ఈ వ్యాసం “వ్యాధికారకాలు మరియు తెగుళ్ళకు వ్యతిరేకంగా పప్పుదినుసుల నిరోధకతను మెరుగుపరచడం” అనే పరిశోధన అంశంలో భాగం, మొత్తం 5 వ్యాసాలను చూడండి
నెక్రోసిస్ అనే శిలీంధ్ర మొక్కల వ్యాధికి కారణమైన స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ (లిబ్.) డి బారీ, వివిధ ఆతిథేయ మొక్కలకు సోకడానికి బహుళ-స్థాయి వ్యూహాన్ని ఉపయోగిస్తుంది. సూడోమోనాస్ స్క్లెరోటియోరమ్ వలన కలిగే తెల్ల బూజుకు ఫేసియోలస్ వల్గారిస్ ఎల్. యొక్క అణు, శారీరక మరియు జీవరసాయన ప్రతిస్పందనలను మెరుగుపరచడానికి, ఇతర ఆవశ్యక అమైనో ఆమ్లాల సంశ్లేషణను ప్రేరేపించే ప్రోటీన్-రహిత అమైనో ఆమ్లమైన డైఅమైన్ ఎల్-ఆర్నిథైన్‌ను ఒక ప్రత్యామ్నాయ నిర్వహణ వ్యూహంగా ఉపయోగించాలని ఈ అధ్యయనం ప్రతిపాదిస్తోంది. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాలలో, ఎల్-ఆర్నిథైన్ మోతాదుకు అనుగుణంగా ఎస్. పైరెనోయిడోసా యొక్క మైసీలియల్ పెరుగుదలను గణనీయంగా నిరోధించిందని తేలింది. అంతేకాకుండా, గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో ఇది తెల్ల బూజు తీవ్రతను గణనీయంగా తగ్గించగలిగింది. ఇంకా, ఎల్-ఆర్నిథైన్ చికిత్స పొందిన మొక్కల పెరుగుదలను ప్రేరేపించింది, ఇది పరీక్షించిన ఎల్-ఆర్నిథైన్ గాఢతలు చికిత్స పొందిన మొక్కలకు విషపూరితం కాదని సూచిస్తుంది. దీనికి అదనంగా, ఎల్-ఆర్నిథైన్ ఎంజైమేతర యాంటీఆక్సిడెంట్లు (మొత్తం కరిగే ఫినాలిక్స్ మరియు ఫ్లేవనాయిడ్లు) మరియు ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు (కాటలేస్ (CAT), పెరాక్సిడేస్ (POX), మరియు పాలిఫెనాల్ ఆక్సిడేస్ (PPO)) యొక్క వ్యక్తీకరణను మెరుగుపరిచింది, మరియు మూడు యాంటీఆక్సిడెంట్-సంబంధిత జన్యువుల (PvCAT1, PvSOD, మరియు PvGR) వ్యక్తీకరణను పెంచింది. అంతేకాకుండా, ఇన్ సిలికో విశ్లేషణలో S. sclerotiorum జన్యువులో ఒక ఊహాజనిత ఆక్సలోఅసిటేట్ అసిటైల్‌హైడ్రోలేస్ (SsOAH) ప్రోటీన్ ఉన్నట్లు వెల్లడైంది, ఇది క్రియాత్మక విశ్లేషణ, సంరక్షించబడిన డొమైన్‌లు మరియు టోపాలజీ పరంగా ఆస్పెర్‌గిల్లస్ ఫిజియెన్సిస్ (AfOAH) మరియు పెనిసిలియం sp. (PlOAH) యొక్క ఆక్సలోఅసిటేట్ అసిటైల్‌హైడ్రోలేస్ (SsOAH) ప్రోటీన్‌లను బాగా పోలి ఉంది. ఆసక్తికరంగా, పొటాటో డెక్స్‌ట్రోస్ బ్రాత్ (PDB) మీడియమ్‌కు ఎల్-ఆర్నిథైన్‌ను జోడించడం వల్ల ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్ మైసీలియాలో SsOAH జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది. అదేవిధంగా, చికిత్స పొందిన మొక్కల నుండి సేకరించిన శిలీంధ్ర మైసీలియాలో ఎల్-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం వల్ల SsOAH జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది. చివరగా, ఎల్-ఆర్నిథైన్ ప్రయోగం PDB మీడియమ్ మరియు సోకిన ఆకులు రెండింటిలోనూ ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల స్రావాన్ని గణనీయంగా తగ్గించింది. ముగింపుగా, ఎల్-ఆర్నిథైన్ రెడాక్స్ స్థితిని నిర్వహించడంలో మరియు సోకిన మొక్కల రక్షణ ప్రతిస్పందనను పెంచడంలో కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది. ఈ అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలు తెల్ల బూజును నియంత్రించడానికి మరియు బీన్ ఉత్పత్తి మరియు ఇతర పంటలపై దాని ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వినూత్నమైన, పర్యావరణ అనుకూల పద్ధతులను అభివృద్ధి చేయడంలో సహాయపడవచ్చు.
స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ (లిబ్.) డి బారీ అనే నెక్రోట్రోఫిక్ శిలీంధ్రం వల్ల కలిగే తెల్ల బూజు, ప్రపంచవ్యాప్తంగా బీన్ (ఫేసియోలస్ వల్గారిస్ ఎల్.) ఉత్పత్తికి తీవ్రమైన ముప్పును కలిగించే ఒక వినాశకరమైన, దిగుబడిని తగ్గించే వ్యాధి (బోల్టన్ మరియు ఇతరులు, 2006). స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ అనేది నియంత్రించడానికి అత్యంత కష్టమైన నేల ద్వారా వ్యాపించే శిలీంధ్ర మొక్కల వ్యాధికారకాలలో ఒకటి. ఇది 600 కంటే ఎక్కువ మొక్కల జాతులపై ఆశ్రయం పొందుతుంది మరియు నిర్దిష్టత లేకుండా ఆతిథేయ కణజాలాలను వేగంగా మెత్తగా చేసే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది (లియాంగ్ మరియు రోలిన్స్, 2018). ప్రతికూల పరిస్థితులలో, ఇది తన జీవిత చక్రంలో ఒక క్లిష్టమైన దశలోకి ప్రవేశిస్తుంది. ఈ సమయంలో ఇది నేలలో 'స్క్లెరోటియా' అని పిలువబడే నల్లటి, గట్టి, విత్తనం లాంటి నిర్మాణాల రూపంలో లేదా సోకిన మొక్కల మైసీలియం లేదా కాండం మజ్జలో తెల్లటి, మెత్తటి పెరుగుదలల రూపంలో చాలా కాలం పాటు నిద్రావస్థలో ఉంటుంది (ష్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). S. sclerotiorum స్క్లెరోటియాలను ఏర్పరచగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది, ఇది వ్యాధి సోకిన పొలాలలో ఎక్కువ కాలం జీవించడానికి మరియు వ్యాధి సమయంలో నిలదొక్కుకోవడానికి వీలు కల్పిస్తుంది (ష్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). స్క్లెరోటియాలు పోషకాలతో సమృద్ధిగా ఉంటాయి, నేలలో ఎక్కువ కాలం నిలిచి ఉంటాయి మరియు తదుపరి సంక్రమణలకు ప్రాథమిక బీజాంశంగా పనిచేస్తాయి (ష్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005). అనుకూల పరిస్థితులలో, స్క్లెరోటియాలు మొలకెత్తి గాలిలో తేలియాడే సిద్ధబీజాలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి, ఇవి పువ్వులు, కాండాలు లేదా కాయలతో సహా మొక్క యొక్క భూమిపై ఉన్న అన్ని భాగాలకు వ్యాధిని కలిగించగలవు (ష్వార్ట్జ్ మరియు ఇతరులు, 2005).
స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ తన ఆతిథేయ మొక్కలకు సోకడానికి బహుళ-స్థాయి వ్యూహాన్ని ఉపయోగిస్తుంది, ఇందులో స్క్లెరోటియల్ అంకురోత్పత్తి నుండి లక్షణాల అభివృద్ధి వరకు సమన్వయంతో కూడిన సంఘటనల శ్రేణి ఉంటుంది. ప్రారంభంలో, ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్ అపోథీసియా అని పిలువబడే పుట్టగొడుగు లాంటి నిర్మాణాల నుండి గాలిలో తేలియాడే బీజాలను (ఆస్కోస్పోర్స్ అని పిలుస్తారు) ఉత్పత్తి చేస్తుంది, ఇవి గాలిలో కలిసిపోయి, సోకిన మొక్కల శిథిలాలపై చలనం లేని స్క్లెరోటియాగా అభివృద్ధి చెందుతాయి (బోల్టన్ మరియు ఇతరులు, 2006). ఆ తర్వాత ఈ శిలీంధ్రం, మొక్క కణ గోడ యొక్క pHను నియంత్రించడానికి, ఎంజైమాటిక్ విచ్ఛిన్నతను మరియు కణజాలంలోకి చొచ్చుకుపోవడాన్ని ప్రోత్సహించడానికి (హెగెడస్ మరియు రిమ్మర్, 2005), మరియు ఆతిథేయ మొక్క యొక్క ఆక్సిడేటివ్ బర్స్ట్‌ను అణచివేయడానికి, ఒక విష కారకమైన ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని స్రవిస్తుంది. ఈ ఆమ్లీకరణ ప్రక్రియ మొక్క కణ గోడను బలహీనపరుస్తుంది, ఇది శిలీంధ్ర కణ గోడను విచ్ఛిన్నం చేసే ఎంజైమ్‌ల (CWDEs) సాధారణ మరియు సమర్థవంతమైన పనితీరుకు అనుకూలమైన వాతావరణాన్ని అందిస్తుంది, తద్వారా వ్యాధికారకం భౌతిక అవరోధాన్ని అధిగమించి ఆతిథేయ కణజాలంలోకి చొచ్చుకుపోతుంది (మార్సియానో ​​మరియు ఇతరులు, 1983). ఒకసారి లోపలికి చొచ్చుకుపోయిన తర్వాత, S. sclerotiorum పాలిగాలక్టురోనేస్ మరియు సెల్యులేస్ వంటి అనేక CWDEలను స్రవిస్తుంది, ఇవి సోకిన కణజాలాలలో దాని వ్యాప్తిని సులభతరం చేసి, కణజాల క్షయాన్ని కలిగిస్తాయి. పుండ్లు మరియు హైఫల్ మ్యాట్‌ల పురోగతి తెల్ల బూజు యొక్క లక్షణాలకు దారితీస్తుంది (హెగెడస్ మరియు రిమ్మర్, 2005). అదే సమయంలో, అతిధేయ మొక్కలు పాథోజెన్-అసోసియేటెడ్ మాలిక్యులర్ ప్యాటర్న్‌లను (PAMPs) ప్యాటర్న్ రికగ్నిషన్ రిసెప్టర్స్ (PRRs) ద్వారా గుర్తిస్తాయి, ఇది రక్షణ ప్రతిస్పందనలను అంతిమంగా సక్రియం చేసే సంకేత సంఘటనల శ్రేణిని ప్రేరేపిస్తుంది.
దశాబ్దాలుగా వ్యాధి నియంత్రణ ప్రయత్నాలు జరుగుతున్నప్పటికీ, వ్యాధికారక జీవి యొక్క నిరోధకత, మనుగడ మరియు అనుకూలత కారణంగా, ఇతర వాణిజ్య పంటలలో మాదిరిగానే బీన్స్‌లో కూడా తగినంత నిరోధక జన్యుపదార్థం కొరత కొనసాగుతోంది. అందువల్ల, వ్యాధి నిర్వహణ అత్యంత సవాలుతో కూడుకున్నది మరియు దీనికి సాంస్కృతిక పద్ధతులు, జీవ నియంత్రణ మరియు రసాయన శిలీంధ్రనాశకాల కలయికతో కూడిన ఒక సమగ్ర, బహుముఖ వ్యూహం అవసరం (ఓ'సుల్లివన్ మరియు ఇతరులు, 2021). తెల్ల బూజు తెగులును రసాయన పద్ధతిలో నియంత్రించడం అత్యంత ప్రభావవంతమైనది, ఎందుకంటే శిలీంధ్రనాశకాలను సరిగ్గా మరియు సరైన సమయంలో ప్రయోగించినప్పుడు, అవి వ్యాధి వ్యాప్తిని సమర్థవంతంగా నియంత్రించగలవు, సంక్రమణ తీవ్రతను తగ్గించగలవు మరియు దిగుబడి నష్టాలను కనిష్ట స్థాయికి తగ్గించగలవు. అయితే, శిలీంధ్రనాశకాలను అధికంగా వాడటం మరియు వాటిపై అతిగా ఆధారపడటం వల్ల S. sclerotiorum యొక్క నిరోధక జాతులు ఉద్భవించడానికి దారితీయవచ్చు మరియు ఇది లక్ష్యం కాని జీవులు, నేల ఆరోగ్యం మరియు నీటి నాణ్యతపై ప్రతికూల ప్రభావాన్ని చూపుతుంది (లే కోయింటే మరియు ఇతరులు, 2016; సెరెసిని మరియు ఇతరులు, 2024). అందువల్ల, పర్యావరణ అనుకూల ప్రత్యామ్నాయాలను కనుగొనడం అత్యంత ప్రాధాన్యత సంతరించుకుంది.
పుట్రెసిన్, స్పెర్మిడిన్, స్పెర్మిన్ మరియు కాడవెరిన్ వంటి పాలిమైన్లు (PAs), నేల ద్వారా వ్యాపించే మొక్కల వ్యాధికారకాలకు వ్యతిరేకంగా ఆశాజనకమైన ప్రత్యామ్నాయాలుగా పనిచేస్తాయి, తద్వారా ప్రమాదకరమైన రసాయన శిలీంధ్రనాశకాల వాడకాన్ని పూర్తిగా లేదా పాక్షికంగా తగ్గిస్తాయి (నెహెలా మరియు ఇతరులు, 2024; యి మరియు ఇతరులు, 2024). ఉన్నత శ్రేణి మొక్కలలో, PAs కణ విభజన, భేదీకరణ మరియు నిర్జీవ మరియు జీవ సంబంధిత ఒత్తిళ్లకు ప్రతిస్పందనతో సహా అనేక శారీరక ప్రక్రియలలో పాల్గొంటాయి (కిల్లినీ మరియు నెహెలా, 2020). అవి యాంటీఆక్సిడెంట్లుగా పనిచేయగలవు, రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ స్పీసీస్ (ROS) ను తొలగించడంలో సహాయపడతాయి, రెడాక్స్ హోమియోస్టాసిస్‌ను నిర్వహిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లీనీ, 2023), రక్షణ-సంబంధిత జన్యువులను ప్రేరేపిస్తాయి (రొమెరో మరియు ఇతరులు, 2018), వివిధ జీవక్రియ మార్గాలను నియంత్రిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లీనీ, 2023), అంతర్గత ఫైటోహార్మోన్లను మాడ్యులేట్ చేస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లీనీ, 2019), సిస్టమిక్ అక్వైర్డ్ రెసిస్టెన్స్ (SAR) ను స్థాపిస్తాయి, మరియు మొక్క-వ్యాధికారక పరస్పర చర్యలను నియంత్రిస్తాయి (నెహెలా మరియు కిల్లీనీ, 2020; అసిజా మరియు ఇతరులు, 2022; జెర్వోనిక్, 2022). మొక్కల రక్షణలో PAల యొక్క నిర్దిష్ట యంత్రాంగాలు మరియు పాత్రలు మొక్కల జాతులు, వ్యాధికారకాలు మరియు పర్యావరణ పరిస్థితులపై ఆధారపడి మారుతాయని గమనించడం ముఖ్యం. మొక్కలలో అత్యంత సమృద్ధిగా ఉండే PA, అవసరమైన పాలీఅమైన్ అయిన ఎల్-ఆర్నిథైన్ నుండి జీవసంశ్లేషణ చెందుతుంది (కిల్లీనీ మరియు నెహెలా, 2020).
ఎల్-ఆర్నిథైన్ మొక్కల పెరుగుదల మరియు అభివృద్ధిలో బహుళ పాత్రలను పోషిస్తుంది. ఉదాహరణకు, గత అధ్యయనాలు వరిలో (ఒరైజా సటైవా), ఆర్నిథైన్ నత్రజని పునరుపయోగం (లియు మరియు ఇతరులు, 2018), వరి దిగుబడి, నాణ్యత మరియు సువాసన (లు మరియు ఇతరులు, 2020), మరియు నీటి ఒత్తిడి ప్రతిస్పందన (యాంగ్ మరియు ఇతరులు, 2000)తో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చని చూపించాయి. అంతేకాకుండా, ఎల్-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం వల్ల షుగర్ బీట్ (బీటా వల్గారిస్)లో కరువును తట్టుకునే శక్తి గణనీయంగా పెరిగింది (హుస్సేన్ మరియు ఇతరులు, 2019) మరియు ఉల్లిపాయ (అల్లియం సెపా) (కావుసోగ్లు మరియు కావుసోగ్లు, 2021) మరియు జీడిపప్పు (అనకార్డియం ఆక్సిడెంటల్) మొక్కలలో (డా రోచా మరియు ఇతరులు, 2012) లవణ ఒత్తిడిని తగ్గించింది. అజైవిక ఒత్తిడి నిరోధకతలో ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య పాత్ర, చికిత్స పొందిన మొక్కలలో ప్రోలిన్ చేరడంలో దాని ప్రమేయం వల్ల కావచ్చు. ఉదాహరణకు, ఆర్నిథైన్ డెల్టా అమినోట్రాన్స్‌ఫెరేస్ (డెల్టా-OAT) మరియు ప్రోలిన్ డీహైడ్రోజినేస్ (ProDH1 మరియు ProDH2) జన్యువుల వంటి ప్రోలిన్ జీవక్రియకు సంబంధించిన జన్యువులు, ఆతిథేయేతర సూడోమోనాస్ సిరింగే జాతుల నుండి నికోటియానా బెంథమియానా మరియు అరబిడోప్సిస్ థాలియానాలను రక్షించడంలో పాలుపంచుకుంటాయని గతంలో నివేదించబడింది (సెంథిల్-కుమార్ మరియు మైసూర్, 2012). మరోవైపు, వ్యాధికారక పెరుగుదలకు శిలీంధ్ర ఆర్నిథైన్ డీకార్బాక్సిలేస్ (ODC) అవసరం (సింగ్ మరియు ఇతరులు, 2020). హోస్ట్-ఇండ్యూస్డ్ జీన్ సైలెన్సింగ్ (HIGS) ద్వారా ఫ్యూసేరియం ఆక్సిస్పోరమ్ ఎఫ్. ఎస్పి. లైకోపెర్సిసి యొక్క ODCని లక్ష్యంగా చేసుకోవడం, ఫ్యూసేరియం విల్ట్‌కు వ్యతిరేకంగా టమాటా మొక్కల నిరోధకతను గణనీయంగా పెంచింది (సింగ్ మరియు ఇతరులు, 2020). అయితే, వృక్ష వ్యాధికారకాల వంటి జీవ సంబంధిత ఒత్తిడులకు వ్యతిరేకంగా బాహ్యంగా ప్రయోగించే ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య పాత్రపై పెద్దగా అధ్యయనం జరగలేదు. మరింత ముఖ్యంగా, వ్యాధి నిరోధకతపై ఆర్నిథైన్ ప్రభావాలు మరియు దానికి సంబంధించిన జీవరసాయన మరియు శారీరక దృగ్విషయాలు చాలా వరకు అన్వేషించబడలేదు.
పప్పుదినుసు పంటలకు సోకే స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ (S. sclerotiorum) సంక్రమణ సంక్లిష్టతను అర్థం చేసుకోవడం, సమర్థవంతమైన నియంత్రణ వ్యూహాలను అభివృద్ధి చేయడానికి చాలా ముఖ్యం. ఈ అధ్యయనంలో, స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ సంక్రమణకు వ్యతిరేకంగా పప్పుదినుసు మొక్కల రక్షణ యంత్రాంగాలను మరియు నిరోధకతను పెంచడంలో కీలకమైన కారకంగా డైఅమైన్ ఎల్-ఆర్నిథైన్ (L-ornithine) యొక్క సంభావ్య పాత్రను గుర్తించడమే మా లక్ష్యం. వ్యాధి సోకిన మొక్కల రక్షణ ప్రతిస్పందనలను పెంచడంతో పాటు, ఎల్-ఆర్నిథైన్ రెడాక్స్ (redox) స్థితిని నిర్వహించడంలో కూడా కీలక పాత్ర పోషిస్తుందని మేము ఊహిస్తున్నాము. ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క సంభావ్య ప్రభావాలు, ఎంజైమాటిక్ మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్ రక్షణ యంత్రాంగాల నియంత్రణకు, మరియు శిలీంధ్ర వ్యాధికారకత/విషపూరిత కారకాలు మరియు సంబంధిత ప్రోటీన్‌లతో జోక్యానికి సంబంధించినవని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము. ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క ఈ ద్వంద్వ కార్యాచరణ, తెల్ల బూజు ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి మరియు ఈ శక్తివంతమైన శిలీంధ్ర వ్యాధికారకానికి వ్యతిరేకంగా సాధారణ పప్పుదినుసు పంటల నిరోధకతను పెంచడానికి ఒక సుస్థిరమైన వ్యూహంగా దీనిని ఆశాజనకమైన అభ్యర్థిగా నిలుపుతుంది. ప్రస్తుత అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలు, తెల్ల బూజును నియంత్రించడానికి మరియు పప్పుదినుసు ఉత్పత్తిపై దాని ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వినూత్నమైన, పర్యావరణ అనుకూల పద్ధతులను అభివృద్ధి చేయడంలో సహాయపడవచ్చు.
ఈ అధ్యయనంలో, గిజా 3 (ఫేసియోలస్ వల్గారిస్ ఎల్. సివి. గిజా 3) అనే సున్నితమైన వాణిజ్య రకానికి చెందిన సాధారణ బీన్‌ను ప్రయోగాత్మక పదార్థంగా ఉపయోగించారు. ఈజిప్ట్‌లోని అగ్రికల్చరల్ రీసెర్చ్ సెంటర్ (ARC)కి చెందిన ఫీల్డ్ క్రాప్స్ రీసెర్చ్ ఇన్‌స్టిట్యూట్ (FCRI)లోని లెగ్యూమ్ రీసెర్చ్ డిపార్ట్‌మెంట్ వారు ఆరోగ్యకరమైన విత్తనాలను దయతో అందించారు. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో (25 ± 2 °C, సాపేక్ష ఆర్ద్రత 75 ± 1%, 8 గంటల కాంతి/16 గంటల చీకటి), S. స్క్లెరోటియోరమ్ సోకిన మట్టితో నింపిన ప్లాస్టిక్ కుండీలలో (లోపలి వ్యాసం 35 సెం.మీ., లోతు 50 సెం.మీ.) ఐదు విత్తనాలను నాటారు. విత్తనాలు నాటిన 7–10 రోజుల తర్వాత (DPS), ప్రతి కుండీలో సమానంగా పెరిగి, మూడు పూర్తిగా వికసించిన ఆకులతో ఉన్న రెండు మొక్కలను మాత్రమే ఉంచి, మిగిలిన నారుమొక్కలను తీసివేశారు. కుండీలలోని అన్ని మొక్కలకు ప్రతి రెండు వారాలకు ఒకసారి నీరు పెట్టారు మరియు ఆయా రకానికి సిఫార్సు చేయబడిన మోతాదులో నెలవారీగా ఎరువులు వేశారు.
500 mg/L గాఢత గల ఎల్-ఆర్నిథిన్‌డైఅమైన్ (దీనిని (+)-(S)-2,5-డైఅమినోపెంటనోయిక్ ఆమ్లం అని కూడా పిలుస్తారు; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) ను తయారు చేయడానికి, మొదట 50 mg ను 100 mL శుభ్రమైన స్వేదన జలంలో కరిగించారు. ఆ తర్వాత స్టాక్ ద్రావణాన్ని పలుచబరిచి, తదుపరి ప్రయోగాలలో ఉపయోగించారు. క్లుప్తంగా, ఆరు శ్రేణుల ఎల్-ఆర్నిథిన్ గాఢతలను (12.5, 25, 50, 75, 100, మరియు 125 mg/L) ఇన్ విట్రోలో పరీక్షించారు. అదనంగా, శుభ్రమైన స్వేదన జలాన్ని నెగటివ్ కంట్రోల్ (మాక్) గా మరియు వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకం “రిజోలెక్స్-టి” 50% వెట్టబుల్ పౌడర్ (టోక్లోఫాస్-మిథైల్ 20% + థిరామ్ 30%; KZ-కాఫర్ ఎల్ జాయత్ పెస్టిసైడ్స్ అండ్ కెమికల్స్ కంపెనీ, కాఫర్ ఎల్ జాయత్, ఘర్బియా గవర్నరేట్, ఈజిప్ట్) ను పాజిటివ్ కంట్రోల్ గా ఉపయోగించారు. వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకం “రిజోలెక్స్-టి”ని ఐదు గాఢతలలో (2, 4, 6, 8 మరియు 10 mg/L) ఇన్ విట్రోలో పరీక్షించారు.
వాణిజ్య క్షేత్రాల నుండి, తెల్ల బూజు యొక్క విలక్షణ లక్షణాలను (సోకిన రేటు: 10–30%) చూపిస్తున్న సాధారణ బీన్ కాండాలు మరియు కాయల నమూనాలను సేకరించారు. సోకిన మొక్కల పదార్థాలలో చాలా వరకు జాతి/రకం ద్వారా గుర్తించబడినప్పటికీ (సున్నితమైన వాణిజ్య రకం గిజా 3), మిగిలినవి, ముఖ్యంగా స్థానిక మార్కెట్ల నుండి పొందినవి, తెలియని జాతికి చెందినవి. సేకరించిన సోకిన పదార్థాలను మొదట 0.5% సోడియం హైపోక్లోరైట్ ద్రావణంతో 3 నిమిషాల పాటు ఉపరితలంపై క్రిమిరహితం చేసి, ఆపై అదనపు నీటిని తొలగించడానికి శుభ్రమైన స్వేదన జలంతో అనేకసార్లు కడిగి, శుభ్రమైన ఫిల్టర్ పేపర్‌తో పొడిగా తుడిచారు. ఆ తర్వాత సోకిన భాగాలను మధ్య కణజాలం నుండి (ఆరోగ్యకరమైన మరియు సోకిన కణజాలాల మధ్య) చిన్న ముక్కలుగా కత్తిరించి, పొటాటో డెక్స్‌ట్రోస్ అగర్ (PDA) మాధ్యమంలో కల్చర్ చేసి, స్క్లెరోటియా ఏర్పడటాన్ని ప్రేరేపించడానికి 5 రోజుల పాటు 12 గంటల కాంతి/12 గంటల చీకటి చక్రంతో 25 ± 2 °C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మిశ్రమ లేదా కలుషితమైన కల్చర్‌ల నుండి శిలీంధ్ర ఐసోలేట్‌లను శుద్ధి చేయడానికి మైసీలియల్ టిప్ పద్ధతిని కూడా ఉపయోగించారు. శుద్ధి చేయబడిన శిలీంధ్ర ఐసోలేట్‌ను మొదట దాని సాంస్కృతిక స్వరూప లక్షణాల ఆధారంగా గుర్తించి, ఆపై సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాల ఆధారంగా అది S. sclerotiorum అని నిర్ధారించారు. చివరగా, కోచ్ ప్రతిపాదనలను నెరవేర్చడానికి, శుద్ధి చేయబడిన అన్ని ఐసోలేట్‌లను సున్నితమైన సాధారణ బీన్ రకం గిజా 3 పై వ్యాధికారకత కోసం పరీక్షించారు.
అదనంగా, వైట్ మరియు ఇతరులు, 1990; బటురో-సీస్నివ్స్కా మరియు ఇతరులు, 2017 వివరించిన విధంగా ఇంటర్నల్ ట్రాన్స్క్రైబ్డ్ స్పేసర్ (ITS) సీక్వెన్సింగ్ ఆధారంగా అత్యంత ఇన్వాసివ్ S. sclerotiorum ఐసోలేట్ (ఐసోలేట్ #3) మరింతగా నిర్ధారించబడింది. క్లుప్తంగా, ఐసోలేట్‌లను పొటాటో డెక్స్‌ట్రోస్ బ్రాత్ (PDB)లో కల్చర్ చేసి, 5–7 రోజుల పాటు 25 ± 2 °C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఆ తర్వాత ఫంగల్ మైసీలియంను సేకరించి, చీజ్‌క్లాత్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేసి, స్టెరైల్ వాటర్‌తో రెండుసార్లు కడిగి, స్టెరైల్ ఫిల్టర్ పేపర్‌తో ఆరబెట్టారు. క్విక్-DNA™ ఫంగల్/బ్యాక్టీరియల్ మినీప్రెప్ కిట్ (కురమే-ఇజియోకా, 1997; అటల్లా మరియు ఇతరులు, 2022, 2024) ఉపయోగించి జెనోమిక్ DNAను వేరు చేశారు. ఆ తర్వాత, ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; అంచనా పరిమాణం: 540 bp) అనే నిర్దిష్ట ప్రైమర్ జతను ఉపయోగించి ITS rDNA ప్రాంతాన్ని విస్తరించారు (బటురో-సీస్నియెవ్స్కా మరియు ఇతరులు, 2017). శుద్ధి చేసిన PCR ఉత్పత్తులను సీక్వెన్సింగ్ కోసం సమర్పించారు (బీజింగ్ ఆవోకే డింగ్‌షెంగ్ బయోటెక్నాలజీ కో., లిమిటెడ్.). ITS rDNA సీక్వెన్సులను సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి ద్విదిశాత్మకంగా సీక్వెన్స్ చేశారు. ఆ తర్వాత, సమీకరించిన క్వెరీ సీక్వెన్సులను BLASTn సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి జెన్‌బ్యాంక్ మరియు నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)లోని తాజా డేటాతో పోల్చారు. మాలిక్యులర్ ఎవల్యూషనరీ జెనెటిక్స్ అనాలిసిస్ ప్యాకేజీ (MEGA-11; వెర్షన్ 11) (కుమార్ మరియు ఇతరులు, 2024) లోని ClustalW ను ఉపయోగించి, క్వెరీ సీక్వెన్స్‌ను NCBI జెన్‌బ్యాంక్‌లోని తాజా డేటా నుండి పొందిన 20 ఇతర S. sclerotiorum స్ట్రెయిన్‌లు/ఐసోలేట్‌లతో (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1) పోల్చారు. గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతి మరియు సాధారణ సమయ-తిరిగి మార్చగల న్యూక్లియోటైడ్ ప్రత్యామ్నాయ నమూనా (నీ మరియు కుమార్, 2000) ఉపయోగించి పరిణామ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. అత్యధిక లాగ్-లైక్‌లిహుడ్ ఉన్న ట్రీ చూపబడింది. నైబర్-జాయినింగ్ (NJ) ట్రీ (కుమార్ మరియు ఇతరులు, 2024) మరియు గరిష్ట పార్సిమోనీ (MP) ట్రీల మధ్య అధిక లాగ్-లైక్‌లిహుడ్ ఉన్న ట్రీని ఎంచుకోవడం ద్వారా హ్యూరిస్టిక్ సెర్చ్ కోసం ప్రారంభ ట్రీ ఎంపిక చేయబడింది. సాధారణ సమయ-తిరిగి మార్చగల నమూనా (నీ మరియు కుమార్, 2000) ఉపయోగించి లెక్కించిన జతవారీ దూర మాత్రికను ఉపయోగించి NJ ట్రీ నిర్మించబడింది.
ఎల్-ఆర్నిథైన్ మరియు బాక్టీరిసైడ్ "రిజోలెక్స్-టి" యొక్క యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను ఇన్ విట్రోలో అగర్ డిఫ్యూజన్ పద్ధతి ద్వారా నిర్ధారించారు. పద్ధతి: ఎల్-ఆర్నిథైన్ (500 మి.గ్రా/లీ) యొక్క స్టాక్ ద్రావణం నుండి తగినంత పరిమాణాన్ని తీసుకుని, దానిని 10 మి.లీ పిడిఎ న్యూట్రియెంట్ మీడియంతో పూర్తిగా కలిపి, వరుసగా 12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 మి.గ్రా/లీ తుది గాఢతలతో ద్రావణాలను తయారు చేశారు. ఫంగిసైడ్ "రిజోలెక్స్-టి" యొక్క ఐదు గాఢతలను (2, 4, 6, 8 మరియు 10 మి.గ్రా/లీ) మరియు స్టెరైల్ డిస్టిల్డ్ వాటర్‌ను కంట్రోల్‌గా ఉపయోగించారు. మీడియం గట్టిపడిన తర్వాత, 4 మి.మీ వ్యాసం కలిగిన, స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ కల్చర్ యొక్క తాజాగా తయారుచేసిన మైసీలియల్ ప్లగ్‌ను పెట్రీ డిష్ మధ్యలోకి మార్చి, మైసీలియం మొత్తం కంట్రోల్ పెట్రీ డిష్‌ను కప్పే వరకు 25±2°C వద్ద కల్చర్ చేశారు, ఆ తర్వాత ఫంగల్ పెరుగుదలను నమోదు చేశారు. సమీకరణం 1 ఉపయోగించి S. sclerotiorum యొక్క వ్యాసార్ధ పెరుగుదల నిరోధక శాతాన్ని లెక్కించండి:
ఈ ప్రయోగాన్ని రెండుసార్లు పునరావృతం చేశారు, ప్రతి నియంత్రణ/ప్రయోగాత్మక సమూహానికి ఆరు జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాలు మరియు ప్రతి జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపానికి ఐదు కుండీలు (ఒక్కో కుండీకి రెండు మొక్కలు) ఉండేలా చూశారు. ప్రయోగాత్మక ఫలితాల యొక్క ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి ప్రతి జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాన్ని రెండుసార్లు (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు) విశ్లేషించారు. అదనంగా, సగం-గరిష్ట నిరోధక గాఢత (IC50) మరియు IC99 (ప్రెంటిస్, 1976) లను లెక్కించడానికి ప్రోబిట్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణను ఉపయోగించారు.
గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, వరుసగా రెండు కుండీ ప్రయోగాలు నిర్వహించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, కుండీలను క్రిమిరహితం చేసిన బంకమట్టి-ఇసుక మట్టితో (3:1) నింపి, తాజాగా తయారుచేసిన ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్ కల్చర్‌తో ఇనాక్యులేట్ చేశారు. మొదట, ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్ యొక్క అత్యంత వ్యాప్తి చెందే ఐసోలేట్ (ఐసోలేట్ #3) యొక్క ఒక స్క్లెరోటియంను సగానికి కత్తిరించి, దానిని ఒక PDA మీద బోర్లా ఉంచి, మైసీలియల్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించడానికి 4 రోజుల పాటు 25°C వద్ద నిరంతర చీకటిలో (24 గంటలు) ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా కల్చర్ చేశారు. ఆ తర్వాత, అగ్రభాగం నుండి 5 మి.మీ వ్యాసం గల నాలుగు అగర్ ప్లగ్‌లను తీసుకుని, 100 గ్రాముల క్రిమిరహిత గోధుమ మరియు బియ్యపు తవుడు (1:1, v/v) మిశ్రమంతో ఇనాక్యులేట్ చేశారు. స్క్లెరోటియా ఏర్పడటాన్ని ప్రేరేపించడానికి అన్ని ఫ్లాస్క్‌లను 5 రోజుల పాటు 12 గంటల కాంతి/12 గంటల చీకటి చక్రం కింద 25 ± 2 °C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మట్టిని జోడించే ముందు సజాతీయతను నిర్ధారించడానికి అన్ని ఫ్లాస్క్‌లలోని పదార్థాలను పూర్తిగా కలిపారు. తరువాత, వ్యాధికారకాల సాంద్రత స్థిరంగా ఉండేలా చూసుకోవడానికి ప్రతి కుండీలో 100 గ్రాముల కాలనీకరణ ఊక మిశ్రమాన్ని కలిపారు. శిలీంధ్ర పెరుగుదలను ఉత్తేజపరిచేందుకు, టీకాలు వేసిన కుండీలకు నీరు పోసి, 7 రోజుల పాటు గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో ఉంచారు.
ఆ తర్వాత ప్రతి కుండీలో గిజా 3 రకానికి చెందిన ఐదు విత్తనాలను నాటారు. ఎల్-ఆర్నిథైన్ మరియు రైజోలెక్స్-టి అనే శిలీంధ్రనాశకంతో శుద్ధి చేసిన కుండీల కోసం, క్రిమిరహితం చేసిన విత్తనాలను మొదటగా, వరుసగా సుమారు 250 mg/L మరియు 50 mg/L తుది IC99 గాఢత కలిగిన ఆ రెండు సమ్మేళనాల జల ద్రావణంలో రెండు గంటలపాటు నానబెట్టి, ఆ తర్వాత నాటడానికి ముందు ఒక గంటపాటు గాలిలో ఆరబెట్టారు. మరోవైపు, నెగటివ్ కంట్రోల్‌గా విత్తనాలను క్రిమిరహిత స్వేదన జలంలో నానబెట్టారు. 10 రోజుల తర్వాత, మొదటిసారి నీరు పెట్టడానికి ముందు, ప్రతి కుండీలో కేవలం రెండు చక్కని మొలకలు మాత్రమే ఉండేలా మిగిలిన నారుమొక్కలను పలుచగా చేశారు. అదనంగా, ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్‌తో సంక్రమణను నిర్ధారించడానికి, ఒకే అభివృద్ధి దశలో (10 రోజులు) ఉన్న బీన్ మొక్కల కాండాలను క్రిమిరహితం చేసిన స్కాల్పెల్ ఉపయోగించి రెండు వేర్వేరు ప్రదేశాలలో కోసి, ప్రతి గాయంలో సుమారు 0.5 గ్రాముల కాలనైజింగ్ ఊక మిశ్రమాన్ని ఉంచారు. ఆ తర్వాత, టీకాలు వేసిన అన్ని మొక్కలలో సంక్రమణ మరియు వ్యాధి అభివృద్ధిని ప్రేరేపించడానికి అధిక తేమను కల్పించారు. నియంత్రణ మొక్కలకు కూడా అదే విధంగా గాయాలు చేసి, సమాన పరిమాణంలో (0.5 గ్రా) క్రిమిరహితమైన, కాలనీలు ఏర్పడని ఊక మిశ్రమాన్ని గాయంలో ఉంచి, వ్యాధి అభివృద్ధికి అనువైన వాతావరణాన్ని అనుకరించడానికి మరియు చికిత్సా సమూహాల మధ్య స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి అధిక తేమ కింద ఉంచారు.
చికిత్సా విధానం: బీన్ నారుమొక్కలకు 500 మి.లీ. ఎల్-ఆర్నిథైన్ (250 మి.గ్రా/లీ) జల ద్రావణం లేదా రైజోలెక్స్-టి (50 మి.గ్రా/లీ) అనే శిలీంధ్రనాశకంతో నేలకు నీరు పెట్టారు, ఆ తర్వాత ఈ చికిత్సను 10 రోజుల వ్యవధిలో మూడుసార్లు పునరావృతం చేశారు. ప్లేసిబోతో చికిత్స పొందిన నియంత్రణ మొక్కలకు 500 మి.లీ. శుభ్రమైన స్వేదన జలంతో నీరు పెట్టారు. అన్ని చికిత్సలను గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో (25 ± 2°C, 75 ± 1% సాపేక్ష ఆర్ద్రత, మరియు 8 గంటల కాంతి/16 గంటల చీకటి ఫోటోపీరియడ్) నిర్వహించారు. అన్ని కుండీలకు పక్షం రోజులకు ఒకసారి నీరు పెట్టారు మరియు నిర్దిష్ట రకానికి సంబంధించిన సిఫార్సులు మరియు తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, 3–4 గ్రా/లీ గాఢతలో సమతుల్య NPK ఎరువును (20-20-20, 3.6% సల్ఫర్ మరియు TE సూక్ష్మ మూలకాలతో; జైన్ సీడ్స్, ఈజిప్ట్) ఆకులపై పిచికారీ చేయడం ద్వారా నెలవారీగా చికిత్స చేశారు. వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే, చికిత్స తర్వాత 72 గంటలకు (hpt) ప్రతి జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపం నుండి పూర్తిగా వికసించిన పరిపక్వ ఆకులను (పై నుండి 2వ మరియు 3వ ఆకులు) సేకరించి, ఏకరీతిగా చేసి, కలిపి, తదుపరి విశ్లేషణల కోసం -80 °C వద్ద నిల్వ చేశారు. ఈ విశ్లేషణలలో ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి సూచికల యొక్క ఇన్ సిటు హిస్టోకెమికల్ స్థానికీకరణ, లిపిడ్ పెరాక్సీకరణ, ఎంజైమాటిక్ మరియు నాన్-ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్లు మరియు జన్యు వ్యక్తీకరణ వంటివి ఉన్నాయి, కానీ వీటికి మాత్రమే పరిమితం కాదు.
టెరాన్ మరియు ఇతరులు (2006) సవరించిన పెట్జోల్డ్ట్ మరియు డిక్సన్ స్కేల్ (1996) ఆధారంగా, 1–9 స్కేల్ (అనుబంధ పట్టిక S2) ఉపయోగించి, టీకా వేసిన 21 రోజుల తర్వాత (dpi) ప్రతి వారం తెల్ల బూజు సంక్రమణ తీవ్రతను అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, బీన్ మొక్కల కాండాలు మరియు కొమ్మలను టీకా వేసిన ప్రదేశం నుండి పరిశీలించడం ప్రారంభించి, కణుపుల మధ్య మరియు కణుపుల వెంట మచ్చలు ఎలా వ్యాపిస్తున్నాయో గమనించారు. ఆ తర్వాత, టీకా వేసిన ప్రదేశం నుండి కాండం లేదా కొమ్మ వెంట ఉన్న చివరి బిందువు వరకు మచ్చ యొక్క దూరాన్ని కొలిచి, మచ్చ ఉన్న ప్రదేశం ఆధారంగా 1–9 స్కోరును కేటాయించారు, ఇక్కడ (1) టీకా వేసిన ప్రదేశం దగ్గర ఎటువంటి సంక్రమణ కనిపించకపోవడాన్ని సూచిస్తుంది మరియు (2–9) మచ్చ పరిమాణంలో క్రమంగా పెరుగుదల మరియు కణుపులు/కణుపుల మధ్య వ్యాప్తిని సూచిస్తుంది (అనుబంధ పట్టిక S2). ఆ తర్వాత తెల్ల బూజు సంక్రమణ తీవ్రతను ఫార్ములా 2 ఉపయోగించి శాతంగా మార్చారు:
అదనంగా, వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ కింద ఉన్న ప్రాంతం (AUDPC)ను (షానర్ మరియు ఫిన్నీ, 1977) సూత్రాన్ని ఉపయోగించి లెక్కించారు, దీనిని ఇటీవల సమీకరణం 3 ఉపయోగించి సాధారణ బీన్ యొక్క తెల్ల కుళ్ళు కోసం స్వీకరించారు (చౌహాన్ మరియు ఇతరులు., 2020):
ఇక్కడ Yi = ti సమయంలో వ్యాధి తీవ్రత, Yi+1 = తదుపరి ti+1 సమయంలో వ్యాధి తీవ్రత, ti = మొదటి కొలత సమయం (రోజులలో), ti+1 = తదుపరి కొలత సమయం (రోజులలో), n = మొత్తం సమయ బిందువులు లేదా పరిశీలన బిందువుల సంఖ్య. మొక్క ఎత్తు (సెం.మీ.), మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య, మరియు మొక్కకు ఆకుల సంఖ్యతో సహా బీన్ మొక్క పెరుగుదల పారామితులను అన్ని జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాలలో 21 రోజుల పాటు వారానికోసారి నమోదు చేశారు.
ప్రతి జీవసంబంధమైన పునరావృతంలో, చికిత్స తర్వాత 45వ రోజున (చివరి చికిత్స తర్వాత 15 రోజులు) ఆకు నమూనాలను (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) సేకరించారు. ప్రతి జీవసంబంధమైన పునరావృతంలో ఐదు కుండీలు (ఒక్కో కుండీకి రెండు మొక్కలు) ఉన్నాయి. సుమారు 500 mg నలిపిన కణజాలాన్ని, 4 °C వద్ద చీకటిలో 80% అసిటోన్‌ను ఉపయోగించి కిరణజన్య సంయోగ వర్ణద్రవ్యాలను (క్లోరోఫిల్ ఎ, క్లోరోఫిల్ బి మరియు కెరోటినాయిడ్లు) సంగ్రహించడానికి ఉపయోగించారు. 24 గంటల తర్వాత, నమూనాలను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించారు. (లిచ్టెంతలర్, 1987) పద్ధతి ప్రకారం, మూడు వేర్వేరు తరంగదైర్ఘ్యాల (A470, A646 మరియు A663 nm) వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి కలరిమెట్రిక్‌గా క్లోరోఫిల్ ఎ, క్లోరోఫిల్ బి మరియు కెరోటినాయిడ్ల పరిమాణాలను నిర్ధారించారు. చివరగా, లిచ్టెంతలర్ (1987) వివరించిన క్రింది సూత్రాలు 4–6 ఉపయోగించి కిరణజన్య సంయోగ వర్ణద్రవ్యాల పరిమాణాన్ని లెక్కించారు.
చికిత్స తర్వాత 72 గంటలకు (hpt), హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ (H2O2) మరియు సూపర్‌ఆక్సైడ్ అయాన్ (O2•−) యొక్క ఇన్ సిటు హిస్టోకెమికల్ స్థానీకరణ కోసం ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్ నుండి ఆకులను (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) సేకరించారు. ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లో ఐదు కుండీలు (ఒక్కో కుండీకి రెండు మొక్కలు) ఉన్నాయి. పద్ధతి యొక్క ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌ను రెండుసార్లు (రెండు టెక్నికల్ రెప్లికేట్‌లు) విశ్లేషించారు. H2O2 మరియు O2•− లను వరుసగా 0.1% 3,3′-డయామినోబెంజిడిన్ (DAB; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) లేదా నైట్రోబ్లూ టెట్రాజోలియం (NBT; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి, రొమెరో-ప్యూర్టాస్ మరియు ఇతరులు (2004) మరియు ఆడమ్ మరియు ఇతరులు (1989) వివరించిన పద్ధతులను స్వల్ప మార్పులతో అనుసరించి నిర్ధారించారు. యథాస్థానంలో H2O2 యొక్క హిస్టోకెమికల్ స్థాన నిర్ధారణ కోసం, పత్రకాలను 10 mM ట్రిస్ బఫర్ (pH 7.8)లో 0.1% DABతో వాక్యూమ్ ఇన్ఫిల్ట్రేషన్ చేసి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 60 నిమిషాల పాటు కాంతిలో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. పత్రకాలను 4:1 (v/v) ఇథనాల్:క్లోరోఫామ్ (అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్)లో 0.15% (v/v) TCAతో బ్లీచ్ చేసి, ఆపై అవి నల్లబడే వరకు కాంతికి గురిచేశారు. అదేవిధంగా, యథాస్థానంలో O2•− యొక్క హిస్టోకెమికల్ స్థాన నిర్ధారణ కోసం, కవాటాలను 0.1 w/v % HBT కలిగిన 10 mM పొటాషియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 7.8)తో వాక్యూమ్ ఇన్ఫిల్ట్రేషన్ చేశారు. పత్రకాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 20 నిమిషాల పాటు కాంతిలో ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై పైన చెప్పిన విధంగా బ్లీచ్ చేసి, ముదురు నీలం/ఊదా రంగు మచ్చలు కనిపించే వరకు కాంతికి గురిచేశారు. ఫలితంగా ఏర్పడిన గోధుమ రంగు (H2O2 సూచికగా) లేదా నీలి-ఊదా రంగు (O2•− సూచికగా) యొక్క తీవ్రతను ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ ప్యాకేజీ ImageJ (http://fiji.sc; 7 మార్చి 2024న యాక్సెస్ చేయబడింది) యొక్క ఫీజీ వెర్షన్‌ను ఉపయోగించి అంచనా వేశారు.
మలోండియాల్డిహైడ్ (MDA; లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్‌కు సూచికగా)ను డు మరియు బ్రామ్‌లేజ్ (1992) పద్ధతి ప్రకారం, స్వల్ప మార్పులతో నిర్ధారించారు. ప్రతి జీవసంబంధ ప్రతిరూపం నుండి ఆకులను (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) చికిత్స తర్వాత 72 గంటలకు (hpt) సేకరించారు. ప్రతి జీవసంబంధ ప్రతిరూపంలో ఐదు కుండీలు (ఒక్కో కుండీకి రెండు మొక్కలు) ఉన్నాయి. పద్ధతి యొక్క ఖచ్చితత్వం, విశ్వసనీయత మరియు పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి ప్రతి జీవసంబంధ ప్రతిరూపాన్ని రెండుసార్లు (రెండు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు) విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, 0.01% బ్యూటిలేటెడ్ హైడ్రాక్సీటొలుయీన్ (BHT; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) కలిగిన 20% ట్రైక్లోరోఎసిటిక్ ఆమ్లం (TCA; మిల్లిపోర్‌సిగ్మా, బర్లింగ్‌టన్, MA, USA)తో MDA సంగ్రహణ కోసం 0.5 గ్రాముల పొడి చేసిన ఆకు కణజాలాన్ని ఉపయోగించారు. ఆ తర్వాత, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 532 మరియు 600 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను కొలవడం ద్వారా సూపర్నాటెంట్‌లోని MDA కంటెంట్‌ను కలరిమెట్రిక్‌గా నిర్ధారించి, nmol g−1 FWగా వ్యక్తీకరించారు.
ఎంజైమేతర మరియు ఎంజైమాటిక్ యాంటీఆక్సిడెంట్ల అంచనా కోసం, చికిత్స తర్వాత 72 గంటలకు (hpt) ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్ నుండి ఆకులను (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) సేకరించారు. ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లో ఐదు కుండీలు (ఒక్కో కుండీకి రెండు మొక్కలు) ఉన్నాయి. ప్రతి బయోలాజికల్ నమూనాను రెండుసార్లు (రెండు టెక్నికల్ నమూనాలు) విశ్లేషించారు. రెండు ఆకులను ద్రవ నత్రజనితో రుబ్బి, ఎంజైమాటిక్ మరియు ఎంజైమేతర యాంటీఆక్సిడెంట్లు, మొత్తం అమైనో ఆమ్లాలు, ప్రోలిన్ కంటెంట్, జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు ఆక్సలేట్ పరిమాణాన్ని నిర్ధారించడానికి నేరుగా ఉపయోగించారు.
కహోనెన్ మరియు ఇతరులు (1999) వివరించిన పద్ధతిలో స్వల్ప మార్పులు చేసి, ఫోలిన్-సియోకాల్ట్యూ రియేజెంట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) ఉపయోగించి మొత్తం కరిగే ఫినాలిక్‌లను నిర్ధారించారు. క్లుప్తంగా, సుమారు 0.1 గ్రాముల ఏకరీతిగా చేసిన ఆకు కణజాలాన్ని 20 మి.లీ 80% మిథనాల్‌తో 24 గంటల పాటు చీకటిలో సంగ్రహించి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించారు. 0.1 మి.లీ నమూనా సంగ్రహణను 0.5 మి.లీ ఫోలిన్-సియోకాల్ట్యూ రియేజెంట్ (10%)తో కలిపి, 30 సెకన్ల పాటు కదిలించి, 5 నిమిషాల పాటు చీకటిలో ఉంచారు. ఆ తర్వాత ప్రతి ట్యూబ్‌కు 0.5 మి.లీ 20% సోడియం కార్బోనేట్ ద్రావణాన్ని (Na2CO3; అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్ కంపెనీ, కైరో, ఈజిప్ట్) జోడించి, పూర్తిగా కలిపి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 765 nm వద్ద చర్య మిశ్రమం యొక్క శోషణను కొలిచారు. నమూనా సారాలలో మొత్తం కరిగే ఫినాల్స్ యొక్క గాఢతను గాలిక్ యాసిడ్ క్రమాంకన వక్రరేఖ (ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) ఉపయోగించి నిర్ణయించారు మరియు దానిని ప్రతి గ్రాము తాజా బరువుకు మిల్లీగ్రాముల గాలిక్ యాసిడ్ సమానంగా (mg GAE g-1 తాజా బరువు) వ్యక్తీకరించారు.
మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్ కంటెంట్‌ను జెరిడాన్ మరియు ఇతరుల (2006) పద్ధతి ప్రకారం, స్వల్ప మార్పులతో నిర్ణయించారు. క్లుప్తంగా, పైన పేర్కొన్న 0.3 మి.లీ. మెథనాల్ సారాన్ని 0.3 మి.లీ. 5% అల్యూమినియం క్లోరైడ్ ద్రావణంతో (AlCl3; ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) కలిపి, వేగంగా కలియబెట్టి, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. తరువాత, 0.3 మి.లీ. 10% పొటాషియం అసిటేట్ ద్రావణాన్ని (అల్-గోమ్హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్) కలిపి, పూర్తిగా మిశ్రమం చేసి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి రియాక్షన్ మిశ్రమం యొక్క అబ్సార్బెన్స్‌ను 430 nm వద్ద కొలిచారు. నమూనా సారాలలో మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్ల గాఢతను రూటిన్ క్రమాంకన వక్రరేఖ (TCI అమెరికా, పోర్ట్‌ల్యాండ్, OR, USA) ఉపయోగించి నిర్ధారించి, ఆపై దానిని ప్రతి గ్రాము తాజా బరువుకు మిల్లీగ్రాముల రూటిన్ సమానంగా (mg RE g-1 తాజా బరువు) వ్యక్తీకరించారు.
యోకోయామా మరియు హిరామాట్సు (2003) ప్రతిపాదించిన మరియు సన్ మరియు ఇతరులు (2006) సవరించిన పద్ధతి ఆధారంగా, సవరించిన నిన్హైడ్రిన్ రియేజెంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్థమ్, MA, USA) ఉపయోగించి బీన్ ఆకులలోని మొత్తం స్వేచ్ఛా అమైనో ఆమ్ల పరిమాణాన్ని నిర్ధారించారు. క్లుప్తంగా, 0.1 గ్రాముల పొడి చేసిన కణజాలాన్ని pH 5.4 బఫర్‌తో సంగ్రహించారు, మరియు 200 μL సూపర్నాటెంట్‌ను 200 μL నిన్హైడ్రిన్ (2%) మరియు 200 μL పైరిడిన్ (10%; స్పెక్ట్రమ్ కెమికల్, న్యూ బ్రున్స్విక్, NJ, USA)తో చర్య జరిపి, మరిగే నీటి స్నానంలో 30 నిమిషాల పాటు ఉంచి, ఆపై చల్లబరిచి, UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి 580 nm వద్ద కొలిచారు. మరోవైపు, ప్రోలిన్‌ను బేట్స్ పద్ధతి (బేట్స్ మరియు ఇతరులు, 1973) ద్వారా నిర్ధారించారు. 3% సల్ఫోసాలిసిలిక్ ఆమ్లం (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్తామ్, MA, USA) ఉపయోగించి ప్రోలిన్‌ను సంగ్రహించారు మరియు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, 0.5 మి.లీ సూపర్నాటెంట్‌ను 1 మి.లీ గ్లేసియల్ ఎసిటిక్ ఆమ్లం (ఫిషర్ సైంటిఫిక్, హాంప్టన్, NH, USA) మరియు నిన్‌హైడ్రిన్ రియేజెంట్‌తో కలిపి, 90°C వద్ద 45 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, చల్లబరిచి, పైన పేర్కొన్న అదే స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌ను ఉపయోగించి 520 nm వద్ద కొలిచారు. ఆకు సారంలలోని మొత్తం స్వేచ్ఛా అమైనో ఆమ్లాలు మరియు ప్రోలిన్‌ను వరుసగా గ్లైసిన్ మరియు ప్రోలిన్ క్రమాంకన వక్రరేఖలను (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) ఉపయోగించి నిర్ధారించి, mg/g తాజా బరువుగా వ్యక్తీకరించారు.
యాంటీఆక్సిడెంట్ ఎంజైమ్‌ల ఎంజైమాటిక్ క్రియాశీలతను నిర్ధారించడానికి, సుమారు 500 mg ఏకరీతిగా చేసిన కణజాలాన్ని 3 ml 50 mM ట్రిస్ బఫర్ (pH 7.8) తో సంగ్రహించారు, దీనిలో 1 mM EDTA-Na2 (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) మరియు 7.5% పాలివినైల్‌పైరోలిడోన్ (PVP; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) ఉన్నాయి. దీనిని రిఫ్రిజిరేషన్ (4 °C) కింద 20 నిమిషాల పాటు 10,000 × g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సూపర్నాటెంట్ (ముడి ఎంజైమ్ సంగ్రహణ)ను సేకరించారు (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023). తరువాత, కాటలేస్ (CAT) యొక్క ఎంజైమాటిక్ క్రియాశీలతను నిర్ధారించడానికి, ఏబి (1984) పద్ధతి ప్రకారం స్వల్ప మార్పులతో (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023) 2 మి.లీ 0.1 M సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.5; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) మరియు 100 μl 269 mM H2O2 ద్రావణంతో చర్య జరిపారు. గ్వాయాకోల్-ఆధారిత పెరాక్సిడేస్ (POX) ఎంజైమాటిక్ క్రియాశీలతను హర్రాచ్ మరియు ఇతరులు (2009) పద్ధతిని ఉపయోగించి నిర్ధారించారు. (2008) పద్ధతిని (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023) స్వల్ప మార్పులతో అనుసరించి, 2.2 మి.లీ 100 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.0), 100 μl గ్వాయాకోల్ (TCI కెమికల్స్, పోర్ట్‌ల్యాండ్, OR, USA) మరియు 100 μl 12 mM H2O2 తో చర్య జరిపిన తర్వాత పాలిఫెనాల్ ఆక్సిడేస్ (PPO) యొక్క ఎంజైమాటిక్ క్రియాశీలతను నిర్ధారించారు. ఈ పద్ధతిని (ఎల్-నగర్ మరియు ఇతరులు, 2023; ఉస్మాన్ మరియు ఇతరులు, 2023) నుండి కొద్దిగా సవరించారు. 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 6.0)లో తాజాగా తయారుచేసిన 3 మి.లీ కాటెకోల్ ద్రావణం (థర్మో సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్థమ్, MA, USA) (0.01 M)తో చర్య జరిపిన తర్వాత ఈ అస్సేను నిర్వహించారు. UV-160A స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు, జపాన్) ఉపయోగించి, 240 nm (A240) వద్ద H2O2 విచ్ఛిన్నతను పర్యవేక్షించడం ద్వారా CAT చర్యను, 436 nm (A436) వద్ద శోషణలో పెరుగుదలను పర్యవేక్షించడం ద్వారా POX చర్యను, మరియు 3 నిమిషాల పాటు ప్రతి 30 సెకన్లకు 495 nm (A495) వద్ద శోషణ హెచ్చుతగ్గులను నమోదు చేయడం ద్వారా PPO చర్యను కొలిచారు.
చివరి చికిత్స తర్వాత 72 గంటలకు, బీన్ ఆకులలో (పై నుండి రెండవ మరియు మూడవ పూర్తిగా అభివృద్ధి చెందిన ఆకులు) పెరాక్సిసోమల్ కాటలేస్ (PvCAT1; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. KF033307.1), సూపర్‌ఆక్సైడ్ డిస్ముటేస్ (PvSOD; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. XM_068639556.1), మరియు గ్లూటాథియోన్ రిడక్టేస్ (PvGR; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నం. KY195009.1) సహా మూడు యాంటీఆక్సిడెంట్-సంబంధిత జన్యువుల ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ స్థాయిలను గుర్తించడానికి రియల్-టైమ్ RT-PCR ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం సింప్లీ పి టోటల్ ఆర్ఎన్ఏ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ కిట్ (క్యాట్. నం. BSC52S1; బయోఫ్లక్స్, బయోరి టెక్నాలజీ, చైనా) ఉపయోగించి ఆర్ఎన్ఏను వేరుచేయబడింది. తరువాత, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం టాప్ స్క్రిప్ట్™ సిడిఎన్ఏ సింథసిస్ కిట్ ఉపయోగించి సిడిఎన్ఏ సంశ్లేషణ చేయబడింది. పైన పేర్కొన్న మూడు జన్యువుల ప్రైమర్ సీక్వెన్సులు అనుబంధ పట్టిక S3లో జాబితా చేయబడ్డాయి. PvActin-3 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_068616709.1)ను హౌస్‌కీపింగ్ జన్యువుగా ఉపయోగించారు మరియు 2-ΔΔCT పద్ధతిని (లివాక్ మరియు ష్మిట్‌జెన్, 2001) ఉపయోగించి సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణను లెక్కించారు. జీవ సంబంధిత ఒత్తిడి (సాధారణ చిక్కుడు జాతి మొక్కలు మరియు ఆంత్రాక్నోస్ శిలీంధ్రం కొలెట్రిచమ్ లిండెముథియానమ్ మధ్య అసంగత పరస్పర చర్య) మరియు నిర్జీవ సంబంధిత ఒత్తిడి (కరువు, లవణీయత, తక్కువ ఉష్ణోగ్రత) కింద యాక్టిన్ స్థిరత్వాన్ని ప్రదర్శించారు (బోర్జెస్ మరియు ఇతరులు, 2012).
మేము ప్రారంభంలో ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ BLAST సాధనాన్ని (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ఉపయోగించి S. sclerotiorum లోని ఆక్సలోఅసిటేట్ అసిటైల్‌హైడ్రోలేస్ (OAH) ప్రోటీన్‌ల యొక్క జీనోమ్-వ్యాప్త ఇన్ సిలికో విశ్లేషణను నిర్వహించాము. క్లుప్తంగా, S. sclerotiorum (taxide: 5180) లోని సజాతీయ ప్రోటీన్‌ను మ్యాప్ చేయడానికి, మేము Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank యాక్సెషన్ నంబర్ XP_040799428.1; 342 అమైనో ఆమ్లాలు) మరియు Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank యాక్సెషన్ నంబర్ XP_056833920.1; 316 అమైనో ఆమ్లాలు) నుండి OAH లను క్వెరీ సీక్వెన్స్‌లుగా ఉపయోగించాము. నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI) వెబ్‌సైట్, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ లోని జెన్‌బ్యాంక్‌లో అత్యంత ఇటీవల అందుబాటులో ఉన్న S. sclerotiorum జన్యువు డేటాపై BLASTp నిర్వహించబడింది.
అదనంగా, MEGA11 (Tamura et al., 2021) లో గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతి మరియు JTT మాత్రిక-ఆధారిత నమూనా (Jones et al., 1992) ఉపయోగించి S. sclerotiorum (SsOAH) నుండి అంచనా వేయబడిన OAH జన్యువు మరియు A. fijiensis CBS 313.89 నుండి AfOAH మరియు P. lagena నుండి PlOAH యొక్క పరిణామ విశ్లేషణ మరియు ఫైలోజెనెటిక్ వృక్షం నిర్ధారించబడ్డాయి. ఈ ఫైలోజెనెటిక్ వృక్షాన్ని, కన్‌స్ట్రెయింట్-బేస్డ్ అలైన్‌మెంట్ టూల్ (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) ఉపయోగించి, S. sclerotiorum నుండి అంచనా వేయబడిన అన్ని OAH జన్యువుల (SsOAH) ప్రోటీన్ శ్రేణులు మరియు క్వెరీ శ్రేణి యొక్క బహుళ అలైన్‌మెంట్ విశ్లేషణతో కలిపారు. అదనంగా, S. sclerotiorum నుండి వచ్చిన SsOAH యొక్క ఉత్తమంగా సరిపోలిన అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులను ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ఉపయోగించి క్వెరీ శ్రేణులతో (AfOAH మరియు PlOAH) (లార్కిన్ మరియు ఇతరులు, 2007) అమర్చారు, మరియు అమరికలోని సంరక్షించబడిన ప్రాంతాలను ESPript సాధనం (వెర్షన్ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ఉపయోగించి దృశ్యమానం చేశారు.
ఇంకా, S. sclerotiorum SsOAH యొక్క అంచనా వేయబడిన క్రియాత్మక ప్రతినిధి డొమైన్‌లు మరియు సంరక్షించబడిన సైట్‌లను InterPro సాధనాన్ని (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ఉపయోగించి ఇంటరాక్టివ్‌గా వివిధ కుటుంబాలుగా వర్గీకరించారు (బ్లమ్ మరియు ఇతరులు, 2021). చివరగా, అంచనా వేయబడిన S. sclerotiorum SsOAH యొక్క త్రిమితీయ (3D) నిర్మాణ నమూనాను ప్రోటీన్ హోమాలజీ/అనాలజీ రికగ్నిషన్ ఇంజిన్ (Phyre2 సర్వర్ వెర్షన్ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (కెల్లీ మరియు ఇతరులు, 2015) ఉపయోగించి నిర్వహించారు మరియు SWISS-MODEL సర్వర్‌ను (https://swissmodel.expasy.org/) (బియాసిని మరియు ఇతరులు, 2014) ఉపయోగించి ధృవీకరించారు. అంచనా వేయబడిన త్రిమితీయ నిర్మాణాలను (PDB ఫార్మాట్) UCSF-Chimera ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (పెట్టర్సెన్ మరియు ఇతరులు, 2004) ఉపయోగించి ఇంటరాక్టివ్‌గా దృశ్యమానం చేశారు.
స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ యొక్క మైసీలియాలో ఆక్సలోఅసిటేట్ అసిటైల్‌హైడ్రోలేస్ (SsOAH; జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_001590428.1) యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ స్థాయిని నిర్ధారించడానికి క్వాంటిటేటివ్ రియల్-టైమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ PCR ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, మైసీలియా పెరుగుదలను ప్రేరేపించడానికి, S. స్క్లెరోటియోరమ్‌ను PDB ఉన్న ఒక ఫ్లాస్క్‌లోకి ఎక్కించి, దానిని 25 ± 2 °C వద్ద 150 rpm వేగంతో 24 గంటల పాటు నిరంతర చీకటిలో (24 గంటలు) ఒక షేకింగ్ ఇంక్యుబేటర్‌లో (మోడల్: I2400, న్యూ బ్రున్స్విక్ సైంటిఫిక్ కో., ఎడిసన్, NJ, USA) ఉంచారు. ఆ తర్వాత, కణాలను L-ఆర్నిథైన్ మరియు రైజోలెక్స్-T అనే శిలీంద్రనాశకంతో తుది IC50 గాఢతలలో (వరుసగా సుమారు 40 మరియు 3.2 mg/L) ట్రీట్ చేసి, అదే పరిస్థితులలో మరో 24 గంటల పాటు కల్చర్ చేశారు. ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, కల్చర్‌లను 5 నిమిషాల పాటు 2500 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ కోసం సూపర్‌నాటెంట్ (శిలీంధ్ర మైసీలియం)ను సేకరించారు. అదేవిధంగా, సోకిన కణజాలాల ఉపరితలంపై తెల్లటి బూజు మరియు దూది వంటి మైసీలియంను ఏర్పరచిన సోకిన మొక్కల నుండి, సంక్రమణ తర్వాత 0, 24, 48, 72, 96, మరియు 120 గంటల వద్ద శిలీంధ్ర మైసీలియంను సేకరించారు. శిలీంధ్ర మైసీలియం నుండి RNAను సంగ్రహించి, ఆపై పైన వివరించిన విధంగా cDNAను సంశ్లేషణ చేశారు. SsOAH కొరకు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S3లో జాబితా చేయబడ్డాయి. SsActin (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్: XM_001589919.1)ను హౌస్‌కీపింగ్ జన్యువుగా ఉపయోగించారు, మరియు సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణను 2-ΔΔCT పద్ధతిని (లివాక్ మరియు ష్మిట్‌జెన్, 2001) ఉపయోగించి లెక్కించారు.
జు మరియు జాంగ్ (2000) పద్ధతికి స్వల్ప మార్పులు చేసి, పొటాటో డెక్స్‌ట్రోజ్ బ్రాత్ (PDB) మరియు స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ అనే శిలీంధ్ర వ్యాధికారకాన్ని కలిగి ఉన్న మొక్కల నమూనాలలో ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని నిర్ధారించారు. క్లుప్తంగా, మైసీలియల్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించడానికి, S. స్క్లెరోటియోరమ్ ఐసోలేట్‌లను PDB ఉన్న ఫ్లాస్క్‌లలోకి ఎక్కించి, ఆపై నిరంతర చీకటిలో (24 గంటలు) 3–5 రోజుల పాటు 25 ± 2 °C వద్ద 150 rpm వేగంతో షేకింగ్ ఇంక్యుబేటర్ (మోడల్ I2400, న్యూ బ్రున్స్విక్ సైంటిఫిక్ కో., ఎడిసన్, NJ, USA)లో కల్చర్ చేశారు. ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, మిగిలిపోయిన మైసీలియంను తొలగించడానికి, శిలీంధ్ర కల్చర్‌ను మొదట వాట్‌మాన్ #1 ఫిల్టర్ పేపర్ ద్వారా వడపోసి, ఆపై 5 నిమిషాల పాటు 2500 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఆక్సలేట్ యొక్క తదుపరి పరిమాణాత్మక నిర్ధారణ కోసం సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించి 4°C వద్ద నిల్వ చేశారు. మొక్కల నమూనాల తయారీ కోసం, సుమారు 0.1 గ్రాముల మొక్క కణజాల శకలాలను స్వేదన జలంతో (ప్రతిసారి 2 మి.లీ.) మూడుసార్లు సంగ్రహించారు. ఆ తర్వాత నమూనాలను 5 నిమిషాల పాటు 2500 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, పైనున్న ద్రవాన్ని వాట్మాన్ నెం. 1 ఫిల్టర్ పేపర్ ద్వారా పొడిగా వడపోసి, తదుపరి విశ్లేషణ కోసం సేకరించారు.
ఆక్సాలిక్ ఆమ్లం యొక్క పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం, ఒక గాజు మూత గొట్టంలో చర్య మిశ్రమాన్ని ఈ క్రింది క్రమంలో తయారు చేశారు: 0.2 మి.లీ నమూనా (లేదా PDB కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్ లేదా ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల ప్రామాణిక ద్రావణం), 0.11 మి.లీ బ్రోమోఫెనాల్ బ్లూ (BPB, 1 mM; ఫిషర్ కెమికల్, పిట్స్‌బర్గ్, PA, USA), 0.198 మి.లీ 1 M సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లం (H2SO4; అల్-గోమ్‌హోరియా ఫార్మాస్యూటికల్స్ అండ్ మెడికల్ సప్లైస్, కైరో, ఈజిప్ట్) మరియు 0.176 మి.లీ 100 mM పొటాషియం డైక్రోమేట్ (K2Cr2O7; TCI కెమికల్స్, పోర్ట్‌ల్యాండ్, OR, USA), ఆ తర్వాత ద్రావణాన్ని స్వేదన జలంతో 4.8 మి.లీకి పలుచబరిచి, బలంగా కలిపి, వెంటనే 60 °C నీటి స్నానంలో ఉంచారు. 10 నిమిషాల తర్వాత, 0.5 మి.లీ సోడియం హైడ్రాక్సైడ్ ద్రావణం (NaOH; 0.75 M) కలపడం ద్వారా చర్యను నిలిపివేశారు. UV-160 స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (షిమాడ్జు కార్పొరేషన్, జపాన్) ఉపయోగించి చర్య మిశ్రమం యొక్క శోషణను (A600) 600 nm వద్ద కొలిచారు. కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్‌లు మరియు మొక్కల నమూనాల పరిమాణీకరణ కోసం వరుసగా PDB మరియు స్వేదన జలాన్ని నియంత్రకాలుగా ఉపయోగించారు. కల్చర్ ఫిల్ట్రేట్‌లలోని ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల గాఢతలను, ప్రతి మిల్లీలీటర్ PDB మీడియమ్‌కు మైక్రోగ్రాముల ఆక్సాలిక్ ఆమ్లంగా (μg.mL−1) మరియు ఆకు సారాలలో ప్రతి గ్రాము తాజా బరువుకు మైక్రోగ్రాముల ఆక్సాలిక్ ఆమ్లంగా (μg.g−1 FW) వ్యక్తీకరించి, ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల క్రమాంకన వక్రరేఖ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్ కెమికల్స్, వాల్థమ్, MA, USA) ఉపయోగించి నిర్ధారించారు.
అధ్యయనం అంతటా, ప్రత్యేకంగా పేర్కొనకపోతే తప్ప, అన్ని ప్రయోగాలు ప్రతి ట్రీట్‌మెంట్‌కు ఆరు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లు మరియు ప్రతి బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌కు ఐదు కుండీలతో (ప్రతి కుండీకి రెండు మొక్కలు) పూర్తిగా రాండమైజ్డ్ డిజైన్ (CRD)లో రూపొందించబడ్డాయి. బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లు డూప్లికేట్‌లో (రెండు టెక్నికల్ రెప్లికేట్‌లు) విశ్లేషించబడ్డాయి. ఒకే ప్రయోగం యొక్క పునరుత్పత్తిని తనిఖీ చేయడానికి టెక్నికల్ రెప్లికేట్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి, కానీ తప్పుడు రెప్లికేట్‌లను నివారించడానికి గణాంక విశ్లేషణలో ఉపయోగించబడలేదు. డేటాను అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ (ANOVA) ఉపయోగించి గణాంకపరంగా విశ్లేషించారు, దాని తర్వాత ట్యూకీ-క్రేమర్ హానెస్ట్లీ సిగ్నిఫికెంట్ డిఫరెన్స్ (HSD) పరీక్ష (p ≤ 0.05) నిర్వహించబడింది. ఇన్ విట్రో ప్రయోగాల కోసం, IC50 మరియు IC99 విలువలు ప్రోబిట్ మోడల్‌ను ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి మరియు 95% కాన్ఫిడెన్స్ ఇంటర్వెల్స్ లెక్కించబడ్డాయి.
ఈజిప్టులోని ఎల్ ఘాబియా గవర్నరేట్‌లోని వివిధ సోయాబీన్ పొలాల నుండి మొత్తం నాలుగు ఐసోలేట్‌లను సేకరించారు. PDA మాధ్యమంలో, అన్ని ఐసోలేట్‌లు క్రీమీ తెలుపు మైసీలియంను ఉత్పత్తి చేశాయి, అది త్వరగా దూదిలాంటి తెలుపుగా (పటం 1A) మరియు తరువాత స్క్లెరోటియం దశలో బేజ్ లేదా గోధుమ రంగులోకి మారింది. స్క్లెరోటియాలు సాధారణంగా దట్టంగా, నల్లగా, గోళాకారంగా లేదా క్రమరహిత ఆకారంలో, 5.2 నుండి 7.7 మి.మీ. పొడవు మరియు 3.4 నుండి 5.3 మి.మీ. వ్యాసంలో ఉంటాయి (పటం 1B). 25 ± 2 °C వద్ద 10–12 రోజుల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత నాలుగు ఐసోలేట్‌లు కల్చర్ మాధ్యమం అంచున స్క్లెరోటియాల ఉపాంత నమూనాను అభివృద్ధి చేసినప్పటికీ (పటం 1A), వాటి మధ్య ప్లేట్‌కు స్క్లెరోటియాల సంఖ్య గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంది (P < 0.001), ఐసోలేట్ 3 అత్యధిక సంఖ్యలో స్క్లెరోటియాలను కలిగి ఉంది (ప్లేట్‌కు 32.33 ± 1.53 స్క్లెరోటియాలు; పటం 1C). అదేవిధంగా, ఇతర ఐసోలేట్‌లతో పోలిస్తే ఐసోలేట్ #3 PDBలో ఎక్కువ ఆక్సాలిక్ ఆమ్లాన్ని ఉత్పత్తి చేసింది (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; పటం 1D). ఐసోలేట్ #3, మొక్కలకు వ్యాధిని కలిగించే శిలీంధ్రమైన స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ యొక్క విలక్షణమైన స్వరూప మరియు సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాలను ప్రదర్శించింది. ఉదాహరణకు, PDA మీద, ఐసోలేట్ #3 యొక్క కాలనీలు వేగంగా పెరిగాయి, క్రీమీ తెలుపు (పటం 1A), రివర్స్ బేజ్ లేదా లేత సాల్మన్ పసుపు-గోధుమ రంగులో ఉన్నాయి మరియు 9 సెం.మీ వ్యాసం గల ప్లేట్ ఉపరితలాన్ని పూర్తిగా కప్పడానికి 25 ± 2°C వద్ద 6-7 రోజులు పట్టింది. పైన పేర్కొన్న స్వరూప మరియు సూక్ష్మదర్శిని లక్షణాల ఆధారంగా, ఐసోలేట్ #3 ను స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్‌గా గుర్తించారు.
పటం 1. సాధారణ పప్పుదినుసు పంటల నుండి వేరుచేసిన S. sclerotiorum ఐసోలేట్‌ల లక్షణాలు మరియు వ్యాధికారకత్వం. (A) PDA మాధ్యమంలో నాలుగు S. sclerotiorum ఐసోలేట్‌ల మైసీలియల్ పెరుగుదల, (B) నాలుగు S. sclerotiorum ఐసోలేట్‌ల స్క్లెరోటియా, (C) స్క్లెరోటియా సంఖ్య (ఒక్కో ప్లేట్‌కు), (D) PDB మాధ్యమంలో ఆక్సాలిక్ ఆమ్ల స్రావం (μg.mL−1), మరియు (E) గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో సున్నితమైన వాణిజ్య పప్పుదినుసు రకం గిజా 3 పై నాలుగు S. sclerotiorum ఐసోలేట్‌ల వ్యాధి తీవ్రత (%). విలువలు ఐదు జీవసంబంధమైన పునరావృతాల (n = 5) సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి. వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05). (F–H) ఐసోలేట్ #3తో టీకా వేసిన 10 రోజుల తర్వాత (dpi), వరుసగా భూమిపై ఉన్న కాండాలు మరియు సిలిక్‌లపై సాధారణ తెల్ల బూజు లక్షణాలు కనిపించాయి. (I) S. sclerotiorum ఐసోలేట్ #3 యొక్క ఇంటర్నల్ ట్రాన్స్క్రైబ్డ్ స్పేసర్ (ITS) ప్రాంతం యొక్క పరిణామ విశ్లేషణను గరిష్ట సంభావ్యత పద్ధతిని ఉపయోగించి నిర్వహించి, నేషనల్ సెంటర్ ఫర్ బయోటెక్నాలజీ ఇన్ఫర్మేషన్ (NCBI) డేటాబేస్ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) నుండి పొందిన 20 రిఫరెన్స్ ఐసోలేట్లు/స్ట్రెయిన్‌లతో పోల్చబడింది. క్లస్టరింగ్ లైన్‌ల పైన ఉన్న సంఖ్యలు ప్రాంత కవరేజీని (%) సూచిస్తాయి మరియు క్లస్టరింగ్ లైన్‌ల క్రింద ఉన్న సంఖ్యలు బ్రాంచ్ పొడవును సూచిస్తాయి.
ఇంకా, వ్యాధికారకతను నిర్ధారించడానికి, పొందిన నాలుగు S. sclerotiorum ఐసోలేట్‌లను గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో సున్నితమైన వాణిజ్య బీన్ రకం గిజా 3కి టీకాలు వేయడానికి ఉపయోగించారు, ఇది కోచ్ ప్రతిపాదనలకు అనుగుణంగా ఉంది (పటం 1E). పొందిన అన్ని శిలీంధ్ర ఐసోలేట్‌లు వ్యాధికారకమైనవి మరియు పచ్చి బీన్ (రకం గిజా 3)కు సోకగలిగినప్పటికీ, టీకాలు వేసిన 10 రోజుల తర్వాత (డిపిఐ) మొక్క యొక్క అన్ని పైభాగాలపై (పటం 1F), ముఖ్యంగా కాండాలు (పటం 1G) మరియు కాయలపై (పటం 1H) విలక్షణమైన తెల్ల బూజు లక్షణాలను కలిగించినప్పటికీ, రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో ఐసోలేట్ 3 అత్యంత తీవ్రమైనదిగా నిరూపించబడింది. బీన్ మొక్కలపై ఐసోలేట్ 3 అత్యధిక వ్యాధి తీవ్రతను (%) కలిగి ఉంది (వ్యాధి సోకిన 7, 14, మరియు 21 రోజుల తర్వాత వరుసగా 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, మరియు 76.7 ± 3.1; పటం 1F).
అత్యంత హానికరమైన S. sclerotiorum ఐసోలేట్ #3 యొక్క గుర్తింపు ఇంటర్నల్ ట్రాన్స్క్రైబ్డ్ స్పేసర్ (ITS) సీక్వెన్సింగ్ ఆధారంగా మరింతగా నిర్ధారించబడింది (పటం 1I). ఐసోలేట్ #3 మరియు 20 రిఫరెన్స్ ఐసోలేట్లు/స్ట్రెయిన్‌ల మధ్య జరిగిన ఫైలోజెనెటిక్ విశ్లేషణ వాటి మధ్య అధిక సారూప్యతను (>99%) చూపించింది. గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, S. sclerotiorum ఐసోలేట్ #3 (533 bp) అనేది ఎండిన బఠానీ విత్తనాల నుండి వేరుచేయబడిన అమెరికన్ S. sclerotiorum ఐసోలేట్ LPM36 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్ MK896659.1; 540 bp) మరియు వైలెట్ (మాథియోలా ఇంకానా) కాండం కుళ్ళిపోవడానికి కారణమయ్యే చైనీస్ S. sclerotiorum ఐసోలేట్ YKY211 (జెన్‌బ్యాంక్ యాక్సెషన్ నంబర్ OR206374.1; 548 bp) లతో అధిక సారూప్యతను కలిగి ఉంది, ఇవన్నీ డెండ్రోగ్రామ్ (పటం 1I) పైభాగంలో విడివిడిగా సమూహపరచబడ్డాయి. కొత్త సీక్వెన్స్‌ను NCBI డేటాబేస్‌లో నిక్షిప్తం చేసి, దానికి “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank యాక్సెషన్ నంబర్ PV202792) అని నామకరణం చేశారు. ఐసోలేట్ 3 అత్యంత వ్యాప్తి చెందే ఐసోలేట్ అని గమనించవచ్చు; అందువల్ల, తదుపరి అన్ని ప్రయోగాలలో అధ్యయనం కోసం ఈ ఐసోలేట్‌ను ఎంచుకున్నారు.
డైఅమైన్ ఎల్-ఆర్నిథైన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, డార్మ్‌స్టాడ్, జర్మనీ) యొక్క యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను, వివిధ గాఢతలలో (12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 mg/L) S. sclerotiorum ఐసోలేట్ 3 పై ఇన్ విట్రోలో పరిశోధించడం జరిగింది. గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, ఎల్-ఆర్నిథైన్ యాంటీ బాక్టీరియల్ ప్రభావాన్ని చూపించి, మోతాదుపై ఆధారపడిన పద్ధతిలో S. sclerotiorum హైఫే యొక్క వ్యాసార్ధ పెరుగుదలను క్రమంగా నిరోధించింది (పటం 2A, B). పరీక్షించిన అత్యధిక గాఢత (125 mg/L) వద్ద, ఎల్-ఆర్నిథైన్ అత్యధిక మైసీలియల్ పెరుగుదల నిరోధక రేటును (99.62 ± 0.27%; పటం 2B) ప్రదర్శించింది. ఇది, పరీక్షించిన అత్యధిక గాఢత (10 mg/L) వద్ద వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకమైన రైజోలెక్స్-టి (నిరోధక రేటు 99.45 ± 0.39%; పటం 2C) తో సమానంగా ఉంది, ఇది రెండింటి సామర్థ్యం సమానంగా ఉందని సూచిస్తుంది.
పటం 2. స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క ఇన్ విట్రో యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్య. (ఎ) ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్‌కు వ్యతిరేకంగా ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క వివిధ గాఢతల యాంటీ బాక్టీరియల్ చర్యను వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకమైన రిజోలెక్స్-టి (10 మి.గ్రా/లీ)తో పోల్చడం. (బి, సి) వరుసగా ఎల్-ఆర్నిథైన్ (12.5, 25, 50, 75, 100 మరియు 125 మి.గ్రా/లీ) లేదా రిజోలెక్స్-టి (2, 4, 6, 8 మరియు 10 మి.గ్రా/లీ) యొక్క వివిధ గాఢతలతో చికిత్స చేసిన తర్వాత ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్ మైసీలియల్ పెరుగుదల నిరోధక రేటు (%). విలువలు ఐదు జీవసంబంధ పునరావృత్తుల (n = 5) సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి. వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంక వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05). (డి, ఇ) వరుసగా ఎల్-ఆర్నిథైన్ మరియు వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకమైన రిజోలెక్స్-టి యొక్క ప్రోబిట్ మోడల్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణ. ప్రోబిట్ మోడల్ రిగ్రెషన్ లైన్‌ను ముదురు నీలం గీతగా, మరియు విశ్వాస విరామాన్ని (95%) చుక్కల ఎరుపు గీతగా చూపించారు.
అదనంగా, ప్రోబిట్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది మరియు దానికి సంబంధించిన ప్లాట్‌లు పట్టిక 1 మరియు చిత్రాలు 2D,E లలో చూపబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకమైన రైజోలెక్స్-టి (y = 1.96x − 0.99, కాక్స్ & స్నెల్ R2 = 0.1242, నాగెల్కెర్కే R2 = 0.1708 మరియు p < 0.0001)తో పోలిస్తే, ఎల్-ఆర్నిథైన్ యొక్క ఆమోదయోగ్యమైన వాలు విలువ (y = 2.92x − 4.67) మరియు దానికి సంబంధించిన ముఖ్యమైన గణాంకాలు (కాక్స్ & స్నెల్ R2 = 0.3709, నాగెల్కెర్కే R2 = 0.4998 మరియు p < 0.0001; చిత్రం 2D) ఎస్. స్క్లెరోటియోరమ్‌పై మెరుగైన శిలీంద్రనాశక చర్యను సూచించాయి (పట్టిక 1).
పట్టిక 1. S. sclerotiorum కు వ్యతిరేకంగా L-ornithine మరియు వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకం “Rizolex-T” యొక్క సగం-గరిష్ట నిరోధక గాఢత (IC50) మరియు IC99 (mg/l) విలువలు.
మొత్తంమీద, చికిత్స చేయని S. sclerotiorum-సోకిన మొక్కలతో (నియంత్రణ; పటం 3A) పోల్చినప్పుడు, L-ఆర్నిథైన్ (250 mg/L) చికిత్స చేసిన సాధారణ బీన్ మొక్కలపై తెల్ల బూజు అభివృద్ధిని మరియు తీవ్రతను గణనీయంగా తగ్గించింది. క్లుప్తంగా, చికిత్స చేయని సోకిన నియంత్రణ మొక్కలలో వ్యాధి తీవ్రత క్రమంగా పెరిగినప్పటికీ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, మరియు 92.33 ± 3.06%), L-ఆర్నిథైన్ ప్రయోగం అంతటా వ్యాధి తీవ్రతను (%) గణనీయంగా తగ్గించింది (చికిత్స తర్వాత వరుసగా 7, 14, మరియు 21 రోజులకు (dpt) (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, మరియు 26.36 ± 3.07) (పటం 3A). అదేవిధంగా, S. sclerotiorum-సోకిన బీన్ మొక్కలకు 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స చేసినప్పుడు, వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ కింద ఉన్న ప్రాంతం (AUDPC) చికిత్స చేయని నియంత్రణలో 1274.33 ± 33.13 నుండి 281.03 ± 7.95కు తగ్గింది, ఇది సానుకూల నియంత్రణ 50 mg/L రైజోలెక్స్-టి శిలీంద్రనాశకం (183.61 ± 7.71; Fig. 3B) కంటే కొద్దిగా తక్కువగా ఉంది. రెండవ ప్రయోగంలో కూడా ఇదే ధోరణి గమనించబడింది.
పటం 3. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్ వలన సాధారణ బీన్స్‌లో కలిగే తెల్ల కుళ్ళు తెగులు అభివృద్ధిపై ఎల్-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం వల్ల కలిగే ప్రభావం. (ఎ) 250 మి.గ్రా/లీ ఎల్-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స చేసిన తర్వాత సాధారణ బీన్స్‌లో తెల్ల బూజు తెగులు యొక్క వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ. (బి) ఎల్-ఆర్నిథైన్‌తో చికిత్స చేసిన తర్వాత సాధారణ బీన్స్‌లో తెల్ల బూజు తెగులు యొక్క వ్యాధి పురోగతి వక్రరేఖ కింద ఉన్న వైశాల్యం (AUDPC). విలువలు ఐదు జీవసంబంధమైన పునరావృతాల (n = 5) సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని సూచిస్తాయి. వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05).
42 రోజుల తర్వాత, 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం వల్ల మొక్క ఎత్తు (పటం 4A), మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య (పటం 4B), మరియు మొక్కకు ఆకుల సంఖ్య (పటం 4C) క్రమంగా పెరిగాయి. అధ్యయనం చేసిన అన్ని పోషక పారామితులపై వాణిజ్య శిలీంధ్రనాశకం రైజోలెక్స్-టి (50 mg/L) అత్యధిక ప్రభావాన్ని చూపగా, చికిత్స చేయని నియంత్రణలతో పోలిస్తే 250 mg/L L-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం రెండవ అత్యధిక ప్రభావాన్ని చూపింది (పటాలు 4A–C). మరోవైపు, ఎల్-ఆర్నిథైన్ చికిత్స కిరణజన్య సంయోగ వర్ణకాలైన క్లోరోఫిల్ ఎ (పటం 4డి) మరియు క్లోరోఫిల్ బి (పటం 4ఇ) పరిమాణంపై ఎటువంటి గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు, కానీ నెగటివ్ కంట్రోల్ (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) మరియు పాజిటివ్ కంట్రోల్ (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; పటం 4ఎఫ్) లతో పోలిస్తే మొత్తం కెరోటినాయిడ్ పరిమాణాన్ని (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) కొద్దిగా పెంచింది. మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు ఎల్-ఆర్నిథైన్ చికిత్స పొందిన పప్పుదినుసు మొక్కలకు విషపూరితం కాదని మరియు వాటి పెరుగుదలను ప్రేరేపించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
పటం 4. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో స్క్లెరోటినియా స్క్లెరోటియోరమ్‌తో సోకిన బీన్ ఆకుల పెరుగుదల లక్షణాలు మరియు కిరణజన్య సంయోగ వర్ణకాలపై బాహ్యంగా ప్రయోగించిన ఎల్-ఆర్నిథైన్ ప్రభావం. (ఎ) మొక్క ఎత్తు (సెం.మీ), (బి) మొక్కకు కొమ్మల సంఖ్య, (సి) మొక్కకు ఆకుల సంఖ్య, (డి) క్లోరోఫిల్ ఎ పరిమాణం (మి.గ్రా గ్రా-1 తాజా బరువు), (ఇ) క్లోరోఫిల్ బి పరిమాణం (మి.గ్రా గ్రా-1 తాజా బరువు), (ఎఫ్) మొత్తం కెరోటినాయిడ్ పరిమాణం (మి.గ్రా గ్రా-1 తాజా బరువు). విలువలు ఐదు జీవసంబంధ పునరావృతాల సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (n = 5). వేర్వేరు అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05).
రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ స్పీసీస్ (ROS; హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ [H2O2] రూపంలో) మరియు ఫ్రీ రాడికల్స్ (సూపర్‌ఆక్సైడ్ అయాన్లు [O2•−] రూపంలో) యొక్క ఇన్ సిటు హిస్టోకెమికల్ లోకలైజేషన్ ద్వారా వెల్లడైనదేమిటంటే, బాహ్యంగా ఎల్-ఆర్నిథైన్ (250 mg/L) ను ప్రయోగించడం వల్ల, చికిత్స చేయని సోకిన మొక్కలు (వరుసగా 173.31 ± 12.06 మరియు 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) మరియు 50 mg/L వాణిజ్య శిలీంద్రనాశకమైన రైజోలెక్స్-టి (170.12 ± 9.50) తో చికిత్స పొందిన మొక్కలలో పేరుకుపోయిన దానితో పోలిస్తే, H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) మరియు O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) పేరుకుపోవడం గణనీయంగా తగ్గింది. 72 గంటల వద్ద వరుసగా 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt). hpt కింద అధిక స్థాయిలో H2O2 మరియు O2•− పేరుకుపోయాయి (పటం 5A, B). అదేవిధంగా, TCA-ఆధారిత మలోండియాల్డిహైడ్ (MDA) పరీక్షలో S. sclerotiorum-సోకిన బీన్ మొక్కల ఆకులలో అధిక స్థాయిలో MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) పేరుకుపోయినట్లు చూపించింది (పటం 5C). అయితే, L-ఆర్నిథైన్‌ను బాహ్యంగా ప్రయోగించడం వల్ల లిపిడ్ పెరాక్సిడేషన్ గణనీయంగా తగ్గింది, దీనికి చికిత్స పొందిన మొక్కలలో MDA పరిమాణం (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) తగ్గడం సాక్ష్యంగా ఉంది.
పటం 5. గ్రీన్‌హౌస్ పరిస్థితులలో S. sclerotiorumతో సోకిన 72 గంటల తర్వాత బీన్ ఆకులలో ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి యొక్క ప్రధాన సూచికలు మరియు ఎంజైమేతర యాంటీఆక్సిడెంట్ రక్షణ యంత్రాంగాలపై బాహ్య L-ఆర్నిథైన్ ప్రయోగం యొక్క ప్రభావం. (A) 72 గంటల తర్వాత హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 గంటల తర్వాత సూపర్‌ఆక్సైడ్ అయాన్ (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 గంటల తర్వాత మలోండియాల్డిహైడ్ (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 గంటల తర్వాత మొత్తం కరిగే ఫినాల్స్ (mg GAE g−1 FW), (E) 72 గంటల తర్వాత మొత్తం కరిగే ఫ్లేవనాయిడ్లు (mg RE g−1 FW), (F) 72 గంటల తర్వాత మొత్తం స్వేచ్ఛా అమైనో ఆమ్లాలు (mg g−1 FW), మరియు (G) 72 గంటల తర్వాత ప్రోలిన్ పరిమాణం (mg g−1 FW). విలువలు 5 జీవసంబంధమైన పునరావృతాల (n = 5) సగటు ± ప్రామాణిక విచలనాన్ని (సగటు ± SD) సూచిస్తాయి. విభిన్న అక్షరాలు చికిత్సల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (p < 0.05).