSC-H+/FSC-H-), దిగువ కుడి క్వాడ్రంట్ (SSC-H-/FSC-H+), మరియు ఎగువ కుడి క్వాడ్రంట్ (SSC-H+/FSC-H+)గా విభజించారు. B. కణ స్వరూపాన్ని FSC-H (ఫార్వర్డ్ స్కాటర్, కణ పరిమాణం) మరియు SSC-H (సైడ్ స్కాటర్, సైటోప్లాస్మిక్ సంక్లిష్టత) (30,000 ఈవెంట్‌లు) ఉపయోగించి ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు. డేటాను మీన్ ± SD, n = 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా ప్రదర్శించారు. గణాంక పోలికలను వన్-వే ANOVA మరియు బోన్‌ఫెరోని పోస్ట్ హాక్ పరీక్షను ఉపయోగించి నిర్వహించారు. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 మరియు ****p < 0.0001
IPA వంటి గట్ మెటబొలైట్‌లు పరిశోధనలో ఒక ముఖ్యమైన అంశంగా మారాయి, ఇది గట్ మైక్రోబయోటాలో కొత్త లక్ష్యాలను కనుగొనవచ్చని సూచిస్తుంది. అందువల్ల, మానవులలో కాలేయ ఫైబ్రోసిస్‌తో మనం అనుసంధానించిన మెటబొలైట్ అయిన IPA [15], జంతు నమూనాలలో సంభావ్య యాంటీ-ఫైబ్రోటిక్ సమ్మేళనంగా చూపబడటం ఆసక్తికరంగా ఉంది [13, 14]. ఇక్కడ, మేము టైప్ 2 డయాబెటిస్ (T2D) లేని ఊబకాయ వ్యక్తులలో సీరం IPA మరియు గ్లోబల్ లివర్ ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు DNA మిథైలేషన్ మధ్య సంబంధాన్ని మొదటిసారిగా ప్రదర్శిస్తున్నాము, ఇది అపోప్టోసిస్, మైటోఫేజీ మరియు దీర్ఘాయువును, అలాగే కాలేయ హోమియోస్టాసిస్‌ను నియంత్రించే AKT1 అనే సంభావ్య అభ్యర్థి జన్యువును హైలైట్ చేస్తుంది. మా అధ్యయనంలోని మరో కొత్తదనం ఏమిటంటే, మేము LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్, కణ స్వరూపం, మైటోకాండ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్ మరియు డైనమిక్స్‌తో IPA చికిత్స యొక్క పరస్పర చర్యను ప్రదర్శించాము, ఇది HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియం వైపు మార్చే తక్కువ శక్తి స్పెక్ట్రమ్‌ను సూచిస్తుంది, ఇది కాలేయ ఫైబ్రోసిస్‌ను మెరుగుపరచడానికి IPAని సంభావ్య అభ్యర్థిగా చేస్తుంది.
ప్రసరణ సీరం IPAతో సంబంధం ఉన్న కాలేయ జన్యువులలో అపోప్టోసిస్, మైటోఫేజీ మరియు దీర్ఘాయువు అనేవి అత్యంత ముఖ్యమైన ప్రామాణిక మార్గాలుగా ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము. మైటోకాండ్రియల్ నాణ్యత నియంత్రణ (MQC) వ్యవస్థకు అంతరాయం కలగడం వల్ల మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడం, మైటోఫేజీ మరియు అపోప్టోసిస్ సంభవించవచ్చు, తద్వారా MASLD సంభవించడాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది[33, 34]. అందువల్ల, కాలేయంలో అపోప్టోసిస్, మైటోఫేజీ మరియు దీర్ఘాయువు ద్వారా కణ గతిశీలత మరియు మైటోకాండ్రియల్ సమగ్రతను నిర్వహించడంలో IPA పాల్గొనవచ్చని మనం ఊహించవచ్చు. మా డేటా ప్రకారం మూడు అస్సేలలో రెండు జన్యువులు ఉమ్మడిగా ఉన్నాయి: YKT6 మరియు AKT1. YKT6 అనేది కణ త్వచ సంలీన ప్రక్రియలో పాల్గొనే ఒక SNARE ప్రోటీన్ అని గమనించాలి. ఇది ఆటోఫాగోసోమ్‌పై STX17 మరియు SNAP29తో ఒక ప్రారంభ సంక్లిష్టాన్ని ఏర్పరచడం ద్వారా ఆటోఫాజీ మరియు మైటోఫేజీలో పాత్ర పోషిస్తుంది, తద్వారా ఆటోఫాగోసోమ్‌లు మరియు లైసోసోమ్‌ల సంలీనాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది[35]. ఇంకా, YKT6 పనితీరు కోల్పోవడం వలన మైటోఫేజీ దెబ్బతింటుంది[36], అయితే YKT6 యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్ హెపటోసెల్యులార్ కార్సినోమా (HCC) పురోగతితో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, ఇది కణాల మనుగడను పెంచుతుంది[37]. మరోవైపు, AKT1 అత్యంత ముఖ్యమైన ఇంటరాక్టింగ్ జన్యువు మరియు PI3K/AKT సిగ్నలింగ్ మార్గం, కణ చక్రం, కణ వలస, విస్తరణ, ఫోకల్ అడెషన్, మైటోకాండ్రియల్ పనితీరు మరియు కొల్లాజెన్ స్రావంతో సహా కాలేయ వ్యాధులలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది[38–40]. యాక్టివేట్ చేయబడిన PI3K/AKT సిగ్నలింగ్ మార్గం హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCs)ను యాక్టివేట్ చేయగలదు, ఇవి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) ఉత్పత్తికి బాధ్యత వహించే కణాలు, మరియు దాని నియంత్రణ లోపం కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ సంభవించడానికి మరియు పురోగతికి దోహదం చేస్తుంది[40]. అదనంగా, AKT అనేది p53-ఆధారిత కణ అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధించే కీలక కణ మనుగడ కారకాలలో ఒకటి, మరియు AKT యాక్టివేషన్ కాలేయ కణ అపోప్టోసిస్ నిరోధంతో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు[41, 42]. పొందిన ఫలితాలు సూచిస్తున్నదేమిటంటే, హెపటోసైట్లు అపోప్టోసిస్‌లోకి ప్రవేశించాలా లేదా మనుగడ సాగించాలా అనే నిర్ణయాన్ని ప్రభావితం చేయడం ద్వారా, IPA కాలేయ మైటోకాండ్రియా-సంబంధిత అపోప్టోసిస్‌లో పాలుపంచుకోవచ్చు. ఈ ప్రభావాలు AKT మరియు/లేదా YKT6 కాండిడేట్ జన్యువుల ద్వారా నియంత్రించబడవచ్చు, ఇవి కాలేయ హోమియోస్టాసిస్‌కు కీలకమైనవి.
మా ఫలితాలు 1 mM IPA, TGF-β1 చికిత్సతో సంబంధం లేకుండా LX-2 కణాలలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించిందని మరియు మైటోకాండ్రియల్ శ్వాసక్రియను తగ్గించిందని చూపించాయి. ఫైబ్రోసిస్ పరిష్కారం మరియు హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) క్రియాశీలతకు అపోప్టోసిస్ ఒక ప్రధాన మార్గం, మరియు ఇది కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ యొక్క తిరోగమన శారీరక ప్రతిస్పందనలో ఒక కీలక సంఘటన అని గమనించదగిన విషయం [4, 43]. అంతేకాకుండా, సంయుక్త చికిత్స తర్వాత LX-2 కణాలలో BHI పునరుద్ధరణ, మైటోకాండ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్ నియంత్రణలో IPA యొక్క సంభావ్య పాత్రపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందించింది. విశ్రాంతి మరియు నిష్క్రియ పరిస్థితులలో, హెమటోపోయిటిక్ కణాలు సాధారణంగా ATPని ఉత్పత్తి చేయడానికి మైటోకాండ్రియల్ ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను ఉపయోగిస్తాయి మరియు తక్కువ జీవక్రియ కార్యకలాపాలను కలిగి ఉంటాయి. మరోవైపు, HSC క్రియాశీలత గ్లైకోలిటిక్ స్థితిలోకి ప్రవేశించడానికి అవసరమైన శక్తిని భర్తీ చేయడానికి మైటోకాండ్రియల్ శ్వాసక్రియ మరియు బయోసింథసిస్‌ను పెంచుతుంది [44]. IPA జీవక్రియ సామర్థ్యం మరియు ECARను ప్రభావితం చేయలేదనే వాస్తవం గ్లైకోలిటిక్ మార్గానికి తక్కువ ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడిందని సూచిస్తుంది. అదేవిధంగా, మరొక అధ్యయనం 1 mM IPA కార్డియోమయోసైట్లు, మానవ హెపటోసైట్ సెల్ లైన్ (Huh7) మరియు మానవ బొడ్డు తాడు సిర ఎండోథెలియల్ కణాలలో (HUVEC) మైటోకాండ్రియల్ శ్వాసకోశ గొలుసు కార్యకలాపాలను మాడ్యులేట్ చేయగలదని చూపించింది; అయితే, కార్డియోమయోసైట్లలో గ్లైకోలిసిస్‌పై IPA ప్రభావం కనుగొనబడలేదు, ఇది IPA ఇతర కణ రకాల బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను ప్రభావితం చేయవచ్చని సూచిస్తుంది [45]. అందువల్ల, 1 mM IPA ఒక తేలికపాటి రసాయన అన్‌కప్లర్‌గా పనిచేస్తుందని మేము ఊహిస్తున్నాము, ఎందుకంటే ఇది mtDNA మొత్తాన్ని మార్చకుండా ఫైబ్రోజెనిక్ జన్యు వ్యక్తీకరణ, కణ స్వరూపం మరియు మైటోకాండ్రియల్ బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను గణనీయంగా తగ్గించగలదు [46]. మైటోకాండ్రియల్ అన్‌కప్లర్‌లు కల్చర్-ప్రేరిత ఫైబ్రోసిస్ మరియు HSC యాక్టివేషన్‌ను నిరోధించగలవు [47] మరియు అన్‌కప్లింగ్ ప్రోటీన్లు (UCP) లేదా అడెనైన్ న్యూక్లియోటైడ్ ట్రాన్స్‌లోకేస్ (ANT) వంటి కొన్ని ప్రోటీన్ల ద్వారా నియంత్రించబడిన లేదా ప్రేరేపించబడిన మైటోకాండ్రియల్ ATP ఉత్పత్తిని తగ్గించగలవు. కణ రకాన్ని బట్టి, ఈ దృగ్విషయం కణాలను అపోప్టోసిస్ నుండి రక్షించగలదు మరియు/లేదా అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహించగలదు [46]. అయితే, హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ నిష్క్రియం చేయడంలో మైటోకాన్డ్రియల్ అన్‌కప్లర్‌గా IPA పాత్రను స్పష్టం చేయడానికి మరిన్ని అధ్యయనాలు అవసరం.
జీవించి ఉన్న LX-2 కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసక్రియలోని మార్పులు మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపంలో ప్రతిబింబిస్తాయో లేదో మేము తరువాత పరిశోధించాము. ఆసక్తికరంగా, TGF-β1 చికిత్స మైటోకాన్డ్రియల్ నిష్పత్తిని గోళాకార నుండి మధ్యస్థ ఆకారానికి మారుస్తుంది, మైటోకాన్డ్రియల్ శాఖలు తగ్గడం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తిలో కీలకమైన కారకం అయిన DRP1 యొక్క వ్యక్తీకరణ పెరగడం [48]. ఇంకా, మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిన్నం మొత్తం నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది, మరియు సంలీనం నుండి విచ్ఛిత్తికి మారడం హెమటోపోయిటిక్ మూల కణం (HSC) క్రియాశీలతకు కీలకం, అయితే మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తిని నిరోధించడం HSC అపోప్టోసిస్‌కు దారితీస్తుంది [49]. అందువల్ల, మా ఫలితాలు TGF-β1 చికిత్స మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతలో తగ్గుదలను ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, ఇది క్రియాశీల హెమటోపోయిటిక్ మూల కణాలతో (HSCలు) సంబంధం ఉన్న మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తిలో సర్వసాధారణం. ఇంకా, మా డేటా IPA మైటోకాన్డ్రియా నిష్పత్తిని గోళాకార నుండి మధ్యస్థ ఆకారానికి మార్చగలదని, తద్వారా OPA1 మరియు MFN2 వ్యక్తీకరణను తగ్గిస్తుందని చూపించింది. OPA1 యొక్క డౌన్‌రెగ్యులేషన్ మైటోకాన్డ్రియల్ పొర సామర్థ్యంలో తగ్గుదలకు కారణమవుతుందని మరియు కణ అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి [50]. MFN2 మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ మరియు అపోప్టోసిస్ మధ్యవర్తిత్వం వహిస్తుందని తెలుసు[51]. పొందిన ఫలితాలు TGF-β1 మరియు/లేదా IPA ద్వారా LX-2 కణాల ప్రేరణ మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకారం మరియు పరిమాణాన్ని, అలాగే క్రియాశీలత స్థితి మరియు నెట్‌వర్క్ సంక్లిష్టతను మాడ్యులేట్ చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నదేమిటంటే, TGFβ-1 మరియు IPA ల కలయిక చికిత్స, అపోప్టోసిస్‌ను తప్పించుకునే కణాలలో ఫైబ్రోసిస్, అపోప్టోసిస్ మరియు మనుగడకు సంబంధించిన జన్యువుల mRNA వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడం ద్వారా mtDNA మరియు కణ స్వరూప పారామితులను తగ్గించగలదు. నిజానికి, IPA, AKT1 మరియు COL1A2 మరియు MMP2 వంటి ముఖ్యమైన ఫైబ్రోసిస్ జన్యువుల mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిని తగ్గించింది, కానీ అపోప్టోసిస్‌తో సంబంధం ఉన్న CASP8 వ్యక్తీకరణ స్థాయిని పెంచింది. మా ఫలితాలు చూపినదేమిటంటే, IPA చికిత్స తర్వాత, BAX వ్యక్తీకరణ తగ్గింది మరియు TIMP1 కుటుంబ ఉపవిభాగాలు, BCL-2 మరియు NF-κB ల mRNA వ్యక్తీకరణ పెరిగింది, ఇది అపోప్టోసిస్‌ను తప్పించుకునే హెమటోపోయిటిక్ మూల కణాలలో (HSCs) IPA మనుగడ సంకేతాలను ప్రేరేపించగలదని సూచిస్తుంది. ఈ అణువులు ఉత్తేజిత హెమటోపోయిటిక్ మూల కణాలలో మనుగడకు అనుకూలమైన సంకేతాలుగా పనిచేయవచ్చు, ఇది అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధించే ప్రోటీన్ల (Bcl-2 వంటివి) వ్యక్తీకరణ పెరుగుదల, అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించే BAX వ్యక్తీకరణ తగ్గుదల, మరియు TIMP మరియు NF-κB ల మధ్య సంక్లిష్టమైన పరస్పర చర్యతో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు [5, 7]. IPA దాని ప్రభావాలను PXR ద్వారా చూపుతుంది, మరియు TGF-β1 మరియు IPA లతో కలిపి చేసే చికిత్స PXR mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను పెంచిందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది HSC క్రియాశీలతను అణిచివేస్తుందని సూచిస్తుంది. క్రియాశీలక PXR సిగ్నలింగ్ ఇన్ వివో మరియు ఇన్ విట్రో రెండింటిలోనూ HSC క్రియాశీలతను నిరోధిస్తుందని తెలుసు [52, 53]. మా ఫలితాలు IPA అపోప్టోసిస్‌ను ప్రోత్సహించడం, ఫైబ్రోసిస్ మరియు మైటోకాండ్రియల్ జీవక్రియను తగ్గించడం, మరియు మనుగడ సంకేతాలను మెరుగుపరచడం ద్వారా క్రియాశీలక HSCల తొలగింపులో పాల్గొనవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, ఇవి క్రియాశీలక HSC ఫినోటైప్‌ను నిష్క్రియాత్మకమైనదిగా మార్చే సాధారణ ప్రక్రియలు. అపోప్టోసిస్‌లో IPA యొక్క సంభావ్య యంత్రాంగం మరియు పాత్రకు మరొక వివరణ ఏమిటంటే, ఇది ప్రాథమికంగా మైటోఫేజీ (అంతర్గత మార్గం) మరియు బాహ్య TNF సిగ్నలింగ్ మార్గం (పట్టిక 1) ద్వారా పనిచేయని మైటోకాండ్రియాను తొలగిస్తుంది, ఇది నేరుగా NF-κB మనుగడ సిగ్నలింగ్ మార్గానికి (అనుబంధ చిత్రం 7) అనుసంధానించబడి ఉంటుంది. ఆసక్తికరంగా, IPA-సంబంధిత సుసంపన్నమైన జన్యువులు అపోప్టోటిక్ మార్గంలో ప్రో-అపోప్టోటిక్ మరియు ప్రో-సర్వైవల్ సంకేతాలను ప్రేరేపించగలవు [54], ఇది IPA ఈ జన్యువులతో సంకర్షణ చెందడం ద్వారా అపోప్టోటిక్ మార్గాన్ని లేదా మనుగడను ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తుంది. అయితే, HSC క్రియాశీలత సమయంలో IPA అపోప్టోసిస్ లేదా మనుగడను ఎలా ప్రేరేపిస్తుంది మరియు దాని యాంత్రిక మార్గాలు అస్పష్టంగానే ఉన్నాయి.
IPA అనేది గట్ మైక్రోబయోటా ద్వారా ఆహారంలోని ట్రిప్టోఫాన్ నుండి ఏర్పడిన ఒక మైక్రోబియల్ మెటబొలైట్. పేగు వాతావరణంలో దీనికి యాంటీ-ఇన్‌ఫ్లమేటరీ, యాంటీఆక్సిడెంట్ మరియు ఎపిజెనెటిక్ రెగ్యులేటరీ లక్షణాలు ఉన్నాయని అధ్యయనాలు చూపించాయి.[55] IPA పేగు అవరోధ పనితీరును మాడ్యులేట్ చేయగలదని మరియు ఆక్సీకరణ ఒత్తిడిని తగ్గించగలదని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది దాని స్థానిక శారీరక ప్రభావాలకు దోహదపడవచ్చు.[56] వాస్తవానికి, IPA ప్రసరణ ద్వారా లక్ష్య అవయవాలకు రవాణా చేయబడుతుంది, మరియు IPA ట్రిప్టోఫాన్, సెరోటోనిన్ మరియు ఇండోల్ ఉత్పన్నాలతో సమానమైన ప్రధాన మెటబొలైట్ నిర్మాణాన్ని పంచుకుంటుంది కాబట్టి, IPA పోటీ జీవక్రియ గమ్యాలకు దారితీసే జీవక్రియ చర్యలను ప్రదర్శిస్తుంది.[52] IPA ఎంజైమ్‌లు లేదా రిసెప్టర్‌లపై బైండింగ్ సైట్‌ల కోసం ట్రిప్టోఫాన్-ఉత్పన్న మెటబొలైట్‌లతో పోటీ పడవచ్చు, ఇది సాధారణ జీవక్రియ మార్గాలను దెబ్బతీసే అవకాశం ఉంది. దాని చికిత్సా పరిధిని బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి దాని ఫార్మకోకైనటిక్స్ మరియు ఫార్మకోడైనమిక్స్‌పై మరిన్ని అధ్యయనాల అవసరాన్ని ఇది నొక్కి చెబుతుంది.[57] ఇది హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCs)లో కూడా సంభవిస్తుందో లేదో చూడాల్సి ఉంది.
మా అధ్యయనంలో కొన్ని పరిమితులు ఉన్నాయని మేము అంగీకరిస్తున్నాము. IPAకి సంబంధించిన అనుబంధాలను ప్రత్యేకంగా పరిశీలించడానికి, మేము టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ (T2DM) ఉన్న రోగులను మినహాయించాము. ఇది టైప్ 2 డయాబెటిస్ మెల్లిటస్ మరియు తీవ్రమైన కాలేయ వ్యాధి ఉన్న రోగులకు మా పరిశోధన ఫలితాల విస్తృత అనువర్తనాన్ని పరిమితం చేస్తుందని మేము అంగీకరిస్తున్నాము. మానవ సీరమ్‌లో IPA యొక్క శారీరక సాంద్రత 1–10 μM [11, 20] అయినప్పటికీ, అత్యధిక విషరహిత సాంద్రత [15] మరియు అత్యధిక అపోప్టోసిస్ రేటు ఆధారంగా 1 mM IPA సాంద్రతను ఎంచుకోవడం జరిగింది, నెక్రోటిక్ కణాల జనాభా శాతంలో ఎటువంటి తేడా లేదు. ఈ అధ్యయనంలో IPA యొక్క సుప్రాఫిజియోలాజికల్ స్థాయిలను ఉపయోగించినప్పటికీ, IPA యొక్క ప్రభావవంతమైన మోతాదుకు సంబంధించి ప్రస్తుతం ఏకాభిప్రాయం లేదు [52]. మా ఫలితాలు ముఖ్యమైనవి అయినప్పటికీ, IPA యొక్క విస్తృత జీవక్రియ గమ్యం ఒక క్రియాశీల పరిశోధనా రంగంగా మిగిలి ఉంది. అంతేకాకుండా, సీరమ్ IPA స్థాయిలు మరియు కాలేయ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల DNA మిథైలేషన్ మధ్య అనుబంధంపై మా పరిశోధన ఫలితాలు హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్స్ (HSCs) నుండి మాత్రమే కాకుండా కాలేయ కణజాలాల నుండి కూడా పొందబడ్డాయి. ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ విశ్లేషణ నుండి మా మునుపటి పరిశోధనల ఆధారంగా మేము మానవ LX-2 కణాలను ఉపయోగించాలని ఎంచుకున్నాము, IPA హెమటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (HSC) యాక్టివేషన్‌తో సంబంధం కలిగి ఉందని [15], మరియు HSCలు కాలేయ ఫైబ్రోసిస్ పురోగతిలో పాల్గొన్న ప్రధాన కణాలు. కాలేయం బహుళ కణ రకాలతో కూడి ఉంటుంది, కాబట్టి IPA పాత్రను మరియు ఇతర కాలేయ కణ రకాలతో దాని పరస్పర చర్యను అధ్యయనం చేయడానికి కాస్పేస్ యాక్టివేషన్ మరియు DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌తో కలిపి హెపటోసైట్-HSC-ఇమ్యూన్ సెల్ కో-కల్చర్ సిస్టమ్ వంటి ఇతర కణ నమూనాలను అలాగే ప్రోటీన్ స్థాయితో సహా చర్య యొక్క విధానాన్ని పరిగణించాలి.