Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSSకు పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ప్రదర్శిస్తాము.
అధిక లోడింగ్ కంటెంట్ కలిగిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) వివిధ మోతాదు రూపాలలో విభిన్న అనువర్తనాలను కనుగొన్నాయి. క్రయోప్రొటెక్టెంట్‌గా మానిటాల్‌తో లేదా లేకుండా, ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన కైటోసాన్ నానోపార్టికల్స్ నిర్మాణంపై ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైయింగ్ ప్రక్రియల ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడమే ఈ పని యొక్క లక్ష్యం. మేము ఈ నానోపార్టికల్స్‌ను తిరిగి కరిగించడం ద్వారా వాటి నాణ్యతను కూడా అంచనా వేశాము. నిర్జలీకరణానికి ముందు, కైటోసాన్/సోడియం ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్/ఇన్సులిన్ క్రాస్-లింక్డ్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క కణ పరిమాణం 318 nmగా ఆప్టిమైజ్ చేయబడింది, PDI 0.18గా, ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం 99.4%గా మరియు లోడింగ్ 25.01%గా ఉంది. పునఃసంయోగం తర్వాత, మానిటాల్ వాడకం లేకుండా ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ పద్ధతి ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడినవి మినహా, అన్ని నానోపార్టికల్స్ వాటి గోళాకార కణ నిర్మాణాన్ని నిలుపుకున్నాయి. స్ప్రే ద్వారా నిర్జలీకరణం చేయబడిన మానిటాల్-కలిగిన నానోపార్టికల్స్‌తో పోలిస్తే, మానిటాల్-రహిత స్ప్రే-డ్రైడ్ నానోపార్టికల్స్ అతి చిన్న సగటు కణ పరిమాణాన్ని (376 nm) మరియు అత్యధిక లోడింగ్ కంటెంట్‌ను (25.02%) కూడా ప్రదర్శించాయి. ఎండబెట్టడం లేదా ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ పద్ధతుల ద్వారా సమానమైన ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ రేటు (98.7%) మరియు PDI (0.20) సాధించబడ్డాయి. మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే డ్రైయింగ్ ద్వారా ఎండబెట్టిన నానోపార్టికల్స్ ఇన్సులిన్‌ను అత్యంత వేగంగా విడుదల చేయడంతో పాటు, కణాలచే గ్రహించబడే సామర్థ్యాన్ని కూడా అత్యధికంగా చూపించాయి. సాంప్రదాయ ఫ్రీజ్ డ్రైయింగ్ పద్ధతులతో పోలిస్తే, క్రయోప్రొటెక్టెంట్ల అవసరం లేకుండానే స్ప్రే డ్రైయింగ్ పద్ధతి ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను నిర్జలీకరణం చేయగలదని, తద్వారా అధిక లోడింగ్ సామర్థ్యం, ​​తక్కువ సంకలితాల అవసరం మరియు నిర్వహణ ఖర్చులలో గణనీయమైన ప్రయోజనం చేకూరుతుందని ఈ అధ్యయనం చూపిస్తుంది.
1922లో కనుగొనబడినప్పటి నుండి¹,²,³, ఇన్సులిన్ మరియు దాని ఔషధ తయారీలు టైప్ 1 డయాబెటిస్ (T1DM) మరియు టైప్ 2 డయాబెటిస్ (T2DM) ఉన్న రోగుల ప్రాణాలను కాపాడాయి. అయినప్పటికీ, అధిక అణుభారం గల ప్రోటీన్ కావడం వల్ల, ఇన్సులిన్ సులభంగా గడ్డకట్టి, ప్రోటీయోలైటిక్ ఎంజైమ్‌ల ద్వారా విచ్ఛిన్నమై, ఫస్ట్-పాస్ ఎఫెక్ట్ ద్వారా తొలగించబడుతుంది. టైప్ 1 డయాబెటిస్‌తో బాధపడుతున్న వారికి జీవితాంతం ఇన్సులిన్ ఇంజెక్షన్లు అవసరం. మొదట టైప్ 2 డయాబెటిస్‌గా నిర్ధారణ అయిన చాలా మంది రోగులకు కూడా దీర్ఘకాలిక ఇన్సులిన్ ఇంజెక్షన్లు అవసరం. ఈ వ్యక్తులకు రోజువారీ ఇన్సులిన్ ఇంజెక్షన్లు తీవ్రమైన నొప్పి మరియు అసౌకర్యాన్ని కలిగిస్తాయి, ఇది వారి మానసిక ఆరోగ్యంపై ప్రతికూల ప్రభావాలను చూపుతుంది. ఫలితంగా, నోటి ద్వారా ఇన్సులిన్ తీసుకోవడం వంటి తక్కువ అసౌకర్యాన్ని కలిగించే ఇతర రకాల ఇన్సులిన్ వినియోగ పద్ధతులపై విస్తృతంగా అధ్యయనాలు జరుగుతున్నాయి⁵, ఎందుకంటే ప్రపంచవ్యాప్తంగా డయాబెటిస్‌తో బాధపడుతున్న సుమారు 5 బిలియన్ల మంది ప్రజల జీవన నాణ్యతను పునరుద్ధరించే సామర్థ్యం వీటికి ఉంది.
నోటి ద్వారా ఇన్సులిన్ తీసుకునే ప్రయత్నాలలో నానోపార్టికల్ టెక్నాలజీ ఒక ముఖ్యమైన పురోగతిని అందించింది4,6,7. ఇది ఇన్సులిన్‌ను సమర్థవంతంగా పొదిగి, క్షీణత నుండి రక్షించి, శరీరంలోని నిర్దిష్ట ప్రదేశాలకు లక్ష్యంగా చేరవేస్తుంది. అయితే, నానోపార్టికల్ ఫార్ములేషన్ల వాడకంలో అనేక పరిమితులు ఉన్నాయి, ప్రధానంగా పార్టికల్ సస్పెన్షన్ల స్థిరత్వ సమస్యల కారణంగా. నిల్వ సమయంలో కొంత సముదాయం ఏర్పడవచ్చు, ఇది ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్ యొక్క జీవ లభ్యతను తగ్గిస్తుంది8. అదనంగా, ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి, నానోపార్టికల్స్ మరియు ఇన్సులిన్ యొక్క పాలిమర్ మ్యాట్రిక్స్ యొక్క రసాయన స్థిరత్వాన్ని కూడా పరిగణనలోకి తీసుకోవాలి. ప్రస్తుతం, నిల్వ సమయంలో అవాంఛిత మార్పులను నివారిస్తూ స్థిరమైన NPs ను సృష్టించడానికి ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ టెక్నాలజీ ఒక అత్యుత్తమ ప్రమాణంగా ఉంది9.
అయితే, మంచు స్ఫటికాల యాంత్రిక ఒత్తిడి వల్ల నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క గోళాకార నిర్మాణం ప్రభావితం కాకుండా నిరోధించడానికి, ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ ప్రక్రియలో క్రయోప్రొటెక్టెంట్లను జోడించాల్సి ఉంటుంది. క్రయోప్రొటెక్టెంట్ బరువు నిష్పత్తిలో అధిక భాగాన్ని ఆక్రమించడం వల్ల, లైయోఫిలైజేషన్ తర్వాత ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ లోడింగ్ గణనీయంగా తగ్గుతుంది. అందువల్ల, ఇన్సులిన్ యొక్క చికిత్సా పరిధిని (థెరప్యూటిక్ విండో) సాధించడానికి అధిక మొత్తంలో పొడి నానోపార్టికల్స్ అవసరం కావడం వలన, ఈ విధంగా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ తరచుగా ఓరల్ టాబ్లెట్లు మరియు ఓరల్ ఫిల్మ్‌ల వంటి పొడి రూపంలో ఉండే ఫార్ములేషన్ల తయారీకి అనుచితంగా ఉంటాయి.
ఫార్మాస్యూటికల్ పరిశ్రమలో ద్రవ దశల నుండి పొడి పదార్థాలను ఉత్పత్తి చేయడానికి స్ప్రే డ్రైయింగ్ అనేది ఒక సుప్రసిద్ధమైన మరియు చవకైన పారిశ్రామిక-స్థాయి ప్రక్రియ¹⁰,¹¹. కణాల ఏర్పాటు ప్రక్రియపై నియంత్రణ అనేక జీవక్రియాశీల సమ్మేళనాలను సరిగ్గా ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది¹²,¹³. అంతేకాకుండా, నోటి ద్వారా తీసుకునేందుకు వీలుగా ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లను తయారు చేయడానికి ఇది ఒక సమర్థవంతమైన సాంకేతికతగా మారింది. స్ప్రే డ్రైయింగ్ సమయంలో, నీరు చాలా వేగంగా ఆవిరైపోతుంది, ఇది కణం యొక్క కేంద్రకం ఉష్ణోగ్రతను తక్కువగా ఉంచడానికి సహాయపడుతుంది¹¹,¹⁴, తద్వారా వేడికి సున్నితమైన భాగాలను ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయడానికి దీనిని ఉపయోగించవచ్చు. స్ప్రే డ్రైయింగ్‌కు ముందు, పూత పదార్థాన్ని ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయబడిన పదార్థాలు ఉన్న ద్రావణంతో పూర్తిగా హోమోజనైజ్ చేయాలి¹¹,¹⁴. ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్‌కు భిన్నంగా, స్ప్రే-డ్రైయింగ్‌లో ఎన్‌క్యాప్సులేషన్‌కు ముందు హోమోజనైజేషన్ చేయడం వల్ల డీహైడ్రేషన్ సమయంలో ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం మెరుగుపడుతుంది. స్ప్రే-డ్రైయింగ్ ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ ప్రక్రియకు క్రయోప్రొటెక్టెంట్లు అవసరం లేనందున, అధిక లోడింగ్ కంటెంట్‌తో ఎండిన నానోపార్టికల్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి స్ప్రే-డ్రైయింగ్‌ను ఉపయోగించవచ్చు.
ఈ అధ్యయనం, అయాన్ జెల్ పద్ధతిని ఉపయోగించి కైటోసాన్ మరియు సోడియం ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్‌లను క్రాస్-లింక్ చేయడం ద్వారా ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్ (NPs) ఉత్పత్తిని నివేదిస్తుంది. అయాన్ జెలేషన్ అనేది ఒక తయారీ పద్ధతి, ఇది నిర్దిష్ట పరిస్థితులలో రెండు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ అయానిక జాతుల మధ్య స్థిర విద్యుత్ పరస్పర చర్యల ద్వారా నానోపార్టికల్స్ ఉత్పత్తికి వీలు కల్పిస్తుంది. ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన కైటోసాన్/సోడియం ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్/ఇన్సులిన్ క్రాస్-లింక్డ్ నానోపార్టికల్స్‌ను నిర్జలీకరణం చేయడానికి ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైయింగ్ అనే రెండు పద్ధతులను ఉపయోగించారు. నిర్జలీకరణం తర్వాత, వాటి స్వరూపాన్ని SEM ద్వారా విశ్లేషించారు. వాటి పరిమాణ పంపిణీ, ఉపరితల ఆవేశం, PDI, ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం మరియు లోడింగ్ కంటెంట్‌ను కొలవడం ద్వారా వాటి పునఃసంయోగ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేశారు. వివిధ నిర్జలీకరణ పద్ధతుల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన తిరిగి ద్రావణీకరించబడిన నానోపార్టికల్స్ యొక్క నాణ్యతను, వాటి ఇన్సులిన్ రక్షణ, విడుదల ప్రవర్తన మరియు కణ గ్రహణ సామర్థ్యాన్ని పోల్చడం ద్వారా కూడా అంచనా వేశారు.
మిశ్రమ ద్రావణం యొక్క pH మరియు కైటోసాన్, ఇన్సులిన్ నిష్పత్తి అనేవి తుది నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క కణ పరిమాణం మరియు ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం (EE)పై ప్రభావం చూపే రెండు కీలక కారకాలు, ఎందుకంటే అవి అయనోట్రోపిక్ జెలేషన్ ప్రక్రియను నేరుగా ప్రభావితం చేస్తాయి. మిశ్రమ ద్రావణం యొక్క pH, కణ పరిమాణం మరియు ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యంతో అధిక సంబంధం కలిగి ఉందని చూపబడింది (పటం 1a). పటం 1aలో చూపినట్లుగా, pH 4.0 నుండి 6.0కు పెరిగినప్పుడు, సగటు కణ పరిమాణం (nm) తగ్గింది మరియు EE గణనీయంగా పెరిగింది, అయితే pH 6.5కు పెరిగినప్పుడు, సగటు కణ పరిమాణం పెరగడం ప్రారంభమైంది మరియు EEలో ఎటువంటి మార్పు లేదు. కైటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్ నిష్పత్తి పెరిగేకొద్దీ, సగటు కణ పరిమాణం కూడా పెరుగుతుంది. అంతేకాకుండా, కైటోసాన్/ఇన్సులిన్ ద్రవ్యరాశి నిష్పత్తి 2.5:1 (w/w) కంటే ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు నానోపార్టికల్స్‌ను తయారు చేసినప్పుడు EEలో ఎటువంటి మార్పు గమనించబడలేదు (పటం 1b). అందువల్ల, ఈ అధ్యయనంలోని ఉత్తమ తయారీ పరిస్థితులు (pH 6.0, కైటోసాన్/ఇన్సులిన్ ద్రవ్యరాశి నిష్పత్తి 2.5:1) ఉపయోగించబడ్డాయి. తదుపరి అధ్యయనం కోసం ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్‌ను తయారుచేయడం జరిగింది. ఈ తయారీ పరిస్థితులలో, ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క సగటు కణ పరిమాణం 318 nm (Fig. 1c) గా ఆప్టిమైజ్ చేయబడింది, PDI 0.18, ఎంబెడ్డింగ్ సామర్థ్యం 99.4%, జీటా పొటెన్షియల్ 9.8 mv, మరియు ఇన్సులిన్ లోడింగ్ 25.01% (m/m) గా ఉన్నాయి. ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) ఫలితాల ఆధారంగా, ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్ సుమారుగా గోళాకారంగా మరియు సాపేక్షంగా ఏకరీతి పరిమాణంతో విడివిడిగా ఉన్నాయి (Fig. 1d).
ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క పారామీటర్ ఆప్టిమైజేషన్: (ఎ) ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క సగటు వ్యాసం మరియు ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం (EE) పై pH ప్రభావం (చిటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్ 5:1 ద్రవ్యరాశి నిష్పత్తిలో తయారు చేయబడినవి); (బి) ఇన్సులిన్ NPs యొక్క సగటు వ్యాసం మరియు ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం (EE) పై చిటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్ ద్రవ్యరాశి నిష్పత్తి ప్రభావం (pH 6 వద్ద తయారు చేయబడినవి); (సి) ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క కణ పరిమాణ పంపిణీ; (డి) ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన ఇన్సులిన్ NPs యొక్క TEM మైక్రోగ్రాఫ్.
చిటోసాన్ 6.5 pKa విలువ కలిగిన ఒక బలహీనమైన పాలీఎలెక్ట్రోలైట్ అని అందరికీ తెలిసిందే. దీని ప్రధాన అమైనో సమూహం హైడ్రోజన్ అయాన్ల ద్వారా ప్రోటోనేట్ చేయబడటం వలన, ఇది ఆమ్ల మాధ్యమంలో ధనాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడుతుంది¹⁵. అందువల్ల, రుణాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడిన మాక్రోమాలిక్యూల్స్‌ను ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయడానికి దీనిని తరచుగా ఒక క్యారియర్‌గా ఉపయోగిస్తారు. ఈ అధ్యయనంలో, 5.3 ఐసోఎలెక్ట్రిక్ పాయింట్ కలిగిన ఇన్సులిన్‌ను ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయడానికి చిటోసాన్‌ను ఉపయోగించారు. చిటోసాన్‌ను ఒక కోటింగ్ మెటీరియల్‌గా ఉపయోగిస్తున్నందున, దాని నిష్పత్తి పెరిగేకొద్దీ, నానోపార్టికల్స్ యొక్క బయటి పొర మందం కూడా దానికి అనుగుణంగా పెరుగుతుంది, ఫలితంగా సగటు కణ పరిమాణం పెద్దదిగా ఉంటుంది. అదనంగా, అధిక స్థాయిలో ఉన్న చిటోసాన్ ఎక్కువ ఇన్సులిన్‌ను ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయగలదు. మా విషయంలో, చిటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్ నిష్పత్తి 2.5:1కి చేరినప్పుడు EE అత్యధికంగా ఉంది, మరియు నిష్పత్తి పెరుగుతూ పోయినప్పుడు EEలో గణనీయమైన మార్పు ఏమీ లేదు.
కైటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్ నిష్పత్తితో పాటు, నానోపార్టికల్స్ (NPs) తయారీలో pH కూడా కీలక పాత్ర పోషించింది. గాన్ మరియు ఇతరులు 17 కైటోసాన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క కణ పరిమాణంపై pH ప్రభావాన్ని అధ్యయనం చేశారు. pH 6.0కి చేరే వరకు కణ పరిమాణంలో నిరంతర తగ్గుదల ఉందని వారు కనుగొన్నారు, మరియు pH > 6.0 వద్ద కణ పరిమాణంలో గణనీయమైన పెరుగుదల గమనించబడింది, ఇది మా పరిశీలనలకు అనుగుణంగా ఉంది. ఈ దృగ్విషయానికి కారణం ఏమిటంటే, pH పెరిగేకొద్దీ, ఇన్సులిన్ అణువు రుణాత్మక ఉపరితల చార్జ్‌ను పొందుతుంది, తద్వారా కైటోసాన్/సోడియం ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్ (TPP) కాంప్లెక్స్‌తో ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యలకు అనుకూలంగా ఉంటుంది, ఫలితంగా చిన్న కణ పరిమాణం మరియు అధిక EE ఏర్పడతాయి. అయితే, pH 6.5కి సర్దుబాటు చేసినప్పుడు, కైటోసాన్‌లోని అమైనో సమూహాలు డీప్రోటోనేట్ చేయబడ్డాయి, ఫలితంగా కైటోసాన్ మడతపడింది. అందువల్ల, అధిక pH వలన అమైనో అయాన్లు TPP మరియు ఇన్సులిన్‌కు తక్కువగా బహిర్గతమవుతాయి, ఫలితంగా తక్కువ క్రాస్-లింకింగ్, పెద్ద తుది సగటు కణ పరిమాణం మరియు తక్కువ EE ఏర్పడతాయి.
ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైడ్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క స్వరూప లక్షణాల విశ్లేషణ, మెరుగైన నిర్జలీకరణ మరియు పొడి తయారీ పద్ధతుల ఎంపికకు మార్గనిర్దేశం చేస్తుంది. ప్రాధాన్యతనిచ్చే పద్ధతి ఔషధ స్థిరత్వం, ఏకరీతి కణ ఆకారం, అధిక ఔషధ లోడింగ్ మరియు అసలు ద్రావణంలో మంచి ద్రావణీయతను అందించాలి. ఈ అధ్యయనంలో, రెండు పద్ధతులను మెరుగ్గా పోల్చడానికి, నిర్జలీకరణ సమయంలో 1% మాన్నిటాల్‌తో లేదా లేకుండా ఇన్సులిన్ NPs ఉపయోగించబడ్డాయి. ఫ్రీజ్ డ్రైయింగ్ మరియు స్ప్రే డ్రైయింగ్ కోసం వివిధ పొడి ఫార్ములేషన్లలో మాన్నిటాల్‌ను బల్కింగ్ ఏజెంట్‌గా లేదా క్రయోప్రొటెక్టెంట్‌గా ఉపయోగిస్తారు. మాన్నిటాల్ లేని లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ కోసం, చిత్రం 2aలో చూపిన విధంగా, స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (SEM) కింద పెద్ద, క్రమరహిత మరియు గరుకైన ఉపరితలాలతో కూడిన అత్యంత పోరస్ పొడి నిర్మాణం గమనించబడింది. నిర్జలీకరణం తర్వాత పొడిలో కొన్ని వివిక్త కణాలు కనుగొనబడ్డాయి (చిత్రం 2e). ఈ ఫలితాలు ఏ క్రయోప్రొటెక్టెంట్ లేకుండా ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ సమయంలో చాలా NPs విచ్ఛిన్నమయ్యాయని సూచించాయి. 1% మాన్నిటాల్ కలిగిన ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ కోసం, నునుపైన ఉపరితలాలతో గోళాకార నానోపార్టికల్స్ గమనించబడ్డాయి (చిత్రం 2e). 2b,d,f,h). మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రై చేసిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ గోళాకారంగానే ఉన్నాయి కానీ ఉపరితలంపై ముడతలు పడ్డాయి (Fig. 2c). గోళాకార మరియు ముడతలు పడిన ఉపరితలాల గురించి కింద ఇవ్వబడిన విడుదల ప్రవర్తన మరియు సెల్యులార్ అప్‌టేక్ పరీక్షలలో మరింతగా చర్చించబడింది. ఎండిన NPల దృశ్య రూపాన్ని బట్టి, మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రై చేసిన NPలు మరియు మాన్నిటాల్‌తో ఫ్రీజ్-డ్రై మరియు స్ప్రే-డ్రై చేసిన NPలు రెండూ సూక్ష్మమైన NPల పొడిని ఇచ్చాయి (Fig. 2f,g,h). కణాల ఉపరితలాల మధ్య ఉపరితల వైశాల్యం ఎంత ఎక్కువగా ఉంటే, ద్రావణీయత అంత ఎక్కువగా ఉంటుంది మరియు అందువల్ల విడుదల రేటు కూడా అంత ఎక్కువగా ఉంటుంది.
వివిధ డీహైడ్రేటెడ్ ఇన్సులిన్ NPల స్వరూపం: (a) మాన్నిటాల్ లేని లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రం; (b) మాన్నిటాల్‌తో కూడిన లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రం; (c) మాన్నిటాల్ లేని స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రం; (d) మాన్నిటాల్‌తో స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రం; (e) మాన్నిటాల్ లేని లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ NPల పొడి చిత్రం; (f) మాన్నిటాల్‌తో కూడిన లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ NPల చిత్రం; (g) మాన్నిటాల్ లేని స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ NPల పొడి చిత్రం; (h) మాన్నిటాల్‌తో స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన ఇన్సులిన్ NPల పొడి చిత్రం.
ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ సమయంలో, మాన్నిటాల్ ఒక క్రయోప్రొటెక్టెంట్‌గా పనిచేస్తుంది, ఇది NPలను అమార్ఫస్ రూపంలో ఉంచుతుంది మరియు మంచు స్ఫటికాల వల్ల కలిగే నష్టాన్ని నివారిస్తుంది¹⁹. దీనికి విరుద్ధంగా, స్ప్రే డ్రైయింగ్ సమయంలో ఫ్రీజింగ్ దశ ఉండదు. అందువల్ల ఈ పద్ధతిలో మాన్నిటాల్ అవసరం లేదు. వాస్తవానికి, ఇంతకు ముందు వివరించినట్లుగా, మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన NPలు మరింత సూక్ష్మమైన NPలను అందించాయి. అయినప్పటికీ, స్ప్రే-డ్రైయింగ్ ప్రక్రియలో మాన్నిటాల్ ఒక ఫిల్లర్‌గా పనిచేసి NPలకు మరింత గోళాకార నిర్మాణాన్ని ఇస్తుంది²⁰ (Fig. 2d), ఇది అటువంటి ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ NPల ఏకరీతి విడుదల ప్రవర్తనను పొందడంలో సహాయపడుతుంది. అదనంగా, మాన్నిటాల్ కలిగిన ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ NPలు రెండింటిలోనూ కొన్ని పెద్ద కణాలను గుర్తించవచ్చని స్పష్టమవుతోంది (Fig. 2b,d), ఇది ఎన్‌క్యాప్సులేట్ చేయబడిన ఇన్సులిన్‌తో పాటు కణం యొక్క కేంద్రకంలో మాన్నిటాల్ పేరుకుపోవడం వల్ల కావచ్చు. చిటోసాన్ పొర. ఈ అధ్యయనంలో, నిర్జలీకరణం తర్వాత గోళాకార నిర్మాణం చెక్కుచెదరకుండా ఉండేలా చూసుకోవడానికి, మానిటాల్ మరియు చిటోసాన్ నిష్పత్తిని 5:1 గా ఉంచడం గమనార్హం, తద్వారా అధిక మొత్తంలో ఉండే ఫిల్లర్, ఎండిన NPల కణ పరిమాణాన్ని కూడా పెంచగలదు.
ఫోరియర్ ట్రాన్స్‌ఫార్మ్ ఇన్‌ఫ్రారెడ్ అటెన్యూయేటెడ్ టోటల్ రిఫ్లెక్షన్ (FTIR-ATR) స్పెక్ట్రోస్కోపీ, ఫ్రీ ఇన్సులిన్, కైటోసాన్, TPP మరియు ఇన్సులిన్‌ల భౌతిక మిశ్రమాన్ని వర్గీకరించింది. డీహైడ్రేట్ చేయబడిన అన్ని NPలను FTIR-ATR స్పెక్ట్రోస్కోపీని ఉపయోగించి వర్గీకరించారు. ముఖ్యంగా, మాన్నిటాల్‌తో ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ చేయబడిన ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ NPలలో మరియు మాన్నిటాల్‌తో మరియు లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేయబడిన NPలలో 1641, 1543 మరియు 1412 cm-1 బ్యాండ్ తీవ్రతలు గమనించబడ్డాయి (Fig. 3). గతంలో నివేదించినట్లుగా, బలం యొక్క ఈ పెరుగుదలలు కైటోసాన్, TPP మరియు ఇన్సులిన్‌ల మధ్య క్రాస్-లింకింగ్‌తో ముడిపడి ఉన్నాయి. కైటోసాన్ మరియు ఇన్సులిన్‌ల మధ్య పరస్పర చర్య యొక్క పరిశోధనలో, ఇన్సులిన్-లోడెడ్ కైటోసాన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క FTIR స్పెక్ట్రాలో, కైటోసాన్ బ్యాండ్ ఇన్సులిన్ బ్యాండ్‌తో అతివ్యాప్తి చెంది, కార్బోనిల్ తీవ్రత (1641 cm-1) మరియు అమైన్ (1543 cm-1) బెల్ట్‌ను పెంచుతుందని తేలింది. TPP యొక్క ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్ సమూహాలు కైటోసాన్‌లోని అమ్మోనియం సమూహాలతో అనుసంధానించబడి, ఒక బ్యాండ్‌ను ఏర్పరుస్తాయి. 1412 సెం.మీ-1.
స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్, కైటోసాన్, కైటోసాన్/TPP/ఇన్సులిన్ యొక్క భౌతిక మిశ్రమాలు మరియు వివిధ పద్ధతుల ద్వారా నిర్జలీకరణం చేయబడిన NPల యొక్క FTIR-ATR స్పెక్ట్రాలు.
ఇంకా, ఈ ఫలితాలు SEM లో చూపిన వాటితో సరిపోలుతున్నాయి. SEM లో, మాన్నిటాల్‌తో స్ప్రే చేసినప్పుడు మరియు ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ చేసినప్పుడు కూడా ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ NPలు చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నాయని, కానీ మాన్నిటాల్ లేనప్పుడు కేవలం స్ప్రే-డ్రైయింగ్ మాత్రమే ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ కణాలను ఉత్పత్తి చేసిందని తేలింది. దీనికి విరుద్ధంగా, మాన్నిటాల్ లేకుండా ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ చేసిన NPల యొక్క FTIR-ATR స్పెక్ట్రల్ ఫలితాలు, కైటోసాన్, TPP మరియు ఇన్సులిన్ యొక్క భౌతిక మిశ్రమాన్ని చాలా పోలి ఉన్నాయి. ఈ ఫలితం, మాన్నిటాల్ లేకుండా ఫ్రీజ్-డ్రై చేసిన NPలలో కైటోసాన్, TPP మరియు ఇన్సులిన్ మధ్య క్రాస్-లింక్‌లు ఇకపై ఉండవని సూచిస్తుంది. క్రయోప్రొటెక్టెంట్ లేకుండా ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ చేసే సమయంలో NPల నిర్మాణం నాశనమైంది, దీనిని SEM ఫలితాలలో (Fig. 2a) చూడవచ్చు. డీహైడ్రేటెడ్ ఇన్సులిన్ NPల యొక్క మార్ఫాలజీ మరియు FTIR ఫలితాల ఆధారంగా, పునఃసంయోజన ప్రయోగాల కోసం కేవలం లైయోఫైలైజ్డ్, స్ప్రే-డ్రైడ్ మరియు మాన్నిటాల్-రహిత NPలను మాత్రమే ఉపయోగించారు. నిర్జలీకరణం. చర్చించండి.
దీర్ఘకాలిక నిల్వ మరియు ఇతర ఫార్ములేషన్‌లుగా పునఃప్రక్రియ చేయడానికి నిర్జలీకరణం ఉపయోగించబడుతుంది. టాబ్లెట్లు మరియు ఫిల్మ్‌ల వంటి వివిధ ఫార్ములేషన్‌లలో వాటి ఉపయోగం కోసం, నిల్వ తర్వాత పొడి నానోపార్టికల్స్ (NPs) పునఃసంయోగం చెందే సామర్థ్యం చాలా కీలకం. మాన్నిటాల్ లేనప్పుడు స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క సగటు కణ పరిమాణం పునఃసంయోగం తర్వాత కేవలం కొద్దిగా మాత్రమే పెరిగిందని మేము గమనించాము. మరోవైపు, మాన్నిటాల్‌తో కూడిన స్ప్రే-డ్రైడ్ మరియు ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క కణ పరిమాణం గణనీయంగా పెరిగింది (పట్టిక 1). ఈ అధ్యయనంలోని అన్ని నానోపార్టికల్స్‌ను తిరిగి కలిపిన తర్వాత PDI మరియు EE గణనీయంగా మారలేదు (p > 0.05) (పట్టిక 1). ఈ ఫలితం, తిరిగి కరిగించిన తర్వాత చాలా కణాలు చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నాయని సూచిస్తుంది. అయితే, మాన్నిటాల్ కలపడం వల్ల లైయోఫిలైజ్డ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైడ్ మాన్నిటాల్ నానోపార్టికల్స్‌లో ఇన్సులిన్ లోడింగ్ బాగా తగ్గింది (పట్టిక 1). దీనికి విరుద్ధంగా, మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన నానోపార్టికల్స్‌లోని ఇన్సులిన్ లోడ్ కంటెంట్ మునుపటిలాగే ఉంది (పట్టిక 1).
ఔషధ పంపిణీ ప్రయోజనాల కోసం నానోపార్టికల్స్‌ను ఉపయోగించినప్పుడు వాటి లోడింగ్ చాలా కీలకమని అందరికీ తెలిసిందే. తక్కువ లోడింగ్ ఉన్న నానోపార్టికల్స్‌కు, చికిత్సా పరిమితిని చేరుకోవడానికి చాలా పెద్ద మొత్తంలో పదార్థం అవసరం అవుతుంది. అయితే, ఇంత అధిక నానోపార్టికల్స్ గాఢతల యొక్క అధిక స్నిగ్ధత, వరుసగా నోటి ద్వారా తీసుకునే మరియు ఇంజెక్టబుల్ ఫార్ములేషన్లలో అసౌకర్యానికి మరియు కష్టానికి దారితీస్తుంది 22. అదనంగా, ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను టాబ్లెట్లు మరియు జిగట బయోఫిల్మ్‌లను తయారు చేయడానికి కూడా ఉపయోగించవచ్చు23, 24, దీనికి తక్కువ లోడింగ్ స్థాయిలలో పెద్ద మొత్తంలో నానోపార్టికల్స్ వాడకం అవసరం అవుతుంది, ఫలితంగా పెద్ద టాబ్లెట్లు మరియు మందపాటి బయోఫిల్మ్‌లు ఏర్పడతాయి, ఇవి నోటి ద్వారా తీసుకునే అనువర్తనాలకు అనుకూలంగా ఉండవు. అందువల్ల, అధిక ఇన్సులిన్ లోడ్ ఉన్న డీహైడ్రేటెడ్ నానోపార్టికల్స్ చాలా ఆవశ్యకం. మా ఫలితాలు మాన్నిటాల్-రహిత స్ప్రే-డ్రైడ్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క అధిక ఇన్సులిన్ లోడ్ ఈ ప్రత్యామ్నాయ పంపిణీ పద్ధతులకు అనేక ఆకర్షణీయమైన ప్రయోజనాలను అందించగలదని సూచిస్తున్నాయి.
డీహైడ్రేట్ చేయబడిన అన్ని NPలను మూడు నెలల పాటు రిఫ్రిజిరేటర్‌లో ఉంచారు. మూడు నెలల నిల్వ సమయంలో డీహైడ్రేట్ చేయబడిన అన్ని NPల స్వరూపం గణనీయంగా మారలేదని SEM ఫలితాలు చూపించాయి (Fig. 4). నీటిలో పునఃసంయోగం చేసిన తర్వాత, అన్ని NPలు EEలో స్వల్ప తగ్గుదల చూపించాయి మరియు మూడు నెలల నిల్వ కాలంలో సుమారుగా తక్కువ మొత్తంలో (~5%) ఇన్సులిన్‌ను విడుదల చేశాయి (Table 2). అయితే, అన్ని నానోపార్టికల్స్ యొక్క సగటు కణ పరిమాణం పెరిగింది. మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన NPల కణ పరిమాణం 525 nmకి పెరిగింది, అయితే మాన్నిటాల్‌తో స్ప్రే-డ్రైడ్ మరియు ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ చేసిన NPల కణ పరిమాణం వరుసగా 872 మరియు 921 nmకి పెరిగింది (Table 2).
మూడు నెలల పాటు నిల్వ ఉంచిన వివిధ డీహైడ్రేటెడ్ ఇన్సులిన్ NPల స్వరూపం: (a) మాన్నిటాల్‌తో కూడిన లైయోఫిలైజ్డ్ ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రం; (b) మాన్నిటాల్ లేని స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క SEM చిత్రం; (c) మాన్నిటాల్ లేని స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ NPల SEM చిత్రాలు.
ఇంకా, మాన్నిటాల్‌తో స్ప్రే-డ్రై చేసి, ఫ్రీజ్-డ్రై చేసిన పునఃసంయోజిత ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌లో అవక్షేపాలు కనిపించాయి (Fig. S2). పెద్ద కణాలు నీటిలో సరిగ్గా కలవకపోవడం దీనికి కారణం కావచ్చు. పై ఫలితాలన్నీ స్ప్రే డ్రైయింగ్ పద్ధతి ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను నిర్జలీకరణం నుండి కాపాడగలదని మరియు ఎలాంటి ఫిల్లర్లు లేదా క్రయోప్రొటెక్టెంట్లు లేకుండా అధిక మోతాదులో ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను పొందవచ్చని నిరూపిస్తున్నాయి.
నిర్జలీకరణం తర్వాత ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియకు వ్యతిరేకంగా NPల రక్షణాత్మక సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శించడానికి, పెప్సిన్, ట్రిప్సిన్ మరియు α-కైమోట్రిప్సిన్‌తో pH = 2.5 మాధ్యమంలో ఇన్సులిన్ నిలుపుదలని పరీక్షించారు. నిర్జలీకరణం చేయబడిన NPల ఇన్సులిన్ నిలుపుదలని, తాజాగా తయారుచేసిన NPలతో పోల్చారు మరియు స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్‌ను నెగటివ్ కంట్రోల్‌గా ఉపయోగించారు. ఈ అధ్యయనంలో, మూడు ఎంజైమాటిక్ చికిత్సలలోనూ స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్ 4 గంటలలోపు వేగంగా తొలగిపోవడాన్ని చూపించింది (పటం 5a–c). దీనికి విరుద్ధంగా, మాన్నిటాల్‌తో ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ చేసిన NPలు మరియు మాన్నిటాల్‌తో లేదా లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన NPల ఇన్సులిన్ తొలగింపు పరీక్షలో, ఈ NPలు ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియకు వ్యతిరేకంగా గణనీయంగా అధిక రక్షణను చూపించాయి, ఇది తాజాగా తయారుచేసిన ఇన్సులిన్ NPల మాదిరిగానే ఉంది (పటం 1). పెప్సిన్, ట్రిప్సిన్ మరియు α-కైమోట్రిప్సిన్‌లోని నానోపార్టికల్స్ సహాయంతో, వరుసగా 4 గంటలలోపు 50%, 60% మరియు 75% కంటే ఎక్కువ ఇన్సులిన్‌ను రక్షించగలిగారు (పటం). 5a–c). ఈ ఇన్సులిన్-రక్షక సామర్థ్యం రక్తప్రవాహంలోకి అధిక ఇన్సులిన్ శోషణ అవకాశాన్ని పెంచుతుంది25. ఈ ఫలితాలు మాన్నిటాల్‌తో లేదా మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే డ్రైయింగ్ మరియు మాన్నిటాల్‌తో ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ చేయడం వల్ల నిర్జలీకరణం తర్వాత NPల ఇన్సులిన్-రక్షక సామర్థ్యాన్ని కాపాడుకోవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
నిర్జలీకరణం చేయబడిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క రక్షణ మరియు విడుదల ప్రవర్తన: (ఎ) పెప్సిన్ ద్రావణంలో ఇన్సులిన్ యొక్క రక్షణ; (బి) ట్రిప్సిన్ ద్రావణంలో ఇన్సులిన్ యొక్క రక్షణ; (సి) α-కైమోట్రిప్సిన్ ద్రావణం ద్వారా ఇన్సులిన్ యొక్క రక్షణ; (డి) pH = 2.5 ద్రావణంలో నిర్జలీకరణం చేయబడిన NPs యొక్క విడుదల ప్రవర్తన; (ఇ) pH = 6.6 ద్రావణంలో నిర్జలీకరణం చేయబడిన NPs యొక్క విడుదల ప్రవర్తన; (ఎఫ్) pH = 7.0 ద్రావణంలో నిర్జలీకరణం చేయబడిన NPs యొక్క విడుదల ప్రవర్తన.
ఇన్సులిన్ నిరోధకతపై ఇన్సులిన్ ప్రభావాన్ని పరిశీలించడానికి, తాజాగా తయారుచేసి, పునఃసంఘటితం చేసిన పొడి ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను, జీర్ణాశయం, ఆంత్రమూలం మరియు పై చిన్న ప్రేగు యొక్క pH వాతావరణాన్ని అనుకరించే విధంగా, 37 °C వద్ద వివిధ బఫర్‌లలో (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ఇంక్యుబేట్ చేశారు. వివిధ వాతావరణాలలో విడుదల ప్రవర్తన. జీర్ణాశయ నాళం యొక్క భాగం. pH = 2.5 వద్ద, ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన NPలు మరియు తిరిగి ద్రావణీకరించబడిన పొడి ఇన్సులిన్ NPలు మొదటి ఒక గంటలో ప్రారంభ వేగవంతమైన విడుదలను చూపించాయి, దాని తరువాత 5 గంటల పాటు నెమ్మదిగా విడుదల జరిగింది (పటం 5డి). ప్రారంభంలో ఈ వేగవంతమైన విడుదల, కణం యొక్క అంతర్గత నిర్మాణంలో పూర్తిగా స్థిరంగా లేని ప్రోటీన్ అణువుల వేగవంతమైన ఉపరితల విసర్జన ఫలితంగా జరిగి ఉండవచ్చు. pH = 6.5 వద్ద, ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన NPలు మరియు పునఃసంఘటిత పొడి ఇన్సులిన్ NPలు 6 గంటల పాటు సున్నితమైన మరియు నెమ్మదైన విడుదలను చూపించాయి, ఎందుకంటే పరీక్ష ద్రావణం యొక్క pH, NPలు తయారు చేసిన ద్రావణం యొక్క pHకి సమానంగా ఉంది (పటం 5ఇ). pH = 7 వద్ద, NPలు అస్థిరంగా ఉండి, మొదటి రెండు గంటల్లోనే దాదాపు పూర్తిగా విచ్ఛిన్నమయ్యాయి (పటం 5ఎఫ్). దీనికి కారణం, అధిక pH వద్ద కైటోసాన్ యొక్క డీప్రోటోనేషన్ జరుగుతుంది, దీని ఫలితంగా పాలిమర్ నెట్‌వర్క్ తక్కువ దృఢంగా మారి, లోడ్ చేయబడిన ఇన్సులిన్ విడుదల అవుతుంది.
ఇంకా, మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రై చేసిన ఇన్సులిన్ NPలు ఇతర డీహైడ్రేటెడ్ NPల కంటే వేగవంతమైన విడుదల ప్రొఫైల్‌ను చూపించాయి (Fig. 5d–f). ఇంతకు ముందు వివరించినట్లుగా, మాన్నిటాల్ లేకుండా ఎండబెట్టిన పునఃసంయోజిత ఇన్సులిన్ NPలు అతి చిన్న కణ పరిమాణాన్ని చూపించాయి. చిన్న కణాలు పెద్ద ఉపరితల వైశాల్యాన్ని అందిస్తాయి, కాబట్టి సంబంధిత ఔషధంలో ఎక్కువ భాగం కణం యొక్క ఉపరితలం వద్ద లేదా దానికి సమీపంలో ఉంటుంది, దీని ఫలితంగా ఔషధం వేగంగా విడుదల అవుతుంది26.
MTT అస్సే ద్వారా NPల సైటోటాక్సిసిటీని పరిశోధించడం జరిగింది. చిత్రం S4లో చూపినట్లుగా, 50–500 μg/ml గాఢతలలో డీహైడ్రేటెడ్ NPలన్నీ కణాల మనుగడపై ఎటువంటి గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదని కనుగొనబడింది. దీనిని బట్టి, థెరప్యూటిక్ విండోను చేరుకోవడానికి డీహైడ్రేటెడ్ NPలన్నింటినీ సురక్షితంగా ఉపయోగించవచ్చని తెలుస్తోంది.
ఇన్సులిన్ తన శారీరక విధులను నిర్వర్తించే ప్రధాన అవయవం కాలేయం. హెప్‌జి2 (HepG2) కణాలు అనేవి ఒక మానవ హెపటోమా కణ శ్రేణి, దీనిని సాధారణంగా ఇన్ విట్రో హెపటోసైట్ అప్టేక్ మోడల్‌గా ఉపయోగిస్తారు. ఇక్కడ, ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైయింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి నిర్జలీకరణం చేయబడిన నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క సెల్యులార్ అప్టేక్‌ను అంచనా వేయడానికి హెప్‌జి2 కణాలను ఉపయోగించారు. 25 μg/mL గాఢత వద్ద ఫ్రీ FITC ఇన్సులిన్‌తో, తాజాగా తయారుచేసిన FITC ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPs మరియు సమాన ఇన్సులిన్ గాఢతల వద్ద నిర్జలీకరణం చేయబడిన FITC ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPs తో అనేక గంటల పాటు ఇంక్యుబేషన్ చేసిన తర్వాత, ఫ్లో సైటోమెట్రీ మరియు విజన్ ఉపయోగించి కాన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ ద్వారా సెల్యులార్ అప్టేక్‌ను పరిశీలించారు. క్వాంటిటేటివ్ మైక్రోస్కోపీ (CLSM) పరిశీలనలు జరిపారు. మాన్నిటాల్ లేని లైయోఫైజ్డ్ NPs నిర్జలీకరణ సమయంలో నాశనమయ్యాయి మరియు ఈ పరీక్షలో వాటిని మూల్యాంకనం చేయలేదు. తాజాగా తయారుచేసిన ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPs, మాన్నిటాల్‌తో కూడిన లైయోఫైజ్డ్ NPs, మరియు మాన్నిటాల్‌తో మరియు లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన NPs (Fig. 6a) యొక్క కణాంతర ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతలు 4.3, స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్‌ల కంటే వరుసగా 2.6, 2.4, మరియు 4.1 రెట్లు ఎక్కువ. FITC-ఇన్సులిన్ సమూహం (Fig. 6b). ఈ అధ్యయనంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన ఇన్సులిన్-లోడ్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్ యొక్క చిన్న పరిమాణం కారణంగా, స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్ కంటే ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ ఇన్సులిన్ సెల్యులార్ అప్‌టేక్‌లో మరింత శక్తివంతమైనదని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.
తాజాగా తయారుచేసిన NPలు మరియు డీహైడ్రేటెడ్ NPలతో 4 గంటల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత హెప్‌జి2 కణాల గ్రహణం: (ఎ) హెప్‌జి2 కణాల ద్వారా FITC-ఇన్సులిన్ గ్రహణం యొక్క పంపిణీ. (బి) ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించబడిన ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతల జ్యామితీయ సగటు (n = 3), *స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్‌తో పోల్చినప్పుడు P < 0.05.
అదేవిధంగా, CLSM చిత్రాలు తాజాగా తయారుచేసిన FITC-ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPలు మరియు (మానిటాల్ లేకుండా) FITC-ఇన్సులిన్-లోడెడ్ స్ప్రే-డ్రైడ్ NPల యొక్క FITC ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతలు ఇతర నమూనాల కంటే చాలా బలంగా ఉన్నాయని చూపించాయి (Fig. 6a). ఇంకా, మానిటాల్ కలపడం వల్ల, ద్రావణం యొక్క అధిక స్నిగ్ధత కణాలచే గ్రహించబడటానికి నిరోధకతను పెంచింది, ఫలితంగా ఇన్సులిన్ ఉత్పత్తి తగ్గింది. ఈ ఫలితాలు మానిటాల్-రహిత స్ప్రే-డ్రైడ్ NPలు అత్యధిక కణాలచే గ్రహించబడే సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శించాయని సూచిస్తున్నాయి, ఎందుకంటే తిరిగి కరిగించిన తర్వాత వాటి కణ పరిమాణం ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ NPల కంటే చిన్నదిగా ఉంది.
కైటోసాన్ (సగటు అణుభారం 100 KDa, 75–85% డీఎసిటిలేటెడ్)ను సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (ఓక్‌విల్, అంటారియో, కెనడా) నుండి కొనుగోలు చేశారు. సోడియం ట్రైపాలిఫాస్ఫేట్ (TPP)ను VWR (రాడ్నర్, పెన్సిల్వేనియా, USA) నుండి కొనుగోలు చేశారు. ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ ఇన్సులిన్‌ను ఫిషర్ సైంటిఫిక్ (వాల్థమ్, MA, USA) నుండి పొందారు. ఫ్లోరోసెయిన్ ఐసోథయోసయనేట్ (FITC)-లేబుల్డ్ హ్యూమన్ ఇన్సులిన్ మరియు 4′,6-డయామిడినో-2-ఫినైలిండోల్ డైహైడ్రోక్లోరైడ్ (DAPI)లను సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (ఓక్‌విల్, అంటారియో, కెనడా) నుండి కొనుగోలు చేశారు. హెప్‌జి2 (HepG2) కణ శ్రేణిని ATCC (మనాసాస్, వర్జీనియా, USA) నుండి పొందారు. మిగిలిన అన్ని రియేజెంట్లు అనలిటికల్ లేదా క్రోమాటోగ్రాఫిక్ గ్రేడ్‌కు చెందినవి.
0.1% ఎసిటిక్ ఆమ్లం కలిగిన డబుల్ డిస్టిల్డ్ వాటర్ (DD వాటర్)లో కరిగించి 1 mg/ml CS ద్రావణాన్ని తయారు చేయండి. వరుసగా DD వాటర్ మరియు 0.1% ఎసిటిక్ ఆమ్లంలో కరిగించి TPP మరియు ఇన్సులిన్ యొక్క 1 mg/ml ద్రావణాలను తయారు చేయండి. ప్రీ-ఎమల్షన్‌ను పాలిట్రాన్ PCU-2-110 హై స్పీడ్ హోమోజనైజర్ (బ్రింక్‌మాన్ ఇండ్. వెస్ట్‌బరీ, NY, USA)తో తయారు చేశారు. తయారీ ప్రక్రియ ఈ క్రింది విధంగా ఉంది: మొదటగా, 4ml ఇన్సులిన్ ద్రావణానికి 2ml TPP ద్రావణాన్ని కలిపి, ఆ మిశ్రమాన్ని 30 నిమిషాల పాటు కలియబెట్టి పూర్తిగా కలపాలి. తరువాత, ఆ మిశ్రమ ద్రావణాన్ని సిరంజి ద్వారా అధిక వేగంతో (10,000 rpm) కలుపుతూ CS ద్రావణంలోకి చుక్కల చుక్కలుగా కలపాలి. ఆ మిశ్రమాలను ఐస్ బాత్‌లో 30 నిమిషాల పాటు అధిక వేగంతో (15,000 rpm) కలుపుతూ ఉంచి, క్రాస్-లింక్డ్ ఇన్సులిన్ NPలను పొందడానికి వాటిని ఒక నిర్దిష్ట pHకి సర్దుబాటు చేశారు. ఇన్సులిన్‌ను మరింత ఏకరీతిగా చేయడానికి మరియు దాని కణ పరిమాణాన్ని తగ్గించడానికి... NPలను, ప్రోబ్-రకం సోనికేటర్ (UP 200ST, హీల్షర్ అల్ట్రాసోనిక్స్, టెల్టో, జర్మనీ) ఉపయోగించి ఐస్ బాత్‌లో అదనంగా 30 నిమిషాల పాటు సోనికేట్ చేశారు.
ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) ను 25°C వద్ద DD నీటిలో విలీనం చేసి, లైట్‌సైజర్ 500 (ఆంటన్ పార్, గ్రాజ్, ఆస్ట్రియా) ఉపయోగించి డైనమిక్ లైట్ స్కాటరింగ్ (DLS) కొలతల ద్వారా వాటి Z-సగటు వ్యాసం, పాలిడిస్పర్సిటీ ఇండెక్స్ (PDI) మరియు జీటా పొటెన్షియల్ కోసం పరీక్షించారు. వాటి స్వరూపం (మార్ఫాలజీ) మరియు పరిమాణ పంపిణీని హిటాచీ H7600 ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (TEM) (హిటాచీ, టోక్యో, జపాన్) ద్వారా వర్గీకరించారు, మరియు తదనంతరం చిత్రాలను హిటాచీ ఇమేజింగ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (హిటాచీ, టోక్యో, జపాన్) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ఇన్సులిన్ NPs యొక్క ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యం (EE) మరియు లోడింగ్ సామర్థ్యం (LC) లను అంచనా వేయడానికి, NPs ను 100 kDa మాలిక్యులర్ వెయిట్ కట్-ఆఫ్ ఉన్న అల్ట్రాఫిల్ట్రేషన్ ట్యూబ్‌లలోకి పైపెట్ చేసి, 30 నిమిషాల పాటు 500 xg వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. ఫిల్ట్రేట్‌లో ఎన్‌క్యాప్సులేట్ కాని ఇన్సులిన్‌ను క్వాటర్నరీ పంప్‌ను కలిగి ఉన్న అజిలెంట్ 1100 సిరీస్ HPLC సిస్టమ్ (అజిలెంట్, శాంటా క్లారా, కాలిఫోర్నియా, USA) ఉపయోగించి పరిమాణీకరించారు. ఆటోశాంప్లర్, కాలమ్ హీటర్, మరియు DAD డిటెక్టర్. ఇన్సులిన్‌ను C18 కాలమ్ (జోర్బాక్స్, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, అజిలెంట్, USA) ద్వారా విశ్లేషించి, 214 nm వద్ద గుర్తించారు. మొబైల్ ఫేజ్ అసిటోనైట్రిల్ మరియు నీరు, 0.1% TFA కలిగి, 10/90 నుండి 100/0 వరకు గ్రేడియంట్ నిష్పత్తులతో, 10 నిమిషాల పాటు నడపబడింది. మొబైల్ ఫేజ్‌ను 1.0 ml/min ప్రవాహ రేటుతో పంప్ చేశారు. కాలమ్ ఉష్ణోగ్రతను 20 °C కి సెట్ చేశారు. సమీకరణాలు (1) మరియు (2) ఉపయోగించి EE మరియు LC శాతాలను లెక్కించండి.
ఇన్సులిన్ NPని ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి 2.0 నుండి 4.0 వరకు వివిధ CS/ఇన్సులిన్ నిష్పత్తులను పరీక్షించారు. తయారీ సమయంలో వివిధ పరిమాణాలలో CS ద్రావణాన్ని జోడించారు, అయితే ఇన్సులిన్/TPP మిశ్రమాన్ని స్థిరంగా ఉంచారు. అన్ని ద్రావణాలను (ఇన్సులిన్, TPP మరియు CS) జోడించిన తర్వాత మిశ్రమం యొక్క pHని జాగ్రత్తగా నియంత్రించడం ద్వారా 4.0 నుండి 6.5 pH పరిధిలో ఇన్సులిన్ NPలను తయారు చేశారు. ఇన్సులిన్ NPల ఏర్పాటును ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి వివిధ pH విలువలు మరియు CS/ఇన్సులిన్ ద్రవ్యరాశి నిష్పత్తుల వద్ద ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క EE మరియు కణ పరిమాణాన్ని మూల్యాంకనం చేశారు.
ఆప్టిమైజ్ చేసిన ఇన్సులిన్ NPలను అల్యూమినియం కంటైనర్‌లో ఉంచి, కొంత టేప్‌తో బిగించిన టిష్యూతో కప్పారు. ఆ తర్వాత, స్క్రూలతో బిగించిన కంటైనర్లను ట్రే డ్రైయర్‌తో కూడిన లాబ్‌కాన్‌కో ఫ్రీజోన్ ఫ్రీజ్ డ్రైయర్ (లాబ్‌కాన్‌కో, కాన్సాస్ సిటీ, MO, USA)లో ఉంచారు. పొడి ఇన్సులిన్ NPలను పొందడానికి, 24 గంటల ప్రక్రియలో మొదటి 2 గంటలకు ఉష్ణోగ్రత మరియు వాక్యూమ్ పీడనాన్ని -10 °C, 0.350 టార్ వద్ద, మరియు మిగిలిన 22 గంటలకు 0 °C మరియు 0.120 టార్ వద్ద సెట్ చేశారు.
ఎన్‌క్యాప్సులేటెడ్ ఇన్సులిన్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి బుచి మినీ స్ప్రే డ్రైయర్ B-290 (BÜCHI, ఫ్లావిల్, స్విట్జర్లాండ్) ను ఉపయోగించారు. ఎంచుకున్న ఎండబెట్టే పారామితులు: ఉష్ణోగ్రత 100 °C, ఫీడ్ ప్రవాహం 3 L/min, మరియు గ్యాస్ ప్రవాహం 4 L/min.
డీహైడ్రేషన్‌కు ముందు మరియు తర్వాత ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను FTIR-ATR స్పెక్ట్రోస్కోపీని ఉపయోగించి వర్గీకరించారు. డీహైడ్రేట్ చేయబడిన నానోపార్టికల్స్‌తో పాటు ఫ్రీ ఇన్సులిన్ మరియు కైటోసాన్‌లను, యూనివర్సల్ ATR శాంప్లింగ్ యాక్సెసరీ (పెర్కిన్‌ఎల్‌మర్, వాల్థమ్, మసాచుసెట్స్, USA) అమర్చిన స్పెక్ట్రమ్ 100 FTIR స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (పెర్కిన్‌ఎల్‌మర్, వాల్థమ్, మసాచుసెట్స్, USA) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. 4000-600 cm2 ఫ్రీక్వెన్సీ పరిధిలో 4 cm2 రిజల్యూషన్‌తో 16 స్కాన్‌ల నుండి సిగ్నల్ సగటులను పొందారు.
హీలియోస్ నానోల్యాబ్ 650 ఫోకస్డ్ అయాన్ బీమ్-స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (FIB-SEM) (FEI, హిల్స్‌బోరో, ఒరెగాన్, USA) ద్వారా తీసిన ఫ్రీజ్-డ్రైడ్ మరియు స్ప్రే-డ్రైడ్ ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క SEM చిత్రాల ద్వారా పొడి ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క స్వరూపాన్ని అంచనా వేశారు. ఉపయోగించిన ప్రధాన పారామితులు వోల్టేజ్ 5 keV మరియు కరెంట్ 30 mA.
డీహైడ్రేట్ చేయబడిన అన్ని ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) డీహైడ్రేట్ చేయబడిన నీటిలో తిరిగి కరిగించబడ్డాయి. డీహైడ్రేషన్ తర్వాత వాటి నాణ్యతను అంచనా వేయడానికి, ఇంతకు ముందు పేర్కొన్న పద్ధతిని ఉపయోగించి పార్టికల్ సైజ్, PDI, EE మరియు LC లను మళ్ళీ పరీక్షించారు. ఎక్కువ కాలం నిల్వ చేసిన తర్వాత నానోపార్టికల్స్ యొక్క లక్షణాలను పరీక్షించడం ద్వారా అన్‌హైడ్రోఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని కూడా కొలిచారు. ఈ అధ్యయనంలో, డీహైడ్రేషన్ తర్వాత అన్ని నానోపార్టికల్స్‌ను మూడు నెలల పాటు రిఫ్రిజిరేటర్‌లో నిల్వ చేశారు. మూడు నెలల నిల్వ తర్వాత, నానోపార్టికల్స్‌ను మార్ఫలాజికల్ పార్టికల్ సైజ్, PDI, EE మరియు LC ల కోసం పరీక్షించారు.
నిర్జలీకరణం తర్వాత NPలను రక్షించడంలో ఇన్సులిన్ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, 5 mL పునఃసంయోజిత NPలను 45 mL అనుకరణ జీర్ణాశయ ద్రవం (pH 1.2, 1% పెప్సిన్‌తో), ప్రేగు ద్రవం (pH 6.8, 1% ట్రిప్సిన్‌తో) లేదా కైమోట్రిప్సిన్ ద్రావణం (100 g/mL, ఫాస్ఫేట్ బఫర్, pH 7.8లో) కలిగిన ద్రావణంలో కరిగించండి. వాటిని 37°C వద్ద 100 rpm వేగంతో కదిలిస్తూ ఇంక్యుబేట్ చేశారు. వివిధ సమయాల్లో 500 μL ద్రావణాన్ని సేకరించి, HPLC ద్వారా ఇన్సులిన్ గాఢతను నిర్ధారించారు.
తాజాగా తయారుచేసిన మరియు నిర్జలీకరణం చేయబడిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ (NPs) యొక్క ఇన్ విట్రో విడుదల ప్రవర్తనను డయాలసిస్ బ్యాగ్ పద్ధతి ద్వారా పరీక్షించారు (మాలిక్యులర్ వెయిట్ కట్-ఆఫ్ 100 kDa, స్పెక్ట్రా పోర్ ఇంక్.). తాజాగా తయారుచేసిన మరియు పునఃసంఘటిత పొడి నానోపార్టికల్స్‌ను వరుసగా కడుపు, చిన్న ప్రేగు మరియు పై చిన్న ప్రేగు యొక్క pH వాతావరణాన్ని అనుకరించడానికి pH 2.5, pH 6.6, మరియు pH 7.0 (0.1 M ఫాస్ఫేట్-బఫర్డ్ సెలైన్, PBS) వద్ద ద్రవాలలో డయాలసిస్ చేశారు. అన్ని నమూనాలను 37 °C వద్ద 200 rpm వేగంతో నిరంతరంగా కదిలిస్తూ ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 5 mL డయాలసిస్ బ్యాగ్ వెలుపల ఉన్న ద్రవాన్ని ఈ క్రింది సమయాల్లో పీల్చివేసి (ఆస్పిరేట్ చేసి), వెంటనే తాజా డయాలైసేట్‌తో పరిమాణాన్ని తిరిగి నింపారు. ద్రవంలోని ఇన్సులిన్ కాలుష్యాన్ని HPLC ద్వారా విశ్లేషించారు మరియు నానోపార్టికల్స్‌లో నిక్షిప్తమైన మొత్తం ఇన్సులిన్‌కు, విడుదలైన స్వేచ్ఛా ఇన్సులిన్ నిష్పత్తి నుండి నానోపార్టికల్స్ నుండి ఇన్సులిన్ విడుదల రేటును లెక్కించారు (సమీకరణం). 3).
మానవ హెపటోసెల్యులార్ కార్సినోమా కణ శ్రేణి అయిన హెప్‌జి2 (HepG2) కణాలను, 10% ఫీటల్ బోవైన్ సీరం, 100 IU/mL పెన్సిలిన్, మరియు 100 μg/mL స్ట్రెప్టోమైసిన్ కలిగిన డల్బెక్కోస్ మోడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియం (DMEM) ఉపయోగించి 60 mm వ్యాసం గల డిష్‌లలో పెంచారు. కల్చర్‌లను 37°C, 95% సాపేక్ష ఆర్ద్రత, మరియు 5% CO2 వద్ద నిర్వహించారు. అప్‌టేక్ అసెస్‌ల కోసం, హెప్‌జి2 కణాలను 8-వెల్ నంక్ ల్యాబ్-టెక్ ఛాంబర్ స్లైడ్ సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్, NY, USA) పై 1 × 105 కణాలు/ml చొప్పున సీడ్ చేశారు. సైటోటాక్సిసిటీ అసెస్‌ల కోసం, వాటిని 96-వెల్ ప్లేట్‌లలో (కార్నింగ్, NY, USA) 5 × 104 కణాలు/ml సాంద్రతతో సీడ్ చేశారు.
తాజాగా తయారుచేసిన మరియు నిర్జలీకరణం చేయబడిన ఇన్సులిన్ NPల యొక్క కణవిషత్వాన్ని (సైటోటాక్సిసిటీని) అంచనా వేయడానికి MTT అస్సేను ఉపయోగించారు. హెప్‌జి2 (HepG2) కణాలను 96-వెల్ ప్లేట్లలో 5 × 104 కణాలు/mL సాంద్రతతో విత్తనం చేసి, పరీక్షకు ముందు 7 రోజులు కల్చర్ చేశారు. ఇన్సులిన్ NPలను కల్చర్ మీడియంలో వివిధ సాంద్రతలకు (50 నుండి 500 μg/mL) పలుచన చేసి, ఆపై కణాలకు అందించారు. 24 గంటల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, కణాలను PBSతో 3 సార్లు కడిగి, 0.5 mg/ml MTT కలిగిన మీడియంతో అదనంగా 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. టెకాన్ ఇన్ఫినిట్ M200 ప్రో స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ప్లేట్ రీడర్ (టెకాన్, మాన్నెడోర్ఫ్, స్విట్జర్లాండ్) ఉపయోగించి 570 nm వద్ద పసుపు టెట్రాజోలియం MTT యొక్క ఎంజైమాటిక్ రిడక్షన్ ద్వారా ఊదా ఫోర్మాజాన్‌గా మారడాన్ని కొలవడం ద్వారా కణవిషత్వాన్ని అంచనా వేశారు.
NPల యొక్క సెల్యులార్ అప్‌టేక్ సామర్థ్యాన్ని కాన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోపీ మరియు ఫ్లో సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ ద్వారా పరీక్షించారు. నంక్ ల్యాబ్-టెక్ ఛాంబర్ స్లైడ్ సిస్టమ్ యొక్క ప్రతి వెల్‌కు ఫ్రీ FITC-ఇన్సులిన్, FITC-ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPలు, మరియు అదే గాఢతలో పునఃసంయోజనం చేయబడిన 25 μg/mL డీహైడ్రేటెడ్ FITC-ఇన్సులిన్ NPలతో ట్రీట్ చేసి, 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. కణాలను PBSతో 3 సార్లు కడిగి, 4% పారాఫార్మాల్డిహైడ్‌తో ఫిక్స్ చేశారు. కేంద్రకాలకు 4′,6-డయామిడినో-2-ఫినైలిండోల్ (DAPI)తో స్టెయిన్ చేశారు. ఇన్సులిన్ లోకలైజేషన్‌ను ఒలింపస్ FV1000 లేజర్ స్కానింగ్/టూ-ఫోటాన్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (ఒలింపస్, షింజుకు సిటీ, టోక్యో, జపాన్) ఉపయోగించి గమనించారు. ఫ్లో సైటోమెట్రీ విశ్లేషణ కోసం, 10 μg/mL ఫ్రీ FITC-ఇన్సులిన్, FITC-ఇన్సులిన్-లోడెడ్ NPలు, మరియు అదే గాఢతలలో ఉన్న 25 μg/mL డీహైడ్రేటెడ్ FITC-ఇన్సులిన్ NPలను ఉపయోగించారు. తిరిగి ద్రావణీకరించిన నిర్జలీకరణ FITC-ఇన్సులిన్ NPలను, HepG2 కణాలతో విత్తిన 96-వెల్ ప్లేట్లకు జోడించి, 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 4 గంటల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, కణాలను తీసివేసి, FBSతో 3 సార్లు కడిగారు. ప్రతి నమూనాకు 5 × 104 కణాలను BD LSR II ఫ్లో సైటోమీటర్ (BD, ఫ్రాంక్లిన్ లేక్స్, న్యూజెర్సీ, యునైటెడ్ స్టేట్స్) ద్వారా విశ్లేషించారు.
అన్ని విలువలు సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం రూపంలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. అన్ని సమూహాల మధ్య పోలికలను IBM SPSS స్టాటిస్టిక్స్ 26 ఫర్ మాక్ (IBM, ఎండికాట్, న్యూయార్క్, USA) ఉపయోగించి వన్-వే ANOVA లేదా t-టెస్ట్ ద్వారా అంచనా వేశారు మరియు p < 0.05 ను గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించారు.
బల్కింగ్ ఏజెంట్లు లేదా క్రయోప్రొటెక్టెంట్లను ఉపయోగించే ప్రామాణిక ఫ్రీజ్-డ్రైయింగ్ పద్ధతులతో పోలిస్తే, స్ప్రే డ్రైయింగ్ పద్ధతి క్రాస్-లింక్డ్ కైటోసాన్/TPP/ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్‌ను నిర్జలీకరణం చేయడంలో మెరుగైన పునఃసంయోజన సామర్థ్యాన్ని మరియు అధిక లోడ్ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉందని ఈ అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది. ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ సగటున 318 nm కణ పరిమాణాన్ని మరియు 99.4% ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ సామర్థ్యాన్ని అందించాయి. నిర్జలీకరణం తర్వాత వచ్చిన SEM మరియు FTIR ఫలితాలు, మాన్నిటాల్‌తో మరియు మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన నానోపార్టికల్స్‌లో మరియు మాన్నిటాల్‌తో లైయోఫైజ్ చేసిన వాటిలో మాత్రమే గోళాకార నిర్మాణం నిలబెట్టబడిందని చూపించాయి, కానీ మాన్నిటాల్ లేకుండా లైయోఫైజ్ చేసిన నానోపార్టికల్స్ నిర్జలీకరణ సమయంలో విచ్ఛిన్నమయ్యాయి. పునఃసంయోజన సామర్థ్య పరీక్షలో, మాన్నిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రైడ్ చేసిన ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్ అతి చిన్న సగటు కణ పరిమాణాన్ని మరియు పునఃసంయోజనంపై అత్యధిక లోడింగ్‌ను చూపించాయి. ఈ నిర్జలీకరణం చేయబడిన అన్ని నానోపార్టికల్స్ యొక్క విడుదల ప్రవర్తనలు, అవి pH = 2.5 మరియు pH = 7 ద్రావణాలలో వేగంగా విడుదలయ్యాయని మరియు pH = 6.5 ద్రావణంలో చాలా స్థిరంగా ఉన్నాయని చూపించాయి. ఇతర పునఃకరిగించిన నానోపార్టికల్స్‌తో పోలిస్తే... నిర్జలీకరణం చేయబడిన నానోపార్టికల్స్‌లో, మానిటాల్ లేకుండా స్ప్రే-డ్రై చేసిన నానోపార్టికల్స్ అత్యంత వేగవంతమైన విడుదలను చూపించాయి. ఈ ఫలితం సెల్యులార్ అప్‌టేక్ అస్సేలో గమనించిన దానికి అనుగుణంగా ఉంది, ఎందుకంటే మానిటాల్ లేని స్ప్రే-డ్రై చేసిన నానోపార్టికల్స్, తాజాగా తయారుచేసిన నానోపార్టికల్స్ యొక్క సెల్యులార్ అప్‌టేక్ సామర్థ్యాన్ని దాదాపు పూర్తిగా నిలుపుకున్నాయి. ఈ ఫలితాలు మానిటాల్-రహిత స్ప్రే డ్రైయింగ్ ద్వారా తయారు చేయబడిన పొడి ఇన్సులిన్ నానోపార్టికల్స్, ఓరల్ టాబ్లెట్లు లేదా బయోఅడెసివ్ ఫిల్మ్‌ల వంటి ఇతర నిర్జల మోతాదు రూపాలుగా తదుపరి ప్రాసెసింగ్ చేయడానికి అత్యంత అనుకూలమైనవని సూచిస్తున్నాయి.
మేధో సంపత్తి సమస్యల కారణంగా, ప్రస్తుత అధ్యయనంలో రూపొందించబడిన మరియు/లేదా విశ్లేషించబడిన డేటాసెట్‌లు బహిరంగంగా అందుబాటులో లేవు, కానీ సహేతుకమైన అభ్యర్థనపై సంబంధిత రచయితల నుండి వాటిని పొందవచ్చు.
కాగన్, ఎ. టైప్ 2 డయాబెటిస్: సామాజిక మరియు శాస్త్రీయ మూలాలు, వైద్యపరమైన సమస్యలు మరియు రోగులు మరియు ఇతరులపై ప్రభావాలు. (మెక్‌ఫార్లేన్, 2009).
సింగ్, AP, గ్వో, Y., సింగ్, A., క్సీ, W. & జియాంగ్, P. ఇన్సులిన్ ఎన్‌క్యాప్సులేషన్ అభివృద్ధి: నోటి ద్వారా తీసుకోవడం ఇప్పుడు సాధ్యమేనా? J. ఫార్మసీ. బయో-ఫార్మసీ. రిజర్వాయర్. 1, 74–92 (2019).
వాంగ్, సివై, అల్-సలామీ, హెచ్. & డాస్, సిఆర్ మధుమేహం చికిత్స కోసం నోటి ద్వారా తీసుకునే ఇన్సులిన్-లోడెడ్ లిపోజోమ్ డెలివరీ వ్యవస్థలలో ఇటీవలి పురోగతులు. వ్యాఖ్యానం. జె. ఫార్మసీ. 549, 201–217 (2018).