ఈ వ్యాసం "వ్యాధికారకాలు మరియు తెగుళ్ళకు చిక్కుళ్ళు నిరోధకతను మెరుగుపరచడం" అనే పరిశోధన అంశంలో భాగం, మొత్తం 5 వ్యాసాలను వీక్షించండి.
శిలీంధ్ర మొక్కల వ్యాధి నెక్రోసిస్‌కు కారణమయ్యే కారకం స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం (లిబ.) డి బారీ వివిధ హోస్ట్ మొక్కలకు సోకడానికి బహుళ-స్థాయి వ్యూహాన్ని ఉపయోగిస్తుంది. ఈ అధ్యయనం సూడోమోనాస్ స్క్లెరోటియోరం వల్ల కలిగే తెల్ల అచ్చుకు ఫాసియోలస్ వల్గారిస్ L. యొక్క పరమాణు, శారీరక మరియు జీవరసాయన ప్రతిస్పందనలను మెరుగుపరచడానికి ప్రత్యామ్నాయ నిర్వహణ వ్యూహంగా, ఇతర ముఖ్యమైన అమైనో ఆమ్లాల సంశ్లేషణను ప్రేరేపించే నాన్-ప్రోటీన్ అమైనో ఆమ్లం డైమైన్ L-ఆర్నిథైన్‌ను ఉపయోగించాలని ప్రతిపాదిస్తుంది. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలు L-ఆర్నిథైన్ మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో S. పైరెనోయిడోసా యొక్క మైసిలియల్ పెరుగుదలను గణనీయంగా నిరోధించిందని చూపించాయి. అంతేకాకుండా, ఇది గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో తెల్ల అచ్చు యొక్క తీవ్రతను గణనీయంగా తగ్గించగలదు. ఇంకా, L-ఆర్నిథైన్ చికిత్స చేయబడిన మొక్కల పెరుగుదలను ప్రేరేపించింది, L-ఆర్నిథైన్ యొక్క పరీక్షించిన సాంద్రతలు చికిత్స చేయబడిన మొక్కలకు ఫైటోటాక్సిక్ కాదని సూచిస్తుంది. అదనంగా, L-ఆర్నిథైన్ నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు (మొత్తం కరిగే ఫినోలిక్స్ మరియు ఫ్లేవనాయిడ్లు) మరియు ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు (క్యాటలేస్ (CAT), పెరాక్సిడేస్ (POX), మరియు పాలీఫెనాల్ ఆక్సిడేస్ (PPO)) యొక్క వ్యక్తీకరణను పెంచింది మరియు మూడు యాంటీఆక్సిడెంట్-సంబంధిత జన్యువుల (PvCAT1, PvSOD, మరియు PvGR) యొక్క వ్యక్తీకరణను పెంచింది. ఇంకా, సిలికో విశ్లేషణలో S. స్క్లెరోటియోరమ్ జన్యువులో పుటేటివ్ ఆక్సాలోఅసిటేట్ ఎసిటైల్హైడ్రోలేస్ (SsOAH) ప్రోటీన్ ఉనికిని వెల్లడించింది, ఇది క్రియాత్మక విశ్లేషణ, సంరక్షించబడిన డొమైన్‌లు మరియు టోపోలాజీ పరంగా ఆస్పెర్‌గిల్లస్ ఫిజియెన్సిస్ (AfOAH) మరియు పెన్సిలియం sp. (PlOAH) యొక్క ఆక్సాలోఅసిటేట్ ఎసిటైల్హైడ్రోలేస్ (SsOAH) ప్రోటీన్‌లకు చాలా పోలి ఉంటుంది. ఆసక్తికరంగా, బంగాళాదుంప డెక్స్ట్రోస్ రసం (PDB) మాధ్యమానికి L-ఆర్నిథైన్ జోడించడం వలన S. స్క్లెరోటియోరమ్ మైసిలియాలో SsOAH జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది. అదేవిధంగా, L-ఆర్నిథైన్ యొక్క బాహ్య అప్లికేషన్ చికిత్స చేయబడిన మొక్కల నుండి సేకరించిన ఫంగల్ మైసిలియాలో SsOAH జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా తగ్గించింది. చివరగా, L-ఆర్నిథైన్ అప్లికేషన్ PDB మీడియం మరియు ఇన్ఫెక్షన్ ఉన్న ఆకులు రెండింటిలోనూ ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల స్రావాన్ని గణనీయంగా తగ్గించింది. ముగింపులో, L-ఆర్నిథైన్ రెడాక్స్ స్థితిని నిర్వహించడంలో అలాగే ఇన్ఫెక్షన్ ఉన్న మొక్కల రక్షణ ప్రతిస్పందనను పెంచడంలో కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది. ఈ అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలు తెల్లటి బూజును నియంత్రించడానికి మరియు బీన్ ఉత్పత్తి మరియు ఇతర పంటలపై దాని ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వినూత్నమైన, పర్యావరణ అనుకూల పద్ధతులను అభివృద్ధి చేయడంలో సహాయపడతాయి.
నెక్రోట్రోఫిక్ ఫంగస్ స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం (లిబ్.) డి బారీ వల్ల కలిగే తెల్లటి బూజు, ఇది వినాశకరమైన, దిగుబడిని తగ్గించే వ్యాధి, ఇది ప్రపంచ బీన్ (ఫాసియోలస్ వల్గారిస్ ఎల్.) ఉత్పత్తికి తీవ్రమైన ముప్పును కలిగిస్తుంది (బోల్టన్ మరియు ఇతరులు, 2006). స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం అనేది నేల ద్వారా వ్యాపించే శిలీంధ్ర మొక్కల వ్యాధికారకాలను నియంత్రించడానికి అత్యంత కష్టతరమైన వాటిలో ఒకటి, 600 కంటే ఎక్కువ వృక్ష జాతుల విస్తృత హోస్ట్ శ్రేణి మరియు నిర్దిష్ట-కాని పద్ధతిలో హోస్ట్ కణజాలాలను వేగంగా మెసెరేట్ చేయగల సామర్థ్యం కలిగి ఉంటుంది (లియాంగ్ మరియు రోలిన్స్, 2018). అననుకూల పరిస్థితులలో, ఇది దాని జీవిత చక్రంలో ఒక క్లిష్టమైన దశకు లోనవుతుంది, నేలలో 'స్క్లెరోటియా' అని పిలువబడే నలుపు, గట్టి, విత్తనం లాంటి నిర్మాణాలుగా లేదా సోకిన మొక్కల మైసిలియం లేదా కాండం పిత్‌లో తెల్లటి, మెత్తటి పెరుగుదలలుగా చాలా కాలం పాటు నిద్రాణంగా ఉంటుంది (స్క్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). S. స్క్లెరోటియోరం స్క్లెరోటియాను ఏర్పరచగలదు, ఇది సోకిన పొలాలలో ఎక్కువ కాలం జీవించడానికి మరియు వ్యాధి సమయంలో కొనసాగడానికి వీలు కల్పిస్తుంది (స్క్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). స్క్లెరోటియా పోషకాలతో సమృద్ధిగా ఉంటుంది, మట్టిలో ఎక్కువ కాలం పాటు ఉంటుంది మరియు తదుపరి ఇన్ఫెక్షన్లకు ప్రాథమిక ఐనోక్యులమ్‌గా పనిచేస్తుంది (స్క్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). అనుకూలమైన పరిస్థితులలో, స్క్లెరోటియా మొలకెత్తుతుంది మరియు గాలిలో వ్యాపించే బీజాంశాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది, ఇవి పువ్వులు, కాండం లేదా కాయలతో సహా మొక్క యొక్క అన్ని నేల భాగాలకు సోకుతాయి (స్క్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005).
స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం దాని హోస్ట్ మొక్కలను సోకడానికి బహుళ-స్థాయి వ్యూహాన్ని ఉపయోగిస్తుంది, ఇందులో స్క్లెరోటియల్ అంకురోత్పత్తి నుండి లక్షణాల అభివృద్ధి వరకు సమన్వయ సంఘటనల శ్రేణి ఉంటుంది. ప్రారంభంలో, S. స్క్లెరోటియోరం అపోథెసియా అని పిలువబడే పుట్టగొడుగు లాంటి నిర్మాణాల నుండి సస్పెండ్ చేయబడిన బీజాంశాలను (అస్కోస్పోర్స్ అని పిలుస్తారు) ఉత్పత్తి చేస్తుంది, ఇవి గాలిలో ఎగిరిపోయి సోకిన మొక్కల శిధిలాలపై నాన్-మోటైల్ స్క్లెరోటియాగా అభివృద్ధి చెందుతాయి (బోల్టన్ మరియు ఇతరులు, 2006). అప్పుడు ఫంగస్ ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని స్రవిస్తుంది, ఇది వైరలెన్స్ కారకం, ఇది మొక్క కణ గోడ pH ని నియంత్రించడానికి, ఎంజైమాటిక్ క్షీణత మరియు కణజాల దాడిని ప్రోత్సహించడానికి (హెగెడస్ మరియు రిమ్మర్, 2005), మరియు హోస్ట్ మొక్క యొక్క ఆక్సీకరణ విస్ఫోటనాన్ని అణిచివేస్తుంది. ఈ ఆమ్లీకరణ ప్రక్రియ మొక్క కణ గోడను బలహీనపరుస్తుంది, శిలీంధ్ర కణ గోడ క్షీణత ఎంజైమ్‌ల (CWDEs) సాధారణ మరియు సమర్థవంతమైన ఆపరేషన్‌కు అనుకూలమైన వాతావరణాన్ని అందిస్తుంది, వ్యాధికారక భౌతిక అవరోధాన్ని అధిగమించి హోస్ట్ కణజాలాలలోకి చొచ్చుకుపోయేలా చేస్తుంది (మార్సియానో ​​మరియు ఇతరులు, 1983). ఒకసారి చొచ్చుకుపోయిన తర్వాత, S. స్క్లెరోటియోరం పాలిగాలాక్టురోనేస్ మరియు సెల్యులేస్ వంటి అనేక CWDE లను స్రవిస్తుంది, ఇవి సోకిన కణజాలాలలో దాని వ్యాప్తిని సులభతరం చేస్తాయి మరియు కణజాల నెక్రోసిస్‌కు కారణమవుతాయి. గాయాలు మరియు హైఫల్ మ్యాట్‌ల పురోగతి తెల్లటి అచ్చు యొక్క లక్షణ లక్షణాలకు దారితీస్తుంది (హెగెడస్ మరియు రిమ్మర్, 2005). ఇంతలో, హోస్ట్ మొక్కలు నమూనా గుర్తింపు గ్రాహకాల (PRRs) ద్వారా వ్యాధికారక-సంబంధిత పరమాణు నమూనాలను (PAMPs) గుర్తిస్తాయి, చివరికి రక్షణ ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేసే సిగ్నలింగ్ సంఘటనల శ్రేణిని ప్రేరేపిస్తాయి.
దశాబ్దాలుగా వ్యాధి నియంత్రణ ప్రయత్నాలు చేసినప్పటికీ, వ్యాధికారక నిరోధకత, మనుగడ మరియు అనుకూలత కారణంగా, ఇతర వాణిజ్య పంటలలో వలె, బీన్‌లో తగినంత నిరోధక జెర్మ్‌ప్లాజమ్ కొరత ఉంది. అందువల్ల వ్యాధి నిర్వహణ చాలా సవాలుతో కూడుకున్నది మరియు సాంస్కృతిక పద్ధతులు, జీవ నియంత్రణ మరియు రసాయన శిలీంద్రనాశకాల కలయికతో కూడిన సమగ్ర, బహుముఖ వ్యూహం అవసరం (ఓ'సుల్లివన్ మరియు ఇతరులు, 2021). తెల్లటి బూజు యొక్క రసాయన నియంత్రణ అత్యంత ప్రభావవంతమైనది ఎందుకంటే శిలీంద్రనాశకాలు, సరిగ్గా మరియు సరైన సమయంలో ప్రయోగించినప్పుడు, వ్యాధి వ్యాప్తిని సమర్థవంతంగా నియంత్రించగలవు, సంక్రమణ తీవ్రతను తగ్గించగలవు మరియు దిగుబడి నష్టాలను తగ్గించగలవు. అయితే, శిలీంద్రనాశకాలపై అధిక వినియోగం మరియు అతిగా ఆధారపడటం వలన S. స్క్లెరోటియోరం యొక్క నిరోధక జాతులు ఆవిర్భవించవచ్చు మరియు లక్ష్యం కాని జీవులు, నేల ఆరోగ్యం మరియు నీటి నాణ్యతను ప్రతికూలంగా ప్రభావితం చేయవచ్చు (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). అందువల్ల, పర్యావరణ అనుకూల ప్రత్యామ్నాయాలను కనుగొనడం అత్యంత ప్రాధాన్యతగా మారింది.
పుట్రెస్సిన్, స్పెర్మిడిన్, స్పెర్మిన్ మరియు కాడవెరిన్ వంటి పాలిమైన్‌లు (PAలు) నేల ద్వారా వ్యాపించే మొక్కల వ్యాధికారకాలకు వ్యతిరేకంగా ఆశాజనకమైన ప్రత్యామ్నాయాలుగా పనిచేస్తాయి, తద్వారా ప్రమాదకర రసాయన శిలీంద్రనాశకాల వాడకాన్ని పూర్తిగా లేదా పాక్షికంగా తగ్గిస్తాయి (నెహెలా మరియు ఇతరులు, 2024; యి మరియు ఇతరులు, 2024). అధిక ఎత్తులో ఉన్న మొక్కలలో, PAలు కణ విభజన, భేదం మరియు అబియోటిక్ మరియు బయోటిక్ ఒత్తిళ్లకు ప్రతిస్పందనతో సహా అనేక శారీరక ప్రక్రియలలో పాల్గొంటాయి (కిల్లినీ మరియు నెహెలా, 2020). అవి యాంటీఆక్సిడెంట్లుగా పనిచేస్తాయి, రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతులను (ROS) తొలగించడంలో సహాయపడతాయి, రెడాక్స్ హోమియోస్టాసిస్‌ను నిర్వహిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లినీ, 2023), రక్షణ సంబంధిత జన్యువులను ప్రేరేపించగలవు (రొమెరో మరియు ఇతరులు, 2018), వివిధ జీవక్రియ మార్గాలను నియంత్రిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లినీ, 2023), ఎండోజెనస్ ఫైటోహార్మోన్‌లను మాడ్యులేట్ చేస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లినీ, 2019), దైహిక ఆర్జిత నిరోధకతను (SAR) స్థాపించాయి మరియు మొక్క-వ్యాధికారక పరస్పర చర్యలను నియంత్రిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లినీ, 2020; అసిజా మరియు ఇతరులు, 2022; సెర్వోనిక్, 2022). మొక్కల రక్షణలో PAల యొక్క నిర్దిష్ట విధానాలు మరియు పాత్రలు మొక్కల జాతులు, వ్యాధికారకాలు మరియు పర్యావరణ పరిస్థితులను బట్టి మారుతూ ఉంటాయని గమనించాలి. మొక్కలలో అత్యంత సమృద్ధిగా ఉండే PA అనేది ముఖ్యమైన పాలిమైన్ L-ఆర్నిథైన్ (కిల్లినీ మరియు నెహెలా, 2020) నుండి బయోసింథసైజ్ చేయబడింది.
మొక్కల పెరుగుదల మరియు అభివృద్ధిలో L-ఆర్నిథైన్ బహుళ పాత్రలు పోషిస్తుంది. ఉదాహరణకు, వరిలో (Oryza sativa), ఆర్నిథైన్ నత్రజని రీసైక్లింగ్ (Lu et al., 2018), వరి దిగుబడి, నాణ్యత మరియు సువాసన (Lu et al., 2020), మరియు నీటి ఒత్తిడి ప్రతిస్పందన (Yang et al., 2000) తో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి. ఇంకా, L-ఆర్నిథైన్ యొక్క బాహ్య ఉపయోగం చక్కెర దుంపలలో (బీటా వల్గారిస్) (హుస్సేన్ et al., 2019) కరువును తట్టుకునే సామర్థ్యాన్ని గణనీయంగా పెంచింది మరియు ఉల్లిపాయ (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu మరియు Çavuşoǧlu, 2021) మరియు జీడిపప్పు (Anacardium occidentale) మొక్కలలో (da Rocha et al., 2012) ఉప్పు ఒత్తిడిని తగ్గించింది. అబియోటిక్ ఒత్తిడి రక్షణలో L-ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య పాత్ర చికిత్స చేయబడిన మొక్కలలో ప్రోలిన్ చేరడంలో దాని ప్రమేయం వల్ల కావచ్చు. ఉదాహరణకు, ఆర్నిథైన్ డెల్టా అమినోట్రాన్స్‌ఫేరేస్ (డెల్టా-OAT) మరియు ప్రోలిన్ డీహైడ్రోజినేస్ (ProDH1 మరియు ProDH2) జన్యువులు వంటి ప్రోలిన్ జీవక్రియకు సంబంధించిన జన్యువులు, నికోటియానా బెంథామియానా మరియు అరబిడోప్సిస్ థాలియానాలను నాన్-హోస్ట్ సూడోమోనాస్ సిరింగే జాతులకు వ్యతిరేకంగా రక్షించడంలో పాల్గొన్నట్లు గతంలో నివేదించబడింది (సెంథిల్-కుమార్ మరియు మైసూర్, 2012). మరోవైపు, వ్యాధికారక పెరుగుదలకు ఫంగల్ ఆర్నిథైన్ డెకార్బాక్సిలేస్ (ODC) అవసరం (సింగ్ మరియు ఇతరులు, 2020). హోస్ట్-ప్రేరిత జన్యు నిశ్శబ్దం (HIGS) ద్వారా ఫ్యూసేరియం ఆక్సిస్పోరం f. sp. లైకోపెర్సిసి యొక్క ODCని లక్ష్యంగా చేసుకోవడం ఫ్యూసేరియం విల్ట్‌కు టమోటా మొక్కల నిరోధకతను గణనీయంగా పెంచింది (సింగ్ మరియు ఇతరులు, 2020). అయితే, ఫైటోపాథోజెన్‌ల వంటి బయోటిక్ ఒత్తిళ్లకు వ్యతిరేకంగా బాహ్య ఆర్నిథైన్ అప్లికేషన్ యొక్క సంభావ్య పాత్ర బాగా అధ్యయనం చేయబడలేదు. మరీ ముఖ్యంగా, వ్యాధి నిరోధకతపై ఆర్నిథైన్ ప్రభావాలు మరియు సంబంధిత జీవరసాయన మరియు శారీరక దృగ్విషయాలు ఎక్కువగా అన్వేషించబడలేదు.
ప్రభావవంతమైన నియంత్రణ వ్యూహాల అభివృద్ధికి చిక్కుళ్ళు యొక్క S. స్క్లెరోటియోరమ్ సంక్రమణ సంక్లిష్టతను అర్థం చేసుకోవడం చాలా ముఖ్యం. ఈ అధ్యయనంలో, స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ సంక్రమణకు పప్పుదినుసు మొక్కల రక్షణ విధానాలను మరియు నిరోధకతను పెంచడంలో కీలకమైన అంశంగా డైమైన్ L-ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య పాత్రను గుర్తించడం మేము లక్ష్యంగా పెట్టుకున్నాము. సోకిన మొక్కల రక్షణ ప్రతిస్పందనలను పెంచడంతో పాటు, రెడాక్స్ స్థితిని నిర్వహించడంలో L-ఆర్నిథైన్ కూడా కీలక పాత్ర పోషిస్తుందని మేము పరికల్పన చేస్తున్నాము. L-ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య ప్రభావాలు ఎంజైమాటిక్ మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్ రక్షణ విధానాల నియంత్రణ మరియు శిలీంధ్ర వ్యాధికారకత/వైరలెన్స్ కారకాలు మరియు అనుబంధ ప్రోటీన్లతో జోక్యం చేసుకోవడంతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము. L-ఆర్నిథైన్ యొక్క ఈ ద్వంద్వ కార్యాచరణ తెల్ల అచ్చు ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి మరియు ఈ శక్తివంతమైన శిలీంధ్ర వ్యాధికారకానికి సాధారణ పప్పుదినుసు పంటల నిరోధకతను పెంచడానికి స్థిరమైన వ్యూహానికి ఇది ఒక ఆశాజనక అభ్యర్థిగా చేస్తుంది. ప్రస్తుత అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలు తెల్ల అచ్చును నియంత్రించడానికి మరియు పప్పుదినుసు ఉత్పత్తిపై దాని ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వినూత్నమైన, పర్యావరణ అనుకూల పద్ధతుల అభివృద్ధిలో సహాయపడతాయి.
ఈ అధ్యయనంలో, గిజా 3 (ఫాసియోలస్ వల్గారిస్ ఎల్. సివి. గిజా 3) అనే వాణిజ్య రకం సాధారణ బీన్‌ను ప్రయోగాత్మక పదార్థంగా ఉపయోగించారు. ఈజిప్టులోని లెగ్యూమ్ రీసెర్చ్ డిపార్ట్‌మెంట్, ఫీల్డ్ క్రాప్స్ రీసెర్చ్ ఇన్‌స్టిట్యూట్ (FCRI), అగ్రికల్చరల్ రీసెర్చ్ సెంటర్ (ARC) ఆరోగ్యకరమైన విత్తనాలను దయతో అందించాయి. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో (25 ± 2 °C, సాపేక్ష ఆర్ద్రత 75 ± 1%, 8 గం కాంతి/16 గం చీకటి) S. స్క్లెరోటియోరం-సోకిన మట్టితో నింపిన ప్లాస్టిక్ కుండలలో (లోపలి వ్యాసం 35 సెం.మీ., లోతు 50 సెం.మీ.) ఐదు విత్తనాలను నాటారు. విత్తిన 7-10 రోజుల తర్వాత (DPS), ప్రతి కుండలో ఏకరీతి పెరుగుదల మరియు మూడు పూర్తిగా విస్తరించిన ఆకులు కలిగిన రెండు మొలకలని మాత్రమే వదిలివేసేలా మొలకలని పలుచగా చేశారు. అన్ని కుండీలలో ఉంచిన మొక్కలకు ప్రతి రెండు వారాలకు ఒకసారి నీరు పోసి, ఇచ్చిన రకానికి సిఫార్సు చేసిన రేటు ప్రకారం నెలవారీగా ఎరువులు వేశారు.
500 mg/L గాఢత కలిగిన L-ornithinediamine (దీనిని (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany అని కూడా పిలుస్తారు) ను తయారు చేయడానికి, 50 mg ని మొదట 100 mL స్టెరైల్ డిస్టిల్డ్ వాటర్‌లో కరిగించారు. తరువాత స్టాక్ ద్రావణాన్ని కరిగించి తదుపరి ప్రయోగాలలో ఉపయోగించారు. క్లుప్తంగా, ఆరు సిరీస్ L-ornithine సాంద్రతలు (12.5, 25, 50, 75, 100, మరియు 125 mg/L) ఇన్ విట్రోలో పరీక్షించబడ్డాయి. అదనంగా, స్టెరైల్ డిస్టిల్డ్ వాటర్‌ను ప్రతికూల నియంత్రణ (మోక్)గా మరియు వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి "రిజోలెక్స్-టి" 50% వెటబుల్ పౌడర్ (టోక్లోఫోస్-మిథైల్ 20% + థిరామ్ 30%; KZ-Kafr El Zayat పెస్టిసైడ్స్ అండ్ కెమికల్స్ కంపెనీ, కాఫ్ర్ ఎల్ Zayat, ఘర్బియా గవర్నరేట్, ఈజిప్ట్)గా సానుకూల నియంత్రణగా ఉపయోగించారు. వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి "రిజోలెక్స్-టి"ని ఐదు సాంద్రతలలో (2, 4, 6, 8 మరియు 10 mg/L) విట్రోలో పరీక్షించారు.
తెల్లటి బూజు (ముట్టడి రేటు: 10–30%) యొక్క సాధారణ లక్షణాలను చూపించే సాధారణ చిక్కుడు కాండాలు మరియు కాయల నమూనాలను వాణిజ్య పొలాల నుండి సేకరించారు. చాలా వరకు సోకిన మొక్కల పదార్థాలను జాతులు/రకాలు (గిజా 3కి గురయ్యే వాణిజ్య రకం) ద్వారా గుర్తించినప్పటికీ, ఇతరమైనవి, ముఖ్యంగా స్థానిక మార్కెట్ల నుండి పొందినవి, తెలియని జాతులకు చెందినవి. సేకరించిన సోకిన పదార్థాలను మొదట 0.5% సోడియం హైపోక్లోరైట్ ద్రావణంతో 3 నిమిషాలు ఉపరితల క్రిమిరహితం చేసి, తరువాత శుభ్రమైన స్వేదనజలంతో చాలాసార్లు కడిగి, అదనపు నీటిని తొలగించడానికి శుభ్రమైన ఫిల్టర్ పేపర్‌తో పొడిగా తుడిచిపెట్టారు. అప్పుడు సోకిన అవయవాలను మధ్య కణజాలం నుండి చిన్న ముక్కలుగా కట్ చేసి, బంగాళాదుంప డెక్స్ట్రోస్ అగర్ (PDA) మాధ్యమంలో కల్చర్ చేసి, స్క్లెరోటియా ఏర్పడటాన్ని ప్రేరేపించడానికి 25 ± 2 °C వద్ద 12 గంటల కాంతి/12 గంటల చీకటి చక్రంతో 5 రోజుల పాటు పొదిగించారు. మిశ్రమ లేదా కలుషితమైన సంస్కృతుల నుండి శిలీంధ్ర ఐసోలేట్‌లను శుద్ధి చేయడానికి కూడా మైసిలియల్ టిప్ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. శుద్ధి చేయబడిన శిలీంధ్ర ఐసోలేట్‌ను మొదట దాని సాంస్కృతిక పదనిర్మాణ లక్షణాల ఆధారంగా గుర్తించారు మరియు తరువాత సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాల ఆధారంగా S. స్క్లెరోటియోరం అని నిర్ధారించారు. చివరగా, కోచ్ యొక్క ప్రతిపాదనలను తీర్చడానికి అన్ని శుద్ధి చేయబడిన ఐసోలేట్‌లను అనుమానాస్పద సాధారణ బీన్ సాగు గిజా 3 పై వ్యాధికారకత కోసం పరీక్షించారు.
అదనంగా, వైట్ మరియు ఇతరులు, 1990; బటురో-సిస్నివ్స్కా మరియు ఇతరులు, 2017 వివరించిన అంతర్గత ట్రాన్స్క్రిప్టెడ్ స్పేసర్ (ITS) సీక్వెన్సింగ్ ఆధారంగా అత్యంత ఇన్వాసివ్ S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ (ఐసోలేట్ #3) మరింత నిర్ధారించబడింది. క్లుప్తంగా, ఐసోలేట్‌లను బంగాళాదుంప డెక్స్ట్రోస్ రసం (PDB)లో కల్చర్ చేసి 25 ± 2 °C వద్ద 5–7 రోజులు పొదిగించారు. తరువాత ఫంగల్ మైసిలియంను సేకరించి, చీజ్‌క్లాత్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేసి, రెండుసార్లు స్టెరైల్ నీటితో కడిగి, స్టెరైల్ ఫిల్టర్ పేపర్‌తో ఎండబెట్టారు. క్విక్-DNA™ ఫంగల్/బాక్టీరియల్ మినీప్రెప్ కిట్ (కురామే-ఇజియోకా, 1997; అటల్లా మరియు ఇతరులు, 2022, 2024) ఉపయోగించి జెనోమిక్ DNA వేరుచేయబడింది. ITS rDNA ప్రాంతాన్ని నిర్దిష్ట ప్రైమర్ జత ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; అంచనా పరిమాణం: 540 bp) ఉపయోగించి విస్తరించారు (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). శుద్ధి చేయబడిన PCR ఉత్పత్తులను సీక్వెన్సింగ్ కోసం సమర్పించారు (బీజింగ్ అయోకే డింగ్‌షెంగ్ బయోటెక్నాలజీ కో., లిమిటెడ్). ITS rDNA సీక్వెన్స్‌లను సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి ద్వి దిశాత్మకంగా క్రమం చేశారు. అప్పుడు అసెంబుల్ చేయబడిన క్వెరీ సీక్వెన్స్‌లను BLASTn సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించి జెన్‌బ్యాంక్ మరియు నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)లోని తాజా డేటాతో పోల్చారు. మాలిక్యులర్ ఎవల్యూషనరీ జెనెటిక్స్ అనాలిసిస్ ప్యాకేజీ (MEGA-11; వెర్షన్ 11) (కుమార్ et al., 2024)లోని క్లస్టల్‌డబ్ల్యూ ఉపయోగించి NCBI జెన్‌బ్యాంక్ (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1)లోని తాజా డేటా నుండి తిరిగి పొందిన 20 ఇతర S. స్క్లెరోటియోరమ్ స్ట్రెయిన్‌లు/ఐసోలేట్‌లతో ప్రశ్న క్రమాన్ని పోల్చారు. గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతి మరియు సాధారణ సమయం-తిరిగి వెళ్ళే న్యూక్లియోటైడ్ ప్రత్యామ్నాయ నమూనా (Nei and Kumar, 2000) ఉపయోగించి పరిణామ విశ్లేషణ జరిగింది. అత్యధిక లాగ్-సంభావ్యత కలిగిన చెట్టు చూపబడింది. పొరుగు-చేరిన (NJ) చెట్టు (కుమార్ మరియు ఇతరులు, 2024) మరియు గరిష్ట పార్సిమోని (MP) చెట్టు మధ్య అధిక లాగ్-సంభావ్యత కలిగిన చెట్టును ఎంచుకోవడం ద్వారా హ్యూరిస్టిక్ శోధన కోసం ప్రారంభ చెట్టును ఎంపిక చేస్తారు. సాధారణ సమయం-తిరిగి వెళ్ళే నమూనా (Nei and Kumar, 2000) ఉపయోగించి లెక్కించిన జత వైపు దూర మాతృకను ఉపయోగించి NJ చెట్టును నిర్మించారు.
L-ఆర్నిథైన్ మరియు "రిజోలెక్స్-T" అనే బాక్టీరియా నాశిని యొక్క యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను అగర్ డిఫ్యూజన్ పద్ధతి ద్వారా ఇన్ విట్రోలో నిర్ణయించారు. విధానం: L-ఆర్నిథైన్ (500 mg/L) యొక్క స్టాక్ ద్రావణాన్ని తగిన మొత్తంలో తీసుకొని, దానిని 10 ml PDA పోషక మాధ్యమంతో పూర్తిగా కలిపి వరుసగా 12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 mg/L తుది సాంద్రతలతో ద్రావణాలను తయారు చేయండి. నియంత్రణగా "రిజోలెక్స్-T" (2, 4, 6, 8 మరియు 10 mg/L) శిలీంద్ర సంహారిణి యొక్క ఐదు సాంద్రతలు మరియు శుభ్రమైన స్వేదనజలం ఉపయోగించబడ్డాయి. మాధ్యమం ఘనీభవించిన తర్వాత, 4 మిమీ వ్యాసం కలిగిన స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం కల్చర్ యొక్క తాజాగా తయారు చేయబడిన మైసిలియల్ ప్లగ్‌ను పెట్రి డిష్ మధ్యలోకి బదిలీ చేసి, మైసిలియల్ మొత్తం కంట్రోల్ పెట్రి డిష్‌ను కప్పే వరకు 25±2°C వద్ద కల్చర్ చేశారు, ఆ తర్వాత శిలీంధ్ర పెరుగుదల నమోదు చేయబడింది. సమీకరణం 1 ఉపయోగించి S. స్క్లెరోటియోరం యొక్క రేడియల్ పెరుగుదల నిరోధ శాతాన్ని లెక్కించండి:
ఈ ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది, ప్రతి నియంత్రణ/ప్రయోగాత్మక సమూహానికి ఆరు జీవ ప్రతిరూపాలు మరియు ప్రతి జీవ ప్రతిరూపానికి ఐదు కుండలు (కుండకు రెండు మొక్కలు). ప్రయోగాత్మక ఫలితాల ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని నిర్ధారించడానికి ప్రతి జీవ ప్రతిరూపాన్ని రెండుసార్లు (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు) విశ్లేషించారు. అదనంగా, సగం-గరిష్ట నిరోధక సాంద్రత (IC50) మరియు IC99 (ప్రెంటిస్, 1976) లను లెక్కించడానికి ప్రోబిట్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది.
గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో L-ఆర్నిథైన్ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, వరుసగా రెండు కుండ ప్రయోగాలు జరిగాయి. క్లుప్తంగా, కుండలను క్రిమిరహితం చేసిన బంకమట్టి-ఇసుక మట్టితో నింపి (3:1) మరియు తాజాగా తయారుచేసిన S. స్క్లెరోటియోరమ్ కల్చర్‌తో ఇంజెక్ట్ చేశారు. మొదట, S. స్క్లెరోటియోరమ్ (ఐసోలేట్ #3) యొక్క అత్యంత ఇన్వాసివ్ ఐసోలేట్‌ను ఒక స్క్లెరోటియంను సగానికి కట్ చేసి, దానిని PDAపై ముఖం కింద ఉంచి, 25°C వద్ద స్థిరమైన చీకటిలో (24 గంటలు) 4 రోజులు పొదిగించి, మైసిలియల్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించారు. తరువాత నాలుగు 5 మి.మీ. వ్యాసం కలిగిన అగర్ ప్లగ్‌లను లీడింగ్ ఎడ్జ్ నుండి తీసుకొని 100 గ్రాముల గోధుమ మరియు బియ్యం ఊక (1:1, v/v) యొక్క స్టెరైల్ మిశ్రమంతో ఇంజెక్ట్ చేశారు మరియు స్క్లెరోటియా ఏర్పడటాన్ని ప్రేరేపించడానికి అన్ని ఫ్లాస్క్‌లను 25 ± 2 °C వద్ద 12 గంటల కాంతి/12 గంటల చీకటి చక్రంలో 5 రోజుల పాటు ఇంజెక్ట్ చేశారు. మట్టిని జోడించే ముందు సజాతీయతను నిర్ధారించడానికి అన్ని ఫ్లాస్క్‌లలోని విషయాలను పూర్తిగా కలిపారు. తరువాత, వ్యాధికారకాల స్థిరమైన సాంద్రతను నిర్ధారించడానికి ప్రతి కుండకు 100 గ్రాముల వలస ఊక మిశ్రమాన్ని జోడించారు. శిలీంధ్రాల పెరుగుదలను సక్రియం చేయడానికి టీకాలు వేసిన కుండలకు నీరు పోసి 7 రోజులు గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో ఉంచారు.
తరువాత ప్రతి కుండలో గిజా 3 రకానికి చెందిన ఐదు విత్తనాలను నాటారు. L-ఆర్నిథైన్ మరియు శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-T తో చికిత్స చేసిన కుండల కోసం, క్రిమిరహితం చేసిన విత్తనాలను ముందుగా రెండు సమ్మేళనాల జల ద్రావణంలో వరుసగా 250 mg/L మరియు 50 mg/L తుది IC99 సాంద్రతతో రెండు గంటలు నానబెట్టి, ఆపై విత్తడానికి ముందు ఒక గంట పాటు గాలిలో ఆరబెట్టారు. మరోవైపు, ప్రతికూల నియంత్రణగా విత్తనాలను క్రిమిరహితం చేసిన స్వేదనజలంలో నానబెట్టారు. 10 రోజుల తర్వాత, మొదటి నీరు త్రాగుటకు ముందు, మొలకలను పలుచగా చేసి, ప్రతి కుండలో రెండు చక్కని మొలకలను మాత్రమే వదిలివేశారు. అదనంగా, S. స్క్లెరోటియోరమ్‌తో సంక్రమణను నిర్ధారించడానికి, ఒకే అభివృద్ధి దశలో (10 రోజులు) ఉన్న బీన్ మొక్క కాండాలను క్రిమిరహితం చేసిన స్కాల్పెల్ ఉపయోగించి రెండు వేర్వేరు ప్రదేశాలలో కత్తిరించారు మరియు ప్రతి గాయంలో సుమారు 0.5 గ్రాముల వలస బ్రాన్ మిశ్రమాన్ని ఉంచారు, తరువాత అధిక తేమతో అన్ని టీకాలు వేసిన మొక్కలలో సంక్రమణ మరియు వ్యాధి అభివృద్ధిని ప్రేరేపించారు. నియంత్రణ మొక్కలను కూడా అదేవిధంగా గాయపరిచారు మరియు వ్యాధి అభివృద్ధికి వాతావరణాన్ని అనుకరించడానికి మరియు చికిత్స సమూహాల మధ్య స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి సమాన మొత్తంలో (0.5 గ్రా) శుభ్రమైన, వలసరాజ్యం కాని ఊక మిశ్రమాన్ని గాయంలో ఉంచారు మరియు అధిక తేమ కింద నిర్వహించారు.
చికిత్సా విధానం: బీన్ మొలకలకు 500 ml L-ornithine (250 mg/l) జల ద్రావణం లేదా Rizolex-T (50 mg/l) శిలీంద్ర సంహారిణితో నేలకు నీళ్ళు పోసి నీరు పోశారు, తర్వాత 10 రోజుల విరామంలో మూడుసార్లు చికిత్స పునరావృతమైంది. ప్లేసిబో-చికిత్స చేసిన నియంత్రణలను 500 ml శుభ్రమైన స్వేదనజలంతో నీరు పోశారు. అన్ని చికిత్సలు గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో (25 ± 2°C, 75 ± 1% సాపేక్ష ఆర్ద్రత మరియు 8 గంటల కాంతి/16 గంటల చీకటి ఫోటోపీరియడ్) నిర్వహించబడ్డాయి. అన్ని కుండలకు పక్షం రోజులకు ఒకసారి నీరు పోసి, సమతుల్య NPK ఎరువులతో (20-20-20, 3.6% సల్ఫర్ మరియు TE మైక్రోఎలిమెంట్‌లతో; జైన్ సీడ్స్, ఈజిప్ట్) నెలవారీగా 3-4 g/l సాంద్రతతో నిర్దిష్ట రకానికి సిఫార్సులు మరియు తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ఆకులపై పిచికారీ చేయడం ద్వారా చికిత్స చేశారు. వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే, పూర్తిగా విస్తరించిన పరిణతి చెందిన ఆకులు (పై నుండి 2వ మరియు 3వ ఆకులు) ప్రతి జీవ ప్రతిరూపం నుండి 72 గంటల పోస్ట్-ట్రీట్మెంట్ (hpt) వద్ద సేకరించబడ్డాయి, సజాతీయపరచబడ్డాయి, పూల్ చేయబడ్డాయి మరియు -80 °C వద్ద నిల్వ చేయబడ్డాయి, వీటిలో మరిన్ని విశ్లేషణలు ఉన్నాయి, వీటిలో ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి సూచికల యొక్క సిటు హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణ, లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్, ఎంజైమాటిక్ మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు మరియు జన్యు వ్యక్తీకరణ ఉన్నాయి.
టెరాన్ మరియు ఇతరులు (2006) సవరించిన పెట్జోల్డ్ మరియు డిక్సన్ స్కేల్ (1996) ఆధారంగా 1–9 స్కేల్ (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S2) ఉపయోగించి తెల్ల అచ్చు సంక్రమణ తీవ్రతను వారానికి 21 రోజుల తర్వాత ఇనాక్యులేషన్ (dpi) అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, ఇంటర్నోడ్‌లు మరియు నోడ్‌ల వెంట గాయాల పురోగతిని అనుసరించడానికి ఇనాక్యులేషన్ పాయింట్ నుండి ప్రారంభించి బీన్ మొక్కల కాండం మరియు కొమ్మలను పరిశీలించారు. ఇనాక్యులేషన్ పాయింట్ నుండి కాండం లేదా కొమ్మ వెంట అవతలి బిందువు వరకు గాయం యొక్క దూరాన్ని కొలుస్తారు మరియు గాయం యొక్క స్థానం ఆధారంగా 1–9 స్కోరు కేటాయించబడుతుంది, ఇక్కడ (1) ఇనాక్యులేషన్ పాయింట్ దగ్గర కనిపించని ఇన్ఫెక్షన్‌ను సూచిస్తుంది మరియు (2–9) నోడ్‌లు/ఇంటర్నోడ్‌ల వెంట గాయం పరిమాణం మరియు పురోగతిలో క్రమంగా పెరుగుదలను సూచిస్తుంది (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S2). తెల్ల అచ్చు సంక్రమణ తీవ్రతను ఫార్ములా 2 ఉపయోగించి శాతంగా మార్చారు:
అదనంగా, వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ (AUDPC) కింద ఉన్న ప్రాంతాన్ని ఫార్ములా (షానర్ మరియు ఫిన్నీ, 1977) ఉపయోగించి లెక్కించారు, దీనిని ఇటీవల సమీకరణం 3 ఉపయోగించి సాధారణ బీన్ (చౌహాన్ మరియు ఇతరులు, 2020) యొక్క తెల్ల తెగులు కోసం స్వీకరించారు:
ఇక్కడ Yi = ti సమయంలో వ్యాధి తీవ్రత, Yi+1 = తదుపరి సమయంలో ti+1 వద్ద వ్యాధి తీవ్రత, ti = మొదటి కొలత సమయం (రోజుల్లో), ti+1 = తదుపరి కొలత సమయం (రోజుల్లో), n = మొత్తం సమయ బిందువులు లేదా పరిశీలన బిందువుల సంఖ్య. అన్ని జీవ ప్రతిరూపాలలో మొక్కల ఎత్తు (సెం.మీ), మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య మరియు మొక్కకు ఆకుల సంఖ్యతో సహా బీన్ మొక్కల పెరుగుదల పారామితులు వారానికి 21 రోజులు నమోదు చేయబడ్డాయి.
ప్రతి జీవ ప్రతిరూపంలో, చికిత్స తర్వాత 45వ రోజున (చివరి చికిత్స తర్వాత 15 రోజుల తర్వాత) ఆకు నమూనాలను (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) సేకరించారు. ప్రతి జీవ ప్రతిరూపంలో ఐదు కుండలు (కుండకు రెండు మొక్కలు) ఉంటాయి. చీకటిలో 4 °C వద్ద 80% అసిటోన్ ఉపయోగించి కిరణజన్య సంయోగక్రియ వర్ణద్రవ్యాల (క్లోరోఫిల్ a, క్లోరోఫిల్ b మరియు కెరోటినాయిడ్లు) వెలికితీత కోసం దాదాపు 500 mg పిండిచేసిన కణజాలాన్ని ఉపయోగించారు. 24 గంటల తర్వాత, నమూనాలను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, మూడు వేర్వేరు తరంగదైర్ఘ్యాల (A470, A646 మరియు A663 nm) వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) పద్ధతి ప్రకారం కలర్‌మెట్రిక్‌గా క్లోరోఫిల్ a, క్లోరోఫిల్ b మరియు కెరోటినాయిడ్ కంటెంట్‌లను నిర్ణయించడానికి సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించారు. చివరగా, కిరణజన్య సంయోగక్రియ వర్ణద్రవ్యాల కంటెంట్‌ను లిచ్టెంథాలర్ (1987) వివరించిన క్రింది సూత్రాలు 4–6 ఉపయోగించి లెక్కించారు.
చికిత్స తర్వాత 72 గంటల తర్వాత (hpt), హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ (H2O2) మరియు సూపర్ ఆక్సైడ్ అయాన్ (O2•−) యొక్క ఇన్ సిటు హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణ కోసం ప్రతి జీవ ప్రతిరూపం నుండి ఆకులు (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) సేకరించబడ్డాయి. ప్రతి జీవ ప్రతిరూపం ఐదు కుండలను (కుండకు రెండు మొక్కలు) కలిగి ఉంటుంది. పద్ధతి యొక్క ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని నిర్ధారించడానికి ప్రతి జీవ ప్రతిరూపాన్ని నకిలీలో (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు) విశ్లేషించారు. H2O2 మరియు O2•−లను వరుసగా 0.1% 3,3′-డైమినోబెంజిడిన్ (DAB; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) లేదా నైట్రోబ్లూ టెట్రాజోలియం (NBT; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు, రొమేరో-పుయెర్టాస్ మరియు ఇతరులు (2004) మరియు ఆడమ్ మరియు ఇతరులు (1989) వివరించిన పద్ధతులను అనుసరించి, చిన్న మార్పులతో. H2O2 యొక్క హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణ కోసం, కరపత్రాలను 10 mM ట్రిస్ బఫర్ (pH 7.8)లో 0.1% DABతో వాక్యూమ్ ఇన్‌ఫిల్ట్రేట్ చేసి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 60 నిమిషాలు కాంతిలో పొదిగించారు. కరపత్రాలను 4:1 (v/v) ఇథనాల్:క్లోరోఫామ్ (అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్)లో 0.15% (v/v) TCAలో బ్లీచ్ చేసి, ఆపై అవి నల్లబడే వరకు కాంతికి గురిచేశారు. అదేవిధంగా, O2•− యొక్క హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణ కోసం కవాటాలను 0.1 w/v % HBT కలిగిన 10 mM పొటాషియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 7.8)తో వాక్యూమ్ ఇన్‌ఫిల్ట్రేట్ చేశారు. కరపత్రాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 20 నిమిషాలు కాంతిలో పొదిగించి, పైన పేర్కొన్న విధంగా బ్లీచ్ చేసి, ఆపై ముదురు నీలం/వైలెట్ మచ్చలు కనిపించే వరకు ప్రకాశవంతం చేశారు. ఫలితంగా వచ్చే గోధుమ రంగు (H2O2 సూచికగా) లేదా నీలం-వైలెట్ (O2•− సూచికగా) రంగు యొక్క తీవ్రతను ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ ప్యాకేజీ ImageJ (http://fiji.sc; యాక్సెస్ చేయబడినది 7 మార్చి 2024) యొక్క ఫిజి వెర్షన్ ఉపయోగించి అంచనా వేయబడింది.
మాలోండియాల్డిహైడ్ (MDA; లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్ యొక్క మార్కర్‌గా) డు మరియు బ్రామ్‌లేజ్ (1992) పద్ధతి ప్రకారం స్వల్ప మార్పులతో నిర్ణయించబడింది. ప్రతి జీవ ప్రతిరూపం (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) నుండి ఆకులు 72 గంటల తర్వాత చికిత్స తర్వాత సేకరించబడ్డాయి (hpt). ప్రతి జీవ ప్రతిరూపంలో ఐదు కుండలు (కుండకు రెండు మొక్కలు) ఉన్నాయి. పద్ధతి యొక్క ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని నిర్ధారించడానికి ప్రతి జీవ ప్రతిరూపాన్ని నకిలీలో (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు) విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, 0.01% బ్యూటిలేటెడ్ హైడ్రాక్సిటోలుయెన్ (BHT; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) కలిగిన 20% ట్రైక్లోరోఅసిటిక్ ఆమ్లంతో MDA వెలికితీత కోసం 0.5 గ్రా గ్రౌండ్ లీఫ్ కణజాలాన్ని ఉపయోగించారు. సూపర్‌నాటెంట్‌లోని MDA కంటెంట్‌ను UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 532 మరియు 600 nm వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా కలర్‌మెట్రిక్‌గా నిర్ణయించారు మరియు తరువాత nmol g−1 FW గా వ్యక్తీకరించారు.
నాన్-ఎంజైమాటిక్ మరియు ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్ల అంచనా కోసం, ప్రతి జీవ ప్రతిరూపం నుండి ఆకులు (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) 72 గంటల తర్వాత చికిత్స తర్వాత (hpt) సేకరించబడ్డాయి. ప్రతి జీవ ప్రతిరూపంలో ఐదు కుండలు (కుండకు రెండు మొక్కలు) ఉంటాయి. ప్రతి జీవ నమూనాను నకిలీలో విశ్లేషించారు (రెండు సాంకేతిక నమూనాలు). రెండు ఆకులను ద్రవ నత్రజనితో రుబ్బారు మరియు ఎంజైమాటిక్ మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు, మొత్తం అమైనో ఆమ్లాలు, ప్రోలిన్ కంటెంట్, జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు ఆక్సలేట్ పరిమాణీకరణను నిర్ణయించడానికి నేరుగా ఉపయోగించారు.
కాహ్కోనెన్ మరియు ఇతరులు (1999) వివరించిన పద్ధతిలో స్వల్ప మార్పులతో ఫోలిన్-సియోకల్టియు రియాజెంట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) ఉపయోగించి మొత్తం కరిగే ఫినోలిక్‌లను నిర్ణయించారు. క్లుప్తంగా, సుమారు 0.1 గ్రా హోమోజెనైజ్డ్ లీఫ్ టిష్యూను 20 ml 80% మిథనాల్‌తో చీకటి ప్రదేశంలో 24 గంటలు సేకరించారు మరియు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించారు. 0.1 ml నమూనా సారం 0.5 ml ఫోలిన్-సియోకల్టియు రియాజెంట్ (10%)తో కలిపి, 30 సెకన్ల పాటు కదిలించి, 5 నిమిషాలు చీకటిలో ఉంచారు. తరువాత 0.5 ml 20% సోడియం కార్బోనేట్ ద్రావణం (Na2CO3; అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్ కంపెనీ, కైరో, ఈజిప్ట్) ప్రతి ట్యూబ్‌కు జోడించబడింది, పూర్తిగా కలపబడింది మరియు చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు పొదిగింది. పొదిగిన తర్వాత, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి ప్రతిచర్య మిశ్రమం యొక్క శోషణను 765 nm వద్ద కొలుస్తారు. నమూనా సారాలలో మొత్తం కరిగే ఫినాల్స్ యొక్క సాంద్రతను గాలిక్ యాసిడ్ కాలిబ్రేషన్ కర్వ్ (ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు మరియు తాజా బరువు గ్రాముకు గాలిక్ యాసిడ్ సమానమైన మిల్లీగ్రాములగా వ్యక్తీకరించారు (mg GAE g-1 తాజా బరువు).
మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్ కంటెంట్‌ను జెరిడేన్ మరియు ఇతరులు (2006) పద్ధతి ప్రకారం స్వల్ప మార్పులతో నిర్ణయించారు. క్లుప్తంగా, పైన పేర్కొన్న మిథనాల్ సారం యొక్క 0.3 ml ను 0.3 ml 5% అల్యూమినియం క్లోరైడ్ ద్రావణంతో (AlCl3; ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) కలిపి, తీవ్రంగా కదిలించి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాలు పొదిగించారు, తరువాత 0.3 ml 10% పొటాషియం అసిటేట్ ద్రావణం (అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్) జోడించి, పూర్తిగా కలిపి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు చీకటిలో పొదిగించారు. ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, ప్రతిచర్య మిశ్రమం యొక్క శోషణను UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 430 nm వద్ద కొలుస్తారు. నమూనా సారంలలో మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్ల సాంద్రతను రూటిన్ కాలిబ్రేషన్ కర్వ్ (TCI అమెరికా, పోర్ట్‌ల్యాండ్, OR, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు మరియు తరువాత తాజా బరువు గ్రాముకు మిల్లీగ్రాముల రుటిన్ సమానమైన (mg RE g-1 తాజా బరువు)గా వ్యక్తీకరించారు.
యోకోయామా మరియు హిరామట్సు (2003) ప్రతిపాదించిన మరియు సన్ మరియు ఇతరులు (2006) సవరించిన పద్ధతి ఆధారంగా, బీన్ ఆకుల మొత్తం ఉచిత అమైనో ఆమ్ల కంటెంట్‌ను సవరించిన నిన్‌హైడ్రిన్ రియాజెంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్తామ్, MA, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు. క్లుప్తంగా, 0.1 గ్రా గ్రౌండ్ టిష్యూను pH 5.4 బఫర్‌తో సంగ్రహించారు, మరియు 200 μL సూపర్‌నాటెంట్‌ను 200 μL నిన్‌హైడ్రిన్ (2%) మరియు 200 μL పిరిడిన్ (10%; స్పెక్ట్రమ్ కెమికల్, న్యూ బ్రున్స్‌విక్, NJ, USA)తో చర్య జరిపి, మరిగే నీటి స్నానంలో 30 నిమిషాలు పొదిగించి, ఆపై చల్లబరిచి UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 580 nm వద్ద కొలుస్తారు. మరోవైపు, ప్రోలిన్‌ను బేట్స్ పద్ధతి ద్వారా నిర్ణయించారు (బేట్స్ మరియు ఇతరులు, 1973). ప్రోలిన్‌ను 3% సల్ఫోసాలిసిలిక్ ఆమ్లంతో (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్తామ్, MA, USA) సంగ్రహించారు మరియు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, 0.5 ml సూపర్‌నాటెంట్‌ను 1 ml గ్లేసియల్ ఎసిటిక్ ఆమ్లం (ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) మరియు నిన్‌హైడ్రిన్ రియాజెంట్‌తో కలిపి, 90°C వద్ద 45 నిమిషాలు పొదిగించి, పైన పేర్కొన్న అదే స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌ను ఉపయోగించి చల్లబరిచి 520 nm వద్ద కొలుస్తారు. ఆకు సారాలలో మొత్తం ఉచిత అమైనో ఆమ్లాలు మరియు ప్రోలిన్‌ను వరుసగా గ్లైసిన్ మరియు ప్రోలిన్ కాలిబ్రేషన్ వక్రతలను (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు మరియు mg/g తాజా బరువుగా వ్యక్తీకరించారు.
యాంటీఆక్సిడెంట్ ఎంజైమ్‌ల ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను నిర్ణయించడానికి, 1 mM EDTA-Na2 (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) మరియు 7.5% పాలీవినైల్‌పైరోలిడోన్ (PVP; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) కలిగిన 3 ml 50 mM ట్రిస్ బఫర్ (pH 7.8)తో సుమారు 500 mg హోమోజెనైజ్డ్ కణజాలాన్ని సేకరించారు, 10,000 × g వద్ద 20 నిమిషాలు రిఫ్రిజిరేషన్ కింద (4 °C) సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సూపర్‌నాటెంట్ (ముడి ఎంజైమ్ సారం) సేకరించారు (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023). తరువాత కాటలేస్ (CAT) ను 2 ml 0.1 M సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.5; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) మరియు 100 μl 269 mM H2O2 ద్రావణంతో చర్య జరిపి, దాని ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను స్వల్ప మార్పులతో (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) నిర్ణయించారు. హర్రాచ్ et al. (2009) పద్ధతిని ఉపయోగించి గుయాకోల్-ఆధారిత పెరాక్సిడేస్ (POX) ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను నిర్ణయించారు. (2008) స్వల్ప మార్పులతో (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023) మరియు పాలీఫెనాల్ ఆక్సిడేస్ (PPO) యొక్క ఎంజైమాటిక్ కార్యాచరణను 2.2 ml 100 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.0), 100 μl గ్వాయాకోల్ (TCI రసాయనాలు, పోర్ట్‌ల్యాండ్, OR, USA) మరియు 100 μl 12 mM H2O2 తో ప్రతిచర్య తర్వాత నిర్ణయించారు. ఈ పద్ధతిని (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023) నుండి కొద్దిగా సవరించారు. 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.0) లో తాజాగా తయారుచేసిన 3 ml కాటెకాల్ ద్రావణం (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్తామ్, MA, USA) (0.01 M) తో ప్రతిచర్య తర్వాత పరీక్ష జరిగింది. 240 nm (A240) వద్ద H2O2 కుళ్ళిపోవడాన్ని పర్యవేక్షించడం ద్వారా CAT కార్యాచరణను కొలుస్తారు, 436 nm (A436) వద్ద శోషణ పెరుగుదలను పర్యవేక్షించడం ద్వారా POX కార్యాచరణను కొలుస్తారు మరియు UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు, జపాన్) ఉపయోగించి ప్రతి 30 సెకన్లకు 495 nm (A495) వద్ద శోషణ హెచ్చుతగ్గులను రికార్డ్ చేయడం ద్వారా PPO కార్యాచరణను కొలుస్తారు.
చివరి చికిత్స తర్వాత 72 గంటల తర్వాత బీన్ ఆకులలో (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) పెరాక్సిసోమల్ కాటలేస్ (PvCAT1; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. KF033307.1), సూపర్ ఆక్సైడ్ డిస్ముటేస్ (PvSOD; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. XM_068639556.1), మరియు గ్లూటాతియోన్ రిడక్టేజ్ (PvGR; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. KY195009.1) వంటి మూడు యాంటీఆక్సిడెంట్-సంబంధిత జన్యువుల ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలను గుర్తించడానికి రియల్-టైమ్ RT-PCR ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం సింప్లీ P టోటల్ RNA ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ కిట్ (క్యాట్. నం. BSC52S1; బయోఫ్లక్స్, బయోరి టెక్నాలజీ, చైనా) ఉపయోగించి RNA వేరుచేయబడింది. తరువాత, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం TOP స్క్రిప్ట్™ cDNA సింథసిస్ కిట్ ఉపయోగించి cDNA సంశ్లేషణ చేయబడింది. పైన పేర్కొన్న మూడు జన్యువుల ప్రైమర్ సీక్వెన్సులు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S3లో ఇవ్వబడ్డాయి. PvActin-3 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_068616709.1) ను హౌస్ కీపింగ్ జన్యువుగా ఉపయోగించారు మరియు సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణను 2-ΔΔCT పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించారు (లివాక్ మరియు ష్మిట్జెన్, 2001). బయోటిక్ ఒత్తిడి (సాధారణ చిక్కుళ్ళు మరియు ఆంత్రాక్నోస్ ఫంగస్ కొల్లెటోట్రిఖం లిండెముథియానమ్ మధ్య అననుకూల పరస్పర చర్య) మరియు అబియోటిక్ ఒత్తిడి (కరువు, లవణీయత, తక్కువ ఉష్ణోగ్రత) కింద యాక్టిన్ స్థిరత్వం ప్రదర్శించబడింది (బోర్జెస్ మరియు ఇతరులు, 2012).
మేము మొదట్లో S. స్క్లెరోటియోరమ్‌లోని ఆక్సలోఅసిటేట్ ఎసిటైల్హైడ్రోలేస్ (OAH) ప్రోటీన్‌ల యొక్క జన్యు-వ్యాప్త సిలికో విశ్లేషణను ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ BLAST సాధనం (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ఉపయోగించి నిర్వహించాము. క్లుప్తంగా, S. స్క్లెరోటియోరమ్ (టాక్సైడ్: 5180)లోని హోమోలాగస్ ప్రోటీన్‌ను మ్యాప్ చేయడానికి మేము Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; టాక్సైడ్: 1191702; GenBank యాక్సెషన్ నంబర్ XP_040799428.1; 342 అమైనో ఆమ్లాలు) మరియు పెన్సిలియం లాగేనా (PlOAH; టాక్సైడ్: 94218; GenBank యాక్సెషన్ నంబర్ XP_056833920.1; 316 అమైనో ఆమ్లాలు) నుండి OAHని ప్రశ్న శ్రేణులుగా ఉపయోగించాము. నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI) వెబ్‌సైట్, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ లోని జెన్‌బ్యాంక్‌లో ఇటీవల అందుబాటులో ఉన్న S. స్క్లెరోటియోరమ్ జీనోమ్ డేటాకు వ్యతిరేకంగా BLASTp ప్రదర్శించబడింది.
అదనంగా, S. స్క్లెరోటియోరం (SsOAH) నుండి ఊహించబడిన OAH జన్యువు మరియు A. fijiensis CBS 313.89 నుండి AfOAH యొక్క పరిణామ విశ్లేషణ మరియు ఫైలోజెనెటిక్ చెట్టు మరియు P. lagena నుండి PlOAH లను MEGA11 (Tamura et al., 2021) మరియు JTT మ్యాట్రిక్స్-ఆధారిత నమూనా (జోన్స్ et al., 1992)లో గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతిని ఉపయోగించి ఊహించబడ్డాయి. ఫైలోజెనెటిక్ చెట్టును S. స్క్లెరోటియోరం నుండి ఊహించబడిన అన్ని OAH జన్యువుల (SsOAH) ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌ల బహుళ అమరిక విశ్లేషణ మరియు నిర్బంధ-ఆధారిత అమరిక సాధనం (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) ఉపయోగించి ప్రశ్న క్రమంతో కలిపారు (Papadopoulos మరియు Agarwala, 2007). అదనంగా, S. స్క్లెరోటియోరమ్ నుండి SsOAH యొక్క ఉత్తమ సరిపోలిక అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులను ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ఉపయోగించి ప్రశ్న శ్రేణులతో (AfOAH మరియు PlOAH) (లార్కిన్ మరియు ఇతరులు, 2007) సమలేఖనం చేశారు మరియు అమరికలోని సంరక్షించబడిన ప్రాంతాలను ESPript సాధనం (వెర్షన్ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేశారు.
ఇంకా, S. స్క్లెరోటియోరం SsOAH యొక్క అంచనా వేయబడిన ఫంక్షనల్ రిప్రజెంటేటివ్ డొమైన్‌లు మరియు సంరక్షించబడిన సైట్‌లను ఇంటర్‌ప్రో సాధనం (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (బ్లమ్ మరియు ఇతరులు, 2021) ఉపయోగించి వివిధ కుటుంబాలుగా ఇంటరాక్టివ్‌గా వర్గీకరించారు. చివరగా, అంచనా వేయబడిన S. స్క్లెరోటియోరం SsOAH యొక్క త్రిమితీయ (3D) నిర్మాణ నమూనాను ప్రోటీన్ హోమోలజీ/అనలాజీ రికగ్నిషన్ ఇంజిన్ (ఫైర్2 సర్వర్ వెర్షన్ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (కెల్లీ మరియు ఇతరులు, 2015) ఉపయోగించి ప్రదర్శించారు మరియు SWISS-MODEL సర్వర్ (https://swissmodel.expasy.org/) (బియాసిని మరియు ఇతరులు, 2014) ఉపయోగించి ధృవీకరించారు. అంచనా వేసిన త్రిమితీయ నిర్మాణాలు (PDB ఫార్మాట్) UCSF-Chimera ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (పెట్టర్‌సెన్ మరియు ఇతరులు, 2004) ఉపయోగించి ఇంటరాక్టివ్‌గా దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.
స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ యొక్క మైసిలియాలో ఆక్సలోఅసెటేట్ ఎసిటైల్హైడ్రోలేస్ (SsOAH; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_001590428.1) యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ స్థాయిని నిర్ణయించడానికి పరిమాణాత్మక రియల్-టైమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ PCR ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, S. స్క్లెరోటియోరమ్‌ను PDB కలిగి ఉన్న ఫ్లాస్క్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేసి, షేకింగ్ ఇంక్యుబేటర్‌లో (మోడల్: I2400, న్యూ బ్రున్స్విక్ సైంటిఫిక్ కో., ఎడిసన్, NJ, USA) 25 ± 2 °C వద్ద 150 rpm వద్ద 24 గంటలు మరియు మైసిలియల్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించడానికి స్థిరమైన చీకటిలో (24 గంటలు) ఉంచారు. ఆ తరువాత, కణాలను చివరి IC50 సాంద్రతలలో (వరుసగా సుమారు 40 మరియు 3.2 mg/L) L-ఆర్నిథైన్ మరియు శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-T తో చికిత్స చేసి, అదే పరిస్థితులలో మరో 24 గంటలు కల్చర్ చేశారు. పొదిగిన తర్వాత, కల్చర్‌లను 2500 rpm వద్ద 5 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ కోసం సూపర్‌నాటెంట్ (ఫంగల్ మైసిలియం) సేకరించారు. అదేవిధంగా, సోకిన కణజాలాల ఉపరితలంపై తెల్లటి అచ్చు మరియు కాటన్ మైసిలియం ఏర్పడిన సోకిన మొక్కల నుండి సంక్రమణ తర్వాత 0, 24, 48, 72, 96 మరియు 120 గంటల వద్ద ఫంగల్ మైసిలియం సేకరించబడింది. ఫంగల్ మైసిలియం నుండి RNA సంగ్రహించబడింది మరియు పైన వివరించిన విధంగా cDNA సంశ్లేషణ చేయబడింది. SsOAH కోసం ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S3లో జాబితా చేయబడ్డాయి. SsActin (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_001589919.1) ను హౌస్ కీపింగ్ జన్యువుగా ఉపయోగించారు మరియు సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణను 2-ΔΔCT పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించారు (లివాక్ మరియు ష్మిట్జెన్, 2001).
జు మరియు జాంగ్ (2000) పద్ధతి ప్రకారం బంగాళాదుంప డెక్స్ట్రోస్ రసం (PDB) మరియు శిలీంధ్ర వ్యాధికారక స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ కలిగి ఉన్న మొక్కల నమూనాలలో ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని స్వల్ప మార్పులతో నిర్ణయించారు. క్లుప్తంగా, S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్‌లను PDB కలిగిన ఫ్లాస్క్‌లలో ఇంజెక్ట్ చేసి, ఆపై షేకింగ్ ఇంక్యుబేటర్ (మోడల్ I2400, న్యూ బ్రున్స్విక్ సైంటిఫిక్ కో., ఎడిసన్, NJ, USA)లో 150 rpm వద్ద 25 ± 2 °C వద్ద 3-5 రోజులు స్థిరమైన చీకటిలో (24 గంటలు) కల్చర్ చేసి మైసిలియల్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించారు. పొదిగిన తర్వాత, ఫంగల్ కల్చర్‌ను మొదట వాట్‌మాన్ #1 ఫిల్టర్ పేపర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేసి, ఆపై అవశేష మైసిలియంను తొలగించడానికి 5 నిమిషాలు 2500 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఆక్సలేట్ యొక్క మరింత పరిమాణాత్మక నిర్ణయం కోసం సూపర్‌నాటెంట్‌ను సేకరించి 4°C వద్ద నిల్వ చేశారు. మొక్కల నమూనాల తయారీకి, సుమారు 0.1 గ్రా మొక్కల కణజాల శకలాలు స్వేదనజలంతో (ప్రతిసారీ 2 ml) మూడుసార్లు తీయబడ్డాయి. ఆ తరువాత నమూనాలను 2500 rpm వద్ద 5 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు, సూపర్‌నాటెంట్‌ను వాట్‌మాన్ నంబర్ 1 ఫిల్టర్ పేపర్ ద్వారా డ్రై ఫిల్టర్ చేసి తదుపరి విశ్లేషణ కోసం సేకరించారు.
ఆక్సాలిక్ ఆమ్లం యొక్క పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం, ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని గాజు స్టాపర్డ్ ట్యూబ్‌లో ఈ క్రింది క్రమంలో తయారు చేశారు: 0.2 మి.లీ నమూనా (లేదా పిడిబి కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్ లేదా ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల ప్రామాణిక ద్రావణం), 0.11 మి.లీ బ్రోమోఫెనాల్ బ్లూ (బిపిబి, 1 మి.మీ; ఫిషర్ కెమికల్, పిట్స్‌బర్గ్, పిఎ, యుఎస్ఎ), 0.198 మి.లీ 1 ఎమ్ సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లం (హెచ్2ఎస్ఓ4; అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్) మరియు 0.176 మి.లీ 100 ఎమ్ఎమ్ పొటాషియం డైక్రోమేట్ (కె2సిఆర్2ఓ7; టిసిఐ కెమికల్స్, పోర్ట్‌ల్యాండ్, ఓఆర్, యుఎస్ఎ), ఆపై ద్రావణాన్ని స్వేదనజలంతో 4.8 మి.లీకి కరిగించి, తీవ్రంగా కలిపి వెంటనే 60 °C నీటి స్నానంలో ఉంచారు. 10 నిమిషాల తర్వాత, 0.5 మి.లీ సోడియం హైడ్రాక్సైడ్ ద్రావణం (NaOH; 0.75 M) జోడించడం ద్వారా ప్రతిచర్య ఆగిపోయింది. UV-160 స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి ప్రతిచర్య మిశ్రమం యొక్క శోషణ (A600) ను 600 nm వద్ద కొలుస్తారు. PDB మరియు స్వేదనజలం వరుసగా కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్‌లు మరియు మొక్కల నమూనాల పరిమాణీకరణకు నియంత్రణలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి. PDB మాధ్యమం యొక్క మిల్లీలీటర్‌కు (μg.mL−1) మైక్రోగ్రాముల ఆక్సాలిక్ ఆమ్లంగా వ్యక్తీకరించబడిన కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్‌లలోని ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల సాంద్రతలు మరియు తాజా బరువు గ్రాముకు (μg.g−1 FW) మైక్రోగ్రాముల ఆక్సాలిక్ ఆమ్లంగా వ్యక్తీకరించబడిన ఆకు సారాలలో, ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల అమరిక వక్రరేఖను (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్తామ్, MA, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించబడ్డాయి.
అధ్యయనం అంతటా, అన్ని ప్రయోగాలు పూర్తిగా యాదృచ్ఛిక రూపకల్పన (CRD)లో రూపొందించబడ్డాయి, చికిత్సకు ఆరు జీవ ప్రతిరూపాలు మరియు జీవ ప్రతిరూపానికి ఐదు కుండలు (కుండకు రెండు మొక్కలు) వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే. జీవ ప్రతిరూపాలను నకిలీలో విశ్లేషించారు (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు). ఒకే ప్రయోగం యొక్క పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని తనిఖీ చేయడానికి సాంకేతిక ప్రతిరూపాలను ఉపయోగించారు కానీ నకిలీ ప్రతిరూపాలను నివారించడానికి గణాంక విశ్లేషణలో ఉపయోగించలేదు. టుకే-క్రామర్ నిజాయితీగా ముఖ్యమైన తేడా (HSD) పరీక్ష (p ≤ 0.05) తర్వాత వైవిధ్య విశ్లేషణ (ANOVA) ఉపయోగించి డేటాను గణాంకపరంగా విశ్లేషించారు. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాల కోసం, IC50 మరియు IC99 విలువలను ప్రోబిట్ మోడల్ ఉపయోగించి లెక్కించారు మరియు 95% విశ్వాస విరామాలు లెక్కించబడ్డాయి.
ఈజిప్టులోని ఎల్ ఘాబియా గవర్నరేట్‌లోని వివిధ సోయాబీన్ పొలాల నుండి మొత్తం నాలుగు ఐసోలేట్‌లను సేకరించారు. PDA మాధ్యమంలో, అన్ని ఐసోలేట్‌లు క్రీమీ వైట్ మైసిలియంను ఉత్పత్తి చేశాయి, ఇవి త్వరగా కాటన్ వైట్‌గా మారాయి (మూర్తి 1A) మరియు తరువాత స్క్లెరోటియం దశలో లేత గోధుమరంగు లేదా గోధుమ రంగులోకి మారాయి. స్క్లెరోటియా సాధారణంగా దట్టమైన, నలుపు, గోళాకార లేదా సక్రమంగా ఆకారంలో ఉంటాయి, 5.2 నుండి 7.7 మిమీ పొడవు మరియు 3.4 నుండి 5.3 మిమీ వ్యాసం కలిగి ఉంటాయి (మూర్తి 1B). నాలుగు ఐసోలేట్‌లు 25 ± 2 °C (మూర్తి 1A) వద్ద 10-12 రోజుల పొదిగే తర్వాత కల్చర్ మాధ్యమం అంచున స్క్లెరోటియా యొక్క ఉపాంత నమూనాను అభివృద్ధి చేసినప్పటికీ, వాటిలో ప్లేట్‌కు స్క్లెరోటియా సంఖ్య గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంది (P < 0.001), ఐసోలేట్ 3 అత్యధిక సంఖ్యలో స్క్లెరోటియాను కలిగి ఉంది (ప్రతి ప్లేట్‌కు 32.33 ± 1.53 స్క్లెరోటియా; చిత్రం 1C). అదేవిధంగా, ఐసోలేట్ #3 PDBలో ఇతర ఐసోలేట్‌ల కంటే ఎక్కువ ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని ఉత్పత్తి చేసింది (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). ఐసోలేట్ #3 ఫైటోపాథోజెనిక్ ఫంగస్ స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ యొక్క సాధారణ పదనిర్మాణ మరియు సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాలను చూపించింది. ఉదాహరణకు, PDAలో, ఐసోలేట్ #3 యొక్క కాలనీలు వేగంగా పెరిగాయి, క్రీమీ వైట్ (Figure 1A), రివర్స్ లేత గోధుమరంగు లేదా లేత సాల్మన్ పసుపు-గోధుమ రంగులో ఉన్నాయి మరియు 9 సెం.మీ వ్యాసం కలిగిన ప్లేట్ యొక్క ఉపరితలాన్ని పూర్తిగా కవర్ చేయడానికి 25 ± 2°C వద్ద 6-7 రోజులు పట్టింది. పైన పేర్కొన్న పదనిర్మాణ మరియు సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాల ఆధారంగా, ఐసోలేట్ #3ని స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్‌గా గుర్తించారు.
చిత్రం 1. సాధారణ పప్పుదినుసు పంటల నుండి S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ల లక్షణాలు మరియు వ్యాధికారకత. (A) PDA మాధ్యమంలో నాలుగు S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ల మైసిలియల్ పెరుగుదల, (B) నాలుగు S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ల స్క్లెరోటియా, (C) స్క్లెరోటియా సంఖ్య (ప్లేట్‌కు), (D) PDB మాధ్యమంలో ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల స్రావం (μg.mL−1), మరియు (E) గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో అనుమానాస్పద వాణిజ్య పప్పుదినుసు సాగు గిజా 3 పై నాలుగు S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ల వ్యాధి తీవ్రత (%). విలువలు ఐదు జీవ ప్రతిరూపాల సగటు ± SDని సూచిస్తాయి (n = 5). వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05). (F–H) ఐసోలేట్ #3 (dpi) తో టీకాలు వేసిన 10 రోజుల తర్వాత, వరుసగా, భూమిపై ఉన్న కాండం మరియు సిలిక్‌లపై సాధారణ తెల్లటి అచ్చు లక్షణాలు కనిపించాయి. (I) S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్ #3 యొక్క అంతర్గత లిప్యంతరీకరణ స్పేసర్ (ITS) ప్రాంతం యొక్క పరిణామాత్మక విశ్లేషణను గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతిని ఉపయోగించి నిర్వహించారు మరియు నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI) డేటాబేస్ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) నుండి పొందిన 20 రిఫరెన్స్ ఐసోలేట్‌లు/స్ట్రెయిన్‌లతో పోల్చారు. క్లస్టరింగ్ లైన్‌ల పైన ఉన్న సంఖ్యలు ప్రాంత కవరేజీని (%) సూచిస్తాయి మరియు క్లస్టరింగ్ లైన్‌ల క్రింద ఉన్న సంఖ్యలు శాఖ పొడవును సూచిస్తాయి.
ఇంకా, వ్యాధికారకతను నిర్ధారించడానికి, నాలుగు పొందిన S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్‌లను గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో అనుమానాస్పద వాణిజ్య బీన్ సాగు గిజా 3ని టీకాలు వేయడానికి ఉపయోగించారు, ఇది కోచ్ యొక్క పోస్టులేట్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటుంది (Fig. 1E). పొందిన అన్ని ఫంగల్ ఐసోలేట్‌లు వ్యాధికారకమైనవి మరియు ఆకుపచ్చ బీన్ (cv. గిజా 3) కు సోకగలవు, ఇది భూమి పైన ఉన్న అన్ని భాగాలపై (Fig. 1F), ముఖ్యంగా కాండం (Fig. 1G) మరియు కాయలపై (Fig. 1H) సాధారణ తెల్లటి అచ్చు లక్షణాలను కలిగిస్తాయి, టీకాలు వేసిన 10 రోజుల తర్వాత (dpi), ఐసోలేట్ 3 రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో అత్యంత దూకుడుగా ఉండే ఐసోలేట్. బీన్ మొక్కలపై ఐసోలేట్ 3 అత్యధిక వ్యాధి తీవ్రత (%) కలిగి ఉంది (వరుసగా 7, 14, మరియు 21 రోజుల తర్వాత; Fig. 1F).
అత్యంత ఇన్వాసివ్ S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్ #3 యొక్క గుర్తింపును అంతర్గత ట్రాన్స్క్రిప్టెడ్ స్పేసర్ (ITS) సీక్వెన్సింగ్ (Fig. 1I) ఆధారంగా మరింత నిర్ధారించారు. ఐసోలేట్ #3 మరియు 20 రిఫరెన్స్ ఐసోలేట్‌లు/స్ట్రెయిన్‌ల మధ్య ఫైలోజెనెటిక్ విశ్లేషణ వాటి మధ్య అధిక సారూప్యతను (>99%) చూపించింది. S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్ #3 (533 bp) పొడి బఠానీ విత్తనాల నుండి వేరుచేయబడిన అమెరికన్ S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్ LPM36 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్ MK896659.1; 540 bp) మరియు వైలెట్ (మాథియోలా ఇంకానా) కాండం తెగులుకు కారణమయ్యే చైనీస్ S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్ YKY211 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్ OR206374.1; 548 bp) లకు అధిక సారూప్యతను కలిగి ఉందని గమనించాలి, ఇవన్నీ డెండ్రోగ్రామ్ పైభాగంలో విడిగా వర్గీకరించబడ్డాయి (మూర్తి 1I). ఈ కొత్త శ్రేణిని NCBI డేటాబేస్‌లో నిక్షిప్తం చేసి, "స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం - ఐసోలేట్ YN-25" (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్ PV202792) అని పేరు పెట్టారు. ఐసోలేట్ 3 అత్యంత ఇన్వాసివ్ ఐసోలేట్ అని చూడవచ్చు; అందువల్ల, ఈ ఐసోలేట్ తదుపరి అన్ని ప్రయోగాలలో అధ్యయనం కోసం ఎంపిక చేయబడింది.
S. స్క్లెరోటియోరం ఐసోలేట్ 3 కు వ్యతిరేకంగా వివిధ సాంద్రతలలో (12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 mg/L) డైమైన్ L-ఆర్నిథైన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్ట్, జర్మనీ) యొక్క యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను ఇన్ విట్రోలో పరిశోధించారు. L-ఆర్నిథైన్ యాంటీ బాక్టీరియల్ ప్రభావాన్ని చూపింది మరియు మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో S. స్క్లెరోటియోరం హైఫే యొక్క రేడియల్ పెరుగుదలను క్రమంగా నిరోధించింది (మూర్తి 2A, B). పరీక్షించిన అత్యధిక సాంద్రత (125 mg/L) వద్ద, L-ఆర్నిథైన్ అత్యధిక మైసిలియల్ పెరుగుదల నిరోధక రేటును (99.62 ± 0.27%; మూర్తి 2B) ప్రదర్శించింది, ఇది వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-T (నిరోధక రేటు 99.45 ± 0.39%; మూర్తి 2C) కు సమానం, ఇది పరీక్షించిన అత్యధిక సాంద్రత (10 mg/L) వద్ద ఇలాంటి సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది.
చిత్రం 2. స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా L-ఆర్నిథైన్ యొక్క ఇన్ విట్రో యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్య. (A) S. స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా L-ఆర్నిథైన్ యొక్క వివిధ సాంద్రతల యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-T (10 mg/L) తో పోల్చడం. (B, C) వరుసగా L-ఆర్నిథైన్ (12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 mg/L) లేదా Rizolex-T (2, 4, 6, 8 మరియు 10 mg/L) యొక్క వివిధ సాంద్రతలతో చికిత్స తర్వాత S. స్క్లెరోటియోరమ్ మైసిలియల్ పెరుగుదల యొక్క నిరోధక రేటు (%). విలువలు ఐదు జీవ ప్రతిరూపాల సగటు ± SDని సూచిస్తాయి (n = 5). వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంక వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05). (D, E) వరుసగా L-ఆర్నిథైన్ మరియు వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-T యొక్క ప్రోబిట్ మోడల్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణ. ప్రోబిట్ మోడల్ రిగ్రెషన్ లైన్ సాలిడ్ బ్లూ లైన్ గా చూపబడింది మరియు కాన్ఫిడెన్స్ ఇంటర్వెల్ (95%) డాష్డ్ రెడ్ లైన్ గా చూపబడింది.
అదనంగా, ప్రోబిట్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది మరియు సంబంధిత ప్లాట్లు టేబుల్ 1 మరియు ఫిగర్స్ 2D,Eలో చూపబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, L-ornithine యొక్క ఆమోదయోగ్యమైన వాలు విలువ (y = 2.92x − 4.67) మరియు సంబంధిత ముఖ్యమైన గణాంకాలు (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 మరియు p < 0.0001; Figure 2D) వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 మరియు p < 0.0001) (టేబుల్ 1) తో పోలిస్తే S. స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా మెరుగైన యాంటీ ఫంగల్ చర్యను సూచించాయి.
పట్టిక 1. S. స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా L-ఆర్నిథైన్ మరియు వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి "రిజోలెక్స్-T" యొక్క సగం-గరిష్ట నిరోధక సాంద్రత (IC50) మరియు IC99 (mg/l) విలువలు.
మొత్తంమీద, చికిత్స చేయని S. స్క్లెరోటియోరం-సోకిన మొక్కలతో పోలిస్తే చికిత్స చేయబడిన సాధారణ బీన్ మొక్కలపై L-ఆర్నిథైన్ (250 mg/L) తెల్లటి బూజు అభివృద్ధి మరియు తీవ్రతను గణనీయంగా తగ్గించింది (నియంత్రణ; చిత్రం 3A). క్లుప్తంగా, చికిత్స చేయని సోకిన నియంత్రణ మొక్కల వ్యాధి తీవ్రత క్రమంగా పెరిగినప్పటికీ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, మరియు 92.33 ± 3.06%), L-ఆర్నిథైన్ ప్రయోగం అంతటా వ్యాధి తీవ్రతను (%) గణనీయంగా తగ్గించింది (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, మరియు 26.36 ± 3.07) వరుసగా 7, 14, మరియు 21 రోజుల చికిత్స తర్వాత (dpt) (చిత్రం 3A). అదేవిధంగా, S. స్క్లెరోటియోరం-సోకిన బీన్ మొక్కలను 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స చేసినప్పుడు, చికిత్స చేయని నియంత్రణలో వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ (AUDPC) కింద ఉన్న ప్రాంతం 1274.33 ± 33.13 నుండి 281.03 ± 7.95కి తగ్గింది, ఇది సానుకూల నియంత్రణ 50 mg/L రిజోలెక్స్-టి శిలీంద్ర సంహారిణి (183.61 ± 7.71; చిత్రం 3B) కంటే కొంచెం తక్కువగా ఉంది. రెండవ ప్రయోగంలో కూడా అదే ధోరణి గమనించబడింది.
చిత్రం 3. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరం వల్ల కలిగే సాధారణ బీన్ యొక్క తెల్ల తెగులు అభివృద్ధిపై L-ఆర్నిథైన్ యొక్క బాహ్య అప్లికేషన్ ప్రభావం. (A) 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స తర్వాత సాధారణ బీన్ యొక్క తెల్ల అచ్చు యొక్క వ్యాధి పురోగతి వక్రత. (B) L-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స తర్వాత సాధారణ బీన్ యొక్క తెల్ల అచ్చు యొక్క వ్యాధి పురోగతి వక్రత (AUDPC) కింద ఉన్న ప్రాంతం. విలువలు ఐదు జీవ ప్రతిరూపాల సగటు ± SDని సూచిస్తాయి (n = 5). వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05).
42 రోజుల తర్వాత 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌ను బయట వాడటం వల్ల మొక్కల ఎత్తు (Fig. 4A), మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య (Fig. 4B), మరియు మొక్కకు ఆకుల సంఖ్య (Fig. 4C) క్రమంగా పెరిగాయి. వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి అయిన Rizolex-T (50 mg/L) అధ్యయనం చేయబడిన అన్ని పోషక పారామితులపై అత్యధిక ప్రభావాన్ని చూపగా, చికిత్స చేయని నియంత్రణలతో పోలిస్తే 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌ను బయట వాడటం రెండవ గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపింది (Fig. 4A–C). మరోవైపు, L-ఆర్నిథైన్ చికిత్స కిరణజన్య సంయోగక్రియ వర్ణద్రవ్యాల క్లోరోఫిల్ a (Fig. 4D) మరియు క్లోరోఫిల్ b (Fig. 4E) యొక్క కంటెంట్‌పై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు, కానీ ప్రతికూల నియంత్రణ (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) మరియు సానుకూల నియంత్రణ (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F) తో పోలిస్తే మొత్తం కెరోటినాయిడ్ కంటెంట్ (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) కొద్దిగా పెరిగింది. మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు L-ఆర్నిథైన్ చికిత్స చేయబడిన చిక్కుళ్ళుకు ఫైటోటాక్సిక్ కాదని మరియు వాటి పెరుగుదలను కూడా ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
చిత్రం 4. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ సోకిన బీన్ ఆకుల పెరుగుదల లక్షణాలు మరియు కిరణజన్య సంయోగక్రియ వర్ణద్రవ్యాలపై బాహ్య L-ఆర్నిథైన్ అప్లికేషన్ ప్రభావం. (A) మొక్క ఎత్తు (సెం.మీ), (B) మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య, (C) మొక్కకు ఆకుల సంఖ్య, (D) క్లోరోఫిల్ a కంటెంట్ (mg g-1 fr wt), (E) క్లోరోఫిల్ b కంటెంట్ (mg g-1 fr wt), (F) మొత్తం కెరోటినాయిడ్ కంటెంట్ (mg g-1 fr wt). విలువలు ఐదు జీవ ప్రతిరూపాల సగటు ± SD (n = 5). వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05).
రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతులు (ROS; హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ [H2O2] గా వ్యక్తీకరించబడింది) మరియు ఫ్రీ రాడికల్స్ (సూపర్ ఆక్సైడ్ అయాన్లు [O2•−] గా వ్యక్తీకరించబడింది) యొక్క సిటు హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణలో L-ఆర్నిథైన్ (250 mg/L) యొక్క బాహ్య అప్లికేషన్ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) మరియు O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) చేరడం గణనీయంగా తగ్గిందని వెల్లడించింది, చికిత్స చేయని సోకిన మొక్కలు (వరుసగా 173.31 ± 12.06 మరియు 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) మరియు వాణిజ్య శిలీంద్ర సంహారిణి రిజోలెక్స్-టి (170.12 ± 9.50 మరియు 157.00 ± 7.81) 50 mg/L తో చికిత్స చేయబడిన మొక్కలతో పోలిస్తే. nmol.g−1 fr wt, వరుసగా) 72 గంటల వద్ద. hpt కింద H2O2 మరియు O2•− అధిక స్థాయిలో పేరుకుపోయింది (Fig. 5A, B). అదేవిధంగా, TCA-ఆధారిత మాలోండియాల్డిహైడ్ (MDA) పరీక్షలో S. స్క్లెరోటియోరం-సోకిన బీన్ మొక్కలు వాటి ఆకులలో అధిక స్థాయిలో MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) పేరుకుపోయాయని తేలింది (Fig. 5C). అయితే, L-ఆర్నిథైన్ యొక్క బాహ్య అప్లికేషన్ లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌ను గణనీయంగా తగ్గించింది, చికిత్స చేయబడిన మొక్కలలో MDA కంటెంట్ తగ్గడం ద్వారా ఇది రుజువు చేయబడింది (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
చిత్రం 5. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో ఇన్ఫెక్షన్ తర్వాత 72 గంటలలో S. స్క్లెరోటియోరమ్‌తో సోకిన బీన్ ఆకులలో ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్ రక్షణ విధానాల యొక్క ప్రధాన గుర్తులపై బాహ్య L-ఆర్నిథైన్ అప్లికేషన్ ప్రభావం. (A) 72 hpt వద్ద హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt వద్ద సూపర్ ఆక్సైడ్ అయాన్ (O2•−; nmol g−1 FW) వద్ద, (C) 72 hpt వద్ద మాలోండియాల్డిహైడ్ (MDA; nmol g−1 FW) వద్ద, (D) 72 hpt వద్ద మొత్తం కరిగే ఫినాల్స్ (mg GAE g−1 FW), (E) 72 hpt వద్ద మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్లు (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt వద్ద మొత్తం ఉచిత అమైనో ఆమ్లాలు (mg g−1 FW) మరియు (G) 72 hpt వద్ద ప్రోలిన్ కంటెంట్ (mg g−1 FW). విలువలు 5 జీవ ప్రతిరూపాల (n = 5) సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని (సగటు ± SD) సూచిస్తాయి. చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను వేర్వేరు అక్షరాలు సూచిస్తాయి (p < 0.05).