Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, మీరు మీ బ్రౌజర్ యొక్క కొత్త వెర్షన్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, నిరంతర మద్దతును అందించడానికి, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైలింగ్ లేదా జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా చూపిస్తున్నాము.
ఆటిజం స్పెక్ట్రమ్ డిజార్డర్ వంటి న్యూరోడెవలప్‌మెంటల్ రుగ్మతలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క పాత్రను అధ్యయనం చేయడానికి ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA) ఉపయోగించబడుతుంది. PPA మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్, జీవక్రియ మరియు టర్నోవర్‌కు అంతరాయం కలిగిస్తుందని తెలిసింది. అయితే, ఈ యంత్రాంగాల సంక్లిష్టమైన తాత్కాలిక స్వభావం కారణంగా మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్, ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్‌పై PPA ప్రభావాలు సమస్యాత్మకంగానే ఉన్నాయి. ఇక్కడ, న్యూరాన్ లాంటి SH-SY5Y కణాలలో PPA మైటోకాన్డ్రియల్ అల్ట్రాస్ట్రక్చర్, మార్ఫాలజీ మరియు డైనమిక్స్‌ను ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందో పరిశోధించడానికి మేము కాంప్లిమెంటరీ క్వాంటిటేటివ్ ఇమేజింగ్ టెక్నిక్‌లను ఉపయోగిస్తాము. PPA (5 mM) మైటోకాన్డ్రియల్ వైశాల్యం (p < 0.01), ఫెరెట్ వ్యాసం మరియు చుట్టుకొలత (p < 0.05), మరియు వైశాల్యం 2 (p < 0.01) లలో గణనీయమైన తగ్గుదలకు కారణమైంది. మైటోకాన్డ్రియల్ ఈవెంట్ లొకేటర్ విశ్లేషణ ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్ ఈవెంట్లలో గణనీయమైన పెరుగుదలను (p < 0.05) చూపించింది, తద్వారా ఒత్తిడి పరిస్థితులలో మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ యొక్క సమగ్రతను కాపాడుతుంది. అదనంగా, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) మరియు OPA1 (p < 0.05) యొక్క mRNA వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది. 01). ఇది ఒత్తిడి పరిస్థితులలో పనితీరును నిర్వహించడానికి మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం, జీవజననం మరియు గతిశీలత యొక్క పునర్నిర్మాణాన్ని వివరిస్తుంది. మా డేటా మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలతపై PPA ప్రభావాల గురించి కొత్త అంతర్దృష్టిని అందిస్తుంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలలో పాల్గొన్న సంక్లిష్ట నియంత్రణ యంత్రాంగాలను అధ్యయనం చేయడానికి ఇమేజింగ్ పద్ధతుల యొక్క ప్రయోజనాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది.
మైటోకాండ్రియా శక్తి ఉత్పత్తి మరియు జీవసంశ్లేషణలో వాటి సాధారణ పాత్రలకు మించి అనేక రకాల కణ విధులలో అంతర్భాగంగా పాల్గొంటాయి. మైటోకాండ్రియల్ జీవక్రియ కాల్షియం సిగ్నలింగ్, జీవక్రియ మరియు రెడాక్స్ హోమియోస్టాసిస్, ఇన్ఫ్లమేటరీ సిగ్నలింగ్, ఎపిజెనెటిక్ మార్పులు, కణాల విస్తరణ, భేదం మరియు ప్రోగ్రామ్ చేయబడిన కణ మరణం¹ లకు కీలక నియంత్రకం. ప్రత్యేకించి, మైటోకాండ్రియల్ జీవక్రియ నాడీ కణాల అభివృద్ధి, మనుగడ మరియు పనితీరుకు కీలకం మరియు న్యూరోపాథాలజీ²,³,⁴ యొక్క వివిధ రూపాలలో దీనికి విస్తృతమైన సంబంధం ఉంది.
గత దశాబ్ద కాలంలో, జీవక్రియ స్థితి న్యూరోజెనిసిస్, భేదీకరణ, పరిపక్వత మరియు ప్లాస్టిసిటీలకు కేంద్ర నియంత్రకంగా ఉద్భవించింది5,6. ఇటీవల, మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు గతిశీలత మైటోసిస్‌లో ముఖ్యమైన అంశాలుగా మారాయి. మైటోసిస్ అనేది కణాలలో ఆరోగ్యకరమైన మైటోకాన్డ్రియాల సముదాయాన్ని నిర్వహించే ఒక గతిశీల ప్రక్రియ. మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలత అనేది మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్ మరియు బయోఎనర్జెటిక్స్ నుండి మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తి, సంలీనం, రవాణా మరియు తొలగింపు వరకు విస్తరించి ఉన్న సంక్లిష్టమైన, పరస్పరాధారిత మార్గాల ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది7,8. ఈ సమగ్ర యంత్రాంగాలలో దేనిలోనైనా అంతరాయం ఏర్పడితే, అది ఆరోగ్యకరమైన మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌ల నిర్వహణను దెబ్బతీస్తుంది మరియు నాడీ అభివృద్ధిపై తీవ్రమైన క్రియాత్మక పరిణామాలను కలిగిస్తుంది9,10. నిజానికి, ఆటిజం స్పెక్ట్రమ్ డిజార్డర్స్ (ASD)తో సహా అనేక మానసిక, నాడీ క్షీణత మరియు నాడీ అభివృద్ధి సంబంధిత రుగ్మతలలో మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలత యొక్క అస్తవ్యస్తత గమనించబడింది11,12.
ASD అనేది సంక్లిష్టమైన జన్యు మరియు ఎపిజెనెటిక్ నిర్మాణంతో కూడిన ఒక వైవిధ్యమైన న్యూరోడెవలప్‌మెంటల్ రుగ్మత. ASD యొక్క వారసత్వం నిస్సందేహమైనది, కానీ దాని అంతర్లీన మాలిక్యులర్ ఎటియాలజీ ఇంకా సరిగా అర్థం కాలేదు. ప్రీక్లినికల్ నమూనాలు, క్లినికల్ అధ్యయనాలు మరియు మల్టీ-ఓమిక్స్ మాలిక్యులర్ డేటాసెట్‌ల నుండి సేకరించిన డేటా, ASDలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి పెరుగుతున్న సాక్ష్యాలను అందిస్తోంది¹³,¹⁴. మేము గతంలో ASD ఉన్న రోగుల సమూహంలో జీనోమ్-వైడ్ DNA మిథైలేషన్ స్క్రీన్‌ను నిర్వహించి, మైటోకాన్డ్రియల్ మెటబాలిక్ మార్గాల వెంబడి సమూహంగా ఉన్న విభిన్నంగా మిథైలేట్ చేయబడిన జన్యువులను గుర్తించాము¹⁵. తదనంతరం, మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్ మరియు డైనమిక్స్ యొక్క కేంద్ర నియంత్రకాల యొక్క విభిన్న మిథైలేషన్‌ను మేము నివేదించాము, ఇది ASDలో పెరిగిన mtDNA కాపీ సంఖ్య మరియు మార్చబడిన మూత్ర మెటబాలిక్ ప్రొఫైల్‌తో సంబంధం కలిగి ఉంది¹⁶. ASD యొక్క పాథోఫిజియాలజీలో మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ మరియు హోమియోస్టాసిస్ కేంద్ర పాత్ర పోషిస్తాయని మా డేటా పెరుగుతున్న సాక్ష్యాలను అందిస్తోంది. అందువల్ల, మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్, మార్ఫాలజీ మరియు ఫంక్షన్ మధ్య సంబంధం యొక్క యాంత్రిక అవగాహనను మెరుగుపరచడం అనేది ద్వితీయ మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ద్వారా వర్గీకరించబడిన నాడీ సంబంధిత వ్యాధులపై కొనసాగుతున్న పరిశోధన యొక్క ముఖ్య లక్ష్యం.
మైటోకాన్డ్రియల్ ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలలో నిర్దిష్ట జన్యువుల పాత్రను అధ్యయనం చేయడానికి తరచుగా అణు సాంకేతిక పద్ధతులను ఉపయోగిస్తారు. అయితే, మైటోటిక్ నియంత్రణ యంత్రాంగాల యొక్క బహుముఖ మరియు తాత్కాలిక స్వభావం వల్ల ఈ విధానం పరిమితం కావచ్చు. అంతేకాకుండా, మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువుల భేదాత్మక వ్యక్తీకరణ క్రియాత్మక మార్పులకు పరోక్ష సూచిక, ప్రత్యేకించి సాధారణంగా పరిమిత సంఖ్యలో జన్యువులను మాత్రమే విశ్లేషిస్తారు కాబట్టి. అందువల్ల, మైటోకాన్డ్రియల్ పనితీరు మరియు బయోఎనర్జెటిక్స్‌ను అధ్యయనం చేయడానికి మరింత ప్రత్యక్ష పద్ధతులు ప్రతిపాదించబడ్డాయి¹⁷. మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలతతో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. శక్తి ఉత్పత్తికి మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ మరియు కణ మనుగడకు మైటోకాన్డ్రియల్ ఆకారం, అనుసంధానం మరియు నిర్మాణం చాలా కీలకం⁵,¹⁸. అంతేకాకుండా, మైటోసిస్ యొక్క వివిధ భాగాలు మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపంలోని మార్పులపై దృష్టి పెడతాయి, ఇవి మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి ఉపయోగకరమైన అంతిమ ఫలితాలుగా పనిచేస్తాయి మరియు తదుపరి యాంత్రిక అధ్యయనాలకు ఆధారాన్ని అందిస్తాయి.
ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM)ని ఉపయోగించి మైటోకాండ్రియా స్వరూపాన్ని నేరుగా గమనించవచ్చు, ఇది కణ అతిసూక్ష్మ నిర్మాణాన్ని వివరంగా అధ్యయనం చేయడానికి వీలు కల్పిస్తుంది. కణ సమూహాలలో కేవలం జన్యు లిప్యంతరీకరణ, ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ క్రియాత్మక పారామితులపై ఆధారపడకుండా, TEM ప్రతి మైటోకాండ్రియా యొక్క రిజల్యూషన్‌తో మైటోకాన్డ్రియల్ క్రిస్టేల స్వరూపం, ఆకారం మరియు నిర్మాణాన్ని నేరుగా దృశ్యమానం చేస్తుంది¹⁷,¹⁹,²⁰. అదనంగా, మైటోకాన్డ్రియా మరియు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్, ఆటోఫాగోజోమ్‌ల వంటి ఇతర కణాంగాల మధ్య పరస్పర చర్యల అధ్యయనాన్ని TEM సులభతరం చేస్తుంది, ఇవి మైటోకాన్డ్రియల్ పనితీరు మరియు హోమియోస్టాసిస్‌లో కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి²¹,²². అందువల్ల, నిర్దిష్ట మార్గాలు లేదా జన్యువులపై దృష్టి పెట్టడానికి ముందు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి TEM ఒక మంచి ప్రారంభ బిందువుగా నిలుస్తుంది. న్యూరోపాథాలజీకి మైటోకాన్డ్రియల్ పనితీరు ప్రాముఖ్యత పెరుగుతున్నందున, ఇన్ విట్రో న్యూరోనల్ నమూనాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు గతిశీలతను ప్రత్యక్షంగా మరియు పరిమాణాత్మకంగా అధ్యయనం చేయగలగాల్సిన స్పష్టమైన అవసరం ఉంది.
ఈ వ్యాసంలో, ఆటిజం స్పెక్ట్రమ్ డిజార్డర్‌లో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి సంబంధించిన న్యూరోనల్ నమూనాలో మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌ను మేము పరిశీలిస్తాము. మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రొపియోనిల్-CoA కార్బాక్సిలేస్ ఎంజైమ్ PCC యొక్క సబ్‌యూనిట్ అయిన ప్రొపియోనిల్-CoA కార్బాక్సిలేస్ బీటా (PCCB) యొక్క డిఫరెన్షియల్ మిథైలేషన్‌ను మేము గతంలో ASD15లో నివేదించాము. PCC యొక్క నియంత్రణ లోపం, ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA)23,24,25తో సహా ప్రొపియోనిల్ ఉత్పన్నాల యొక్క విషపూరిత సంచయానికి కారణమవుతుందని తెలిసింది. PPA, న్యూరోనల్ జీవక్రియను దెబ్బతీస్తుందని మరియు ఇన్ వివోలో ప్రవర్తనను మారుస్తుందని చూపబడింది మరియు ASD26,27,28లో పాల్గొన్న న్యూరోడెవలప్‌మెంటల్ మెకానిజమ్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి ఇది ఒక స్థిరపడిన జంతు నమూనా. అదనంగా, PPA ఇన్ విట్రోలో మైటోకాన్డ్రియల్ మెంబ్రేన్ పొటెన్షియల్, బయోజెనిసిస్ మరియు శ్వాసక్రియను దెబ్బతీస్తుందని నివేదించబడింది మరియు న్యూరాన్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని నమూనా చేయడానికి ఇది విస్తృతంగా ఉపయోగించబడింది29,30. అయితే, PPA-ప్రేరిత మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల మైటోకాన్డ్రియల్ మార్ఫాలజీ మరియు డైనమిక్స్‌పై కలిగే ప్రభావం గురించి ఇంకా సరిగా అర్థం కాలేదు.
ఈ అధ్యయనం SH-SY5Y కణాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం, గతిశీలత మరియు పనితీరుపై PPA యొక్క ప్రభావాలను లెక్కించడానికి పరిపూరక ఇమేజింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగిస్తుంది. మొదట, మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు అల్ట్రాస్ట్రక్చర్‌లో మార్పులను దృశ్యమానం చేయడానికి మేము ఒక TEM పద్ధతిని అభివృద్ధి చేశాము¹⁷,³¹,³². మైటోకాన్డ్రియా యొక్క గతిశీల స్వభావం³³ దృష్ట్యా, PPA ఒత్తిడిలో విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీన సంఘటనల మధ్య సమతుల్యత, మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్య మరియు పరిమాణంలో మార్పులను లెక్కించడానికి మేము మైటోకాన్డ్రియల్ ఈవెంట్ లోకలైజర్ (MEL) విశ్లేషణను కూడా ఉపయోగించాము. చివరగా, మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు గతిశీలత అనేవి జీవజననం, విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీనంలో పాల్గొనే జన్యువుల వ్యక్తీకరణలోని మార్పులతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయో లేదో మేము పరిశీలించాము. మొత్తంగా, మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలతను నియంత్రించే యంత్రాంగాల సంక్లిష్టతను స్పష్టం చేయడంలో ఉన్న సవాలును మా డేటా వివరిస్తుంది. SH-SY5Y కణాలలో మైటోసిస్ యొక్క కొలవగల అభిసరణ అంతిమ బిందువుగా మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని అధ్యయనం చేయడంలో TEM యొక్క ప్రయోజనాన్ని మేము నొక్కి చెబుతున్నాము. అదనంగా, జీవక్రియ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా గతిశీల సంఘటనలను కూడా సంగ్రహించే ఇమేజింగ్ పద్ధతులతో కలిపినప్పుడు TEM డేటా అత్యంత సమగ్రమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుందని మేము నొక్కి చెబుతున్నాము. న్యూరోనల్ కణ విభజనకు మద్దతు ఇచ్చే అణు నియంత్రణ యంత్రాంగాలను మరింతగా విశ్లేషించడం వలన నాడీ వ్యవస్థ మరియు న్యూరోడీజెనరేటివ్ వ్యాధులలోని మైటోకాన్డ్రియల్ అంశంపై ముఖ్యమైన అవగాహన లభించవచ్చు.
మైటోకాన్డ్రియల్ ఒత్తిడిని ప్రేరేపించడానికి, SH-SY5Y కణాలకు 3 mM మరియు 5 mM సోడియం ప్రొపియోనేట్ (NaP) ఉపయోగించి PPA తో చికిత్స చేశారు. TEM కు ముందు, నమూనాలను అధిక-పీడన ఫ్రీజింగ్ మరియు ఫ్రీజింగ్ ఉపయోగించి క్రయోజెనిక్ నమూనా తయారీకి గురిచేశారు (Fig. 1a). మేము మూడు బయోలాజికల్ రెప్లికేట్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ పాపులేషన్‌ల యొక్క ఎనిమిది మార్ఫలాజికల్ పారామీటర్‌లను కొలవడానికి ఒక ఆటోమేటెడ్ మైటోకాన్డ్రియల్ ఇమేజ్ అనాలిసిస్ పైప్‌లైన్‌ను అభివృద్ధి చేశాము. PPA చికిత్స నాలుగు పారామీటర్‌లను గణనీయంగా మార్చిందని మేము కనుగొన్నాము: ఏరియా 2, వైశాల్యం, చుట్టుకొలత మరియు ఫెరెట్ వ్యాసం (Fig. 1b–e). 3 mM మరియు 5 mM PPA చికిత్స రెండింటితోనూ ఏరియా 2 గణనీయంగా తగ్గింది (వరుసగా p = 0.0183 మరియు p = 0.002) (Fig. 1b), అయితే వైశాల్యం (p = 0.003), చుట్టుకొలత (p = 0.0106) మరియు ఫెరెట్ వ్యాసం అన్నీ గణనీయంగా తగ్గాయి. కంట్రోల్ గ్రూప్‌తో పోలిస్తే 5 mM చికిత్స గ్రూప్‌లో గణనీయమైన తగ్గుదల (p = 0.0172) ఉంది (Fig. 1c–e). వైశాల్యం మరియు చుట్టుకొలతలో గణనీయమైన తగ్గుదలలు, 5 mM PPA తో చికిత్స పొందిన కణాలలో మైటోకాండ్రియా చిన్నవిగా, మరింత గుండ్రంగా ఉన్నాయని, మరియు ఈ మైటోకాండ్రియా నియంత్రణ కణాలలోని వాటి కంటే తక్కువ పొడవుగా ఉన్నాయని చూపించాయి. ఇది ఫెరెట్ వ్యాసంలో గణనీయమైన తగ్గుదలతో కూడా స్థిరంగా ఉంది, ఇది కణిక అంచుల మధ్య అతిపెద్ద దూరంలో తగ్గుదలను సూచించే ఒక స్వతంత్ర పరామితి. క్రిస్టేల అల్ట్రాస్ట్రక్చర్‌లో మార్పులు గమనించబడ్డాయి: PPA ఒత్తిడి ప్రభావంతో క్రిస్టేలు తక్కువ స్పష్టంగా మారాయి (Fig. 1a, ప్యానెల్ B). అయితే, అన్ని చిత్రాలు క్రిస్టేల అల్ట్రాస్ట్రక్చర్‌ను స్పష్టంగా ప్రతిబింబించలేదు, కాబట్టి ఈ మార్పులపై పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ నిర్వహించబడలేదు. ఈ TEM డేటా మూడు సాధ్యమయ్యే దృశ్యాలను ప్రతిబింబించవచ్చు: (1) PPA విచ్ఛిత్తిని పెంచుతుంది లేదా సంలీనాన్ని నిరోధిస్తుంది, దీనివల్ల ఇప్పటికే ఉన్న మైటోకాండ్రియా పరిమాణంలో కుంచించుకుపోతాయి; (2) పెరిగిన బయోజెనిసిస్ కొత్త, చిన్న మైటోకాండ్రియాను సృష్టిస్తుంది లేదా (3) రెండు యంత్రాంగాలను ఏకకాలంలో ప్రేరేపిస్తుంది. ఈ పరిస్థితులను TEM ద్వారా వేరు చేయలేనప్పటికీ, గణనీయమైన స్వరూప మార్పులు PPA ఒత్తిడిలో మైటోకాండ్రియా హోమియోస్టాసిస్ మరియు డైనమిక్స్‌లో మార్పులను సూచిస్తాయి. తదనంతరం, ఈ గతిశీలతలను మరియు వాటికి ఆధారమైన సంభావ్య యంత్రాంగాలను మరింతగా వర్గీకరించడానికి మేము అదనపు పారామితులను అన్వేషించాము.
ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA) మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని పునర్నిర్మిస్తుంది. (ఎ) PPA చికిత్స పెరిగేకొద్దీ మైటోకాన్డ్రియా పరిమాణం తగ్గుతుందని మరియు మైటోకాన్డ్రియా చిన్నవిగా మరియు మరింత గుండ్రంగా మారతాయని చూపే ప్రతినిధి ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) చిత్రాలు; వరుసగా 0 mM (చికిత్స చేయని), 3 mM మరియు 5 mM. ఎరుపు బాణాలు మైటోకాన్డ్రియాను సూచిస్తాయి. (బి–ఇ) 24 గంటల పాటు PPAతో చికిత్స పొందిన SH-SY5Y కణాలను TEM కోసం సిద్ధం చేశారు మరియు ఫలితాలను Fiji/ImageJ ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. ఎనిమిది పారామితులలో నాలుగు నియంత్రణ (చికిత్స చేయని, 0 mM PPA) మరియు చికిత్స పొందిన (3 mM మరియు 5 mM PPA) కణాల మధ్య గణనీయమైన తేడాలను చూపించాయి. (బి) ప్రాంతం 2, (సి) వైశాల్యం, (డి) చుట్టుకొలత, (ఇ) ఫెరెట్ వ్యాసం. గణనీయమైన తేడాలను (p < 0.05) నిర్ధారించడానికి వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ (నియంత్రణ వర్సెస్ చికిత్స) మరియు డన్నెట్ యొక్క బహుళ పోలిక పరీక్షను ఉపయోగించారు. డేటా పాయింట్లు ప్రతి వ్యక్తిగత కణం యొక్క సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ విలువను సూచిస్తాయి మరియు ఎర్రర్ బార్‌లు మీన్ ± SEM ను సూచిస్తాయి. చూపిన డేటా n = 3, ప్రతి రెప్లికేట్‌కు కనీసం 24 కణాలను సూచిస్తుంది; మొత్తం 266 చిత్రాలు విశ్లేషించబడ్డాయి; * p < 0.05 ను సూచిస్తుంది, ** p < 0.01 ను సూచిస్తుంది.
PPAకు మైటోకాన్డ్రియా గతిశీలత ఎలా ప్రతిస్పందిస్తుందో మరింతగా వర్గీకరించడానికి, మేము టెట్రామెథైల్‌రోడామైన్ ఇథైల్ ఎస్టర్ (TMRE)తో మైటోకాన్డ్రియాకు రంగు వేసి, 3 మరియు 5 mM PPA వద్ద 24 గంటల తర్వాత మైటోకాన్డ్రియాను గుర్తించడానికి మరియు పరిమాణీకరించడానికి టైమ్-లాప్స్ మైక్రోస్కోపీ మరియు MEL విశ్లేషణను ఉపయోగించాము. విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీన సంఘటనల చికిత్స. (చిత్రం 2a). MEL విశ్లేషణ తర్వాత, మైటోకాన్డ్రియా నిర్మాణాల సంఖ్యను మరియు వాటి సగటు పరిమాణాన్ని పరిమాణీకరించడానికి మైటోకాన్డ్రియాను మరింతగా విశ్లేషించారు. నియంత్రణతో పోలిస్తే 3 mM వద్ద [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] విచ్ఛిత్తి సంఘటనల సంఖ్యలో చిన్నదైనా గణనీయమైన పెరుగుదలను మేము గమనించాము, మరియు 5 mM వద్ద విచ్ఛిత్తి [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] మరియు సంలీన [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] సంఘటనలు గణనీయంగా పెరిగాయి (Fig. 3b). 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] మరియు 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] రెండింటి వద్ద మైటోకాండ్రియా సంఖ్య గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 3c), అయితే ప్రతి మైటోకాండ్రియల్ నిర్మాణం యొక్క సగటు పరిమాణం మారలేదు (Fig. 3d). మొత్తంగా చూస్తే, మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ యొక్క పునర్నిర్మాణం అనేది మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ యొక్క సమగ్రతను విజయవంతంగా నిర్వహించే ఒక పరిహార ప్రతిస్పందనగా పనిచేస్తుందని ఇది సూచిస్తుంది. 3 mM PPA వద్ద విచ్ఛిత్తి సంఘటనల సంఖ్యలో పెరుగుదల, మైటోకాన్డ్రియల్ సంఖ్యలో పెరుగుదల పాక్షికంగా మైటోకాన్డ్రియల్ విచ్ఛిత్తి కారణంగా ఉందని సూచిస్తుంది, కానీ సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ పరిమాణం ముఖ్యంగా మారకుండా ఉన్నందున, అదనపు పరిహార ప్రతిస్పందనగా బయోజెనిసిస్‌ను తోసిపుచ్చలేము. అయితే, ఈ డేటా TEM ద్వారా గమనించిన చిన్న, గుండ్రని మైటోకాన్డ్రియల్ నిర్మాణాలకు అనుగుణంగా ఉంది మరియు PPA ద్వారా ప్రేరేపించబడిన మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌లో గణనీయమైన మార్పులను కూడా ప్రదర్శిస్తుంది.
ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA) నెట్‌వర్క్ సమగ్రతను కాపాడుకోవడానికి డైనమిక్ మైటోకాన్డ్రియల్ రీమోడలింగ్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది. SH-SY5Y కణాలను కల్చర్ చేసి, 24 గంటల పాటు 3 మరియు 5 mM PPA తో ట్రీట్ చేసి, TMRE మరియు హోచ్స్ట్ 33342 తో స్టెయిన్ చేసి, ఆ తర్వాత MEL విశ్లేషణ చేశారు. (a) ప్రతి కండిషన్‌కు సమయం 2 (t2) వద్ద రంగు మరియు బైనరైజ్డ్ గరిష్ట తీవ్రత ప్రొజెక్షన్‌లను వర్ణించే ప్రతినిధి టైమ్-లాప్స్ మైక్రోస్కోపీ చిత్రాలు. ప్రతి బైనరీ చిత్రంలో సూచించిన ఎంచుకున్న ప్రాంతాలు మెరుగుపరచబడి, కాలక్రమేణా జరిగే డైనమిక్స్‌ను వివరించడానికి మూడు వేర్వేరు టైమ్ ఫ్రేమ్‌లలో (t1-t3) 3D లో ప్రదర్శించబడ్డాయి; ఫ్యూజన్ ఈవెంట్‌లు ఆకుపచ్చ రంగులో హైలైట్ చేయబడ్డాయి; ఫిషన్ ఈవెంట్‌లు ఆకుపచ్చ రంగులో హైలైట్ చేయబడ్డాయి. ఎరుపు రంగులో ప్రదర్శించబడ్డాయి. (b) ప్రతి కండిషన్‌కు సగటు డైనమిక్ ఈవెంట్‌ల సంఖ్య. (c) ప్రతి కణానికి సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ నిర్మాణాల సంఖ్య. (d) ప్రతి కణానికి ప్రతి మైటోకాన్డ్రియల్ నిర్మాణం యొక్క సగటు ఘనపరిమాణం (µm3). చూపిన డేటా ప్రతి ట్రీట్‌మెంట్ గ్రూప్‌కు n = 15 కణాలకు ప్రతినిధిగా ఉంది. చూపబడిన ఎర్రర్ బార్‌లు మీన్ ± SEM ను సూచిస్తాయి, స్కేల్ బార్ = 10 μm, * p < 0.05.
ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA) మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌తో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ సప్రెషన్‌కు కారణమవుతుంది. SH-SY5Y కణాలకు 24 గంటల పాటు 3 మరియు 5 mM PPA తో చికిత్స చేశారు. RT-qPCR ఉపయోగించి సాపేక్ష జన్యు పరిమాణీకరణను నిర్వహించి, B2M కు సాధారణీకరించారు. మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్ జన్యువులు (ఎ) cMYC, (బి) TFAM, (సి) NRF1 మరియు (డి) NFE2L2. మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ మరియు ఫిషన్ జన్యువులు (ఇ) STOML2, (ఎఫ్) OPA1, (జి) MFN1, (హెచ్) MFN2 మరియు (ఐ) DRP1. వన్-వే ANOVA (కంట్రోల్ వర్సెస్ ట్రీట్‌మెంట్) మరియు డన్నెట్ మల్టిపుల్ కంపారిజన్ టెస్ట్ ఉపయోగించి గణనీయమైన తేడాలను (p < 0.05) పరీక్షించారు: * p < 0.05 ను సూచిస్తుంది, ** p < 0.01 ను సూచిస్తుంది, మరియు **** p < 0.0001 ను సూచిస్తుంది. బార్‌లు సగటు ఎక్స్‌ప్రెషన్ ± SEM ను సూచిస్తాయి. చూపబడిన డేటా n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), మరియు n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాలను సూచిస్తుంది.
TEM మరియు MEL విశ్లేషణల నుండి వచ్చిన డేటా మొత్తం మీద PPA మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని మరియు గతిశీలతను మారుస్తుందని సూచిస్తుంది. అయితే, ఈ ఇమేజింగ్ పద్ధతులు ఈ ప్రక్రియలను నడిపించే అంతర్లీన యంత్రాంగాల గురించి అంతర్దృష్టిని అందించవు. అందువల్ల, మేము PPA చికిత్సకు ప్రతిస్పందనగా మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలత, జీవజననం మరియు మైటోసిస్ యొక్క తొమ్మిది కీలక నియంత్రకాల mRNA వ్యక్తీకరణను పరిశీలించాము. 3 mM మరియు 5 mM PPA తో 24 గంటల చికిత్స తర్వాత మేము సెల్ మైలోమా ఆంకోజీన్ (cMYC), న్యూక్లియర్ రెస్పిరేటరీ ఫ్యాక్టర్ (NRF1), మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ 1 (TFAM), NFE2-వంటి ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ BZIP (NFE2L2), గాస్ట్రిన్-వంటి ప్రోటీన్ 2 (STOML2), ఆప్టిక్ నర్వ్ అట్రోఫీ 1 (OPA1), మిటోఫ్యూసిన్ 1 (MFN1), మిటోఫ్యూసిన్ 2 (MFN2) మరియు డైనమిన్-సంబంధిత ప్రోటీన్ 1 (DRP1) లను పరిమాణాత్మకంగా లెక్కించాము. మేము 3 mM (వరుసగా p = 0.0053, p = 0.0415 మరియు p < 0.0001) మరియు 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA చికిత్సను గమనించాము. (పటం 3a–c). mRNA వ్యక్తీకరణలో తగ్గుదల మోతాదుపై ఆధారపడి ఉంది: cMYC, NRF1 మరియు TFAM వ్యక్తీకరణ 3 mM వద్ద వరుసగా 5.7, 2.6 మరియు 1.9 రెట్లు, మరియు 5 mM వద్ద 11.2, 3 మరియు 2.2 రెట్లు తగ్గింది. దీనికి విరుద్ధంగా, కేంద్ర రెడాక్స్ బయోజెనిసిస్ జన్యువు NFE2L2, PPA యొక్క ఏ గాఢత వద్ద కూడా మార్పు చెందలేదు, అయినప్పటికీ వ్యక్తీకరణలో తగ్గుదల యొక్క ఇలాంటి మోతాదు-ఆధారిత ధోరణి గమనించబడింది (పటం 3d).
విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీనత నియంత్రణలో పాల్గొనే సాంప్రదాయక జన్యువుల వ్యక్తీకరణను కూడా మేము పరిశీలించాము. STOML2 సంలీనత, మైటోఫేజీ మరియు బయోజెనిసిస్‌లో పాల్గొంటుందని భావిస్తున్నారు, మరియు దాని వ్యక్తీకరణ 3 mM (2.4-రెట్ల మార్పు) మరియు 5 mM (2.8-రెట్ల మార్పు) PPA ద్వారా గణనీయంగా తగ్గించబడింది (p < 0.0001) (పటం 1). 3డి). అదేవిధంగా, OPA1 సంలీన జన్యు వ్యక్తీకరణ 3 mM (1.6-రెట్ల మార్పు) మరియు 5 mM (1.9-రెట్ల మార్పు) PPA వద్ద తగ్గింది (వరుసగా p = 0.006 మరియు p = 0.0024) (పటం 3ఎఫ్). అయితే, 24-గంటల PPA ఒత్తిడి కింద సంలీన జన్యువులైన MFN1, MFN2 లేదా విచ్ఛిత్తి జన్యువైన DRP1 వ్యక్తీకరణలో మేము గణనీయమైన తేడాలను కనుగొనలేదు (పటం 3జి–ఐ). అదనంగా, నాలుగు సంలీన మరియు విచ్ఛిన్న ప్రోటీన్ల (OPA1, MFN1, MFN2 మరియు DRP1) స్థాయిలు అవే పరిస్థితులలో మారలేదని మేము కనుగొన్నాము (పటం 4a–d). ఈ డేటా ఒక నిర్దిష్ట సమయాన్ని ప్రతిబింబిస్తుందని మరియు PPA ఒత్తిడి యొక్క ప్రారంభ దశలలో ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ లేదా క్రియాశీలత స్థాయిలలో మార్పులను ప్రతిబింబించకపోవచ్చని గమనించడం ముఖ్యం. అయినప్పటికీ, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, మరియు OPA1 వ్యక్తీకరణలో గణనీయమైన తగ్గుదల మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియ, జీవజననం మరియు గతిశీలత యొక్క గణనీయమైన లిప్యంతరీకరణ అస్తవ్యస్తతను సూచిస్తుంది. అదనంగా, మైటోకాన్డ్రియల్ పనితీరులో అంతిమ-స్థితి మార్పులను నేరుగా అధ్యయనం చేయడానికి ఇమేజింగ్ పద్ధతుల యొక్క ప్రయోజనాన్ని ఈ డేటా హైలైట్ చేస్తుంది.
ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం (PPA) చికిత్స తర్వాత ఫ్యూజన్ మరియు ఫిషన్ ఫ్యాక్టర్ ప్రోటీన్ స్థాయిలు మారలేదు. SH-SY5Y కణాలకు 24 గంటల పాటు 3 మరియు 5 mM PPA తో చికిత్స చేశారు. ప్రోటీన్ స్థాయిలను వెస్టర్న్ బ్లాట్ విశ్లేషణ ద్వారా లెక్కించారు, మరియు వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను మొత్తం ప్రోటీన్‌కు అనుగుణంగా సాధారణీకరించారు. సగటు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ మరియు లక్ష్య మరియు మొత్తం ప్రోటీన్ యొక్క ప్రతినిధి వెస్టర్న్ బ్లాట్‌లు చూపబడ్డాయి. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. బార్‌లు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి, మరియు చూపబడిన డేటా n = 3 జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాలకు ప్రతినిధిగా ఉంది. వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ మరియు డన్నెట్ పరీక్షను ఉపయోగించి బహుళ పోలికలు (p < 0.05) నిర్వహించబడ్డాయి. అసలు జెల్ మరియు బ్లాట్ చిత్రం S1లో చూపబడ్డాయి.
మైటోకాండ్రియా పనితీరులో లోపం అనేది జీవక్రియ, హృదయ సంబంధ మరియు కండరాల వ్యాధుల నుండి నాడీ సంబంధిత వ్యాధుల వరకు బహుళ వ్యవస్థల వ్యాధులతో ముడిపడి ఉంటుంది¹,¹⁰. అనేక నాడీ క్షీణత మరియు నాడీ సంబంధిత వ్యాధులు మైటోకాండ్రియా పనితీరులో లోపంతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి, ఇది మెదడు యొక్క జీవితకాలం అంతటా ఈ కణాంగాల ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది. ఈ వ్యాధులలో పార్కిన్సన్స్ వ్యాధి, అల్జీమర్స్ వ్యాధి మరియు ASD³,4,¹⁸ ఉన్నాయి. అయితే, ఈ వ్యాధులను అధ్యయనం చేయడానికి, ముఖ్యంగా యాంత్రిక స్థాయిలో, మెదడు కణజాలాన్ని పొందడం కష్టం, అందువల్ల సెల్యులార్ మోడల్ వ్యవస్థలు ఒక అవసరమైన ప్రత్యామ్నాయంగా మారాయి. ఈ అధ్యయనంలో, నాడీ సంబంధిత వ్యాధులలో, ముఖ్యంగా ఆటిజం స్పెక్ట్రమ్ డిజార్డర్స్‌లో గమనించిన మైటోకాండ్రియా పనితీరులో లోపాన్ని పునఃసృష్టించడానికి, మేము PPA-చికిత్స పొందిన SH-SY5Y కణాలను ఉపయోగించి ఒక సెల్యులార్ మోడల్ వ్యవస్థను ఉపయోగిస్తాము. న్యూరాన్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌ను అధ్యయనం చేయడానికి ఈ PPA మోడల్‌ను ఉపయోగించడం ASD యొక్క కారణశాస్త్రంపై అంతర్దృష్టిని అందించవచ్చు.
మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపంలో మార్పులను వీక్షించడానికి TEMను ఉపయోగించే అవకాశాన్ని మేము అన్వేషించాము. దాని ప్రభావాన్ని గరిష్ఠంగా పెంచడానికి TEMను సరిగ్గా ఉపయోగించడం చాలా ముఖ్యం అని గమనించాలి. క్రయో-నమూనాల తయారీ, కణ భాగాలను ఏకకాలంలో స్థిరీకరించడం మరియు ఆర్టిఫ్యాక్ట్‌ల ఏర్పాటును తగ్గించడం ద్వారా న్యూరోనల్ నిర్మాణాలను మెరుగ్గా సంరక్షించడానికి అనుమతిస్తుంది34. దీనికి అనుగుణంగా, న్యూరాన్ లాంటి SH-SY5Y కణాలలో చెక్కుచెదరని ఉపకణికలు మరియు పొడవైన మైటోకాండ్రియా ఉన్నాయని మేము గమనించాము (Fig. 1a). న్యూరోనల్ కణ నమూనాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి క్రయోజెనిక్ తయారీ పద్ధతుల యొక్క ప్రయోజనాన్ని ఇది నొక్కి చెబుతుంది. TEM డేటా యొక్క నిష్పాక్షిక విశ్లేషణకు పరిమాణాత్మక కొలతలు కీలకమైనప్పటికీ, మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూప మార్పులను నిర్ధారించడానికి ఏ నిర్దిష్ట పారామితులను కొలవాలనే దానిపై ఇప్పటికీ ఏకాభిప్రాయం లేదు. మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని పరిమాణాత్మకంగా పరిశీలించిన అనేక అధ్యయనాల ఆధారంగా17,31,32, మేము ఎనిమిది స్వరూప పారామితులను కొలిచే ఒక స్వయంచాలక మైటోకాన్డ్రియల్ ఇమేజ్ విశ్లేషణ పైప్‌లైన్‌ను అభివృద్ధి చేశాము, అవి: వైశాల్యం, వైశాల్యం2, ఆస్పెక్ట్ రేషియో, చుట్టుకొలత, వృత్తాకారత, డిగ్రీ, ఫెరెట్ వ్యాసం మరియు గుండ్రదనం.
వాటిలో, PPA ఏరియా 2, వైశాల్యం, చుట్టుకొలత మరియు ఫెరెట్ వ్యాసాన్ని గణనీయంగా తగ్గించింది (Fig. 1b–e). దీనివల్ల మైటోకాండ్రియా చిన్నవిగా మరియు మరింత గుండ్రంగా మారాయని తెలిసింది. ఇది, 72 గంటల PPA30-ప్రేరిత మైటోకాండ్రియల్ ఒత్తిడి తర్వాత మైటోకాండ్రియా వైశాల్యంలో తగ్గుదలని చూపించే మునుపటి అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంది. ఈ స్వరూపాత్మక లక్షణాలు మైటోకాండ్రియల్ ఫిషన్‌ను సూచించవచ్చు. ఇది మైటోఫేజీ35,36,37 ద్వారా దెబ్బతిన్న భాగాలను మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్ నుండి వేరు చేసి, వాటి క్షీణతను ప్రోత్సహించడానికి అవసరమైన ప్రక్రియ. మరోవైపు, సగటు మైటోకాండ్రియా పరిమాణంలో తగ్గుదల పెరిగిన బయోజెనిసిస్‌తో ముడిపడి ఉండవచ్చు, దీని ఫలితంగా చిన్న నవజాత మైటోకాండ్రియా ఏర్పడతాయి. పెరిగిన ఫిషన్ లేదా బయోజెనిసిస్ అనేది మైటోకాండ్రియల్ ఒత్తిడికి వ్యతిరేకంగా మైటోసిస్‌ను నిర్వహించడానికి ఒక పరిహార ప్రతిస్పందనను సూచిస్తుంది. అయితే, తగ్గిన మైటోకాండ్రియల్ పెరుగుదల, బలహీనమైన ఫ్యూజన్ లేదా ఇతర పరిస్థితులను తోసిపుచ్చలేము.
TEM ద్వారా సృష్టించబడిన అధిక-రిజల్యూషన్ చిత్రాలు వ్యక్తిగత మైటోకాండ్రియా స్థాయిలో స్వరూప లక్షణాలను నిర్ధారించడానికి అనుమతించినప్పటికీ, ఈ పద్ధతి ఒకే సమయంలో రెండు-డైమెన్షనల్ స్నాప్‌షాట్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. జీవక్రియ ఒత్తిడికి డైనమిక్ ప్రతిస్పందనలను అధ్యయనం చేయడానికి, మేము మైటోకాండ్రియాకు TMRE తో రంగు వేసి, MEL విశ్లేషణతో టైమ్-లాప్స్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించాము, ఇది కాలక్రమేణా మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌లోని మార్పుల యొక్క హై-త్రూపుట్ 3D విజువలైజేషన్‌ను అనుమతిస్తుంది33,38. PPA ఒత్తిడిలో మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్‌లో సూక్ష్మమైన కానీ ముఖ్యమైన మార్పులను మేము గమనించాము (Fig. 2). 3 mM వద్ద, ఫిషన్ సంఘటనల సంఖ్య గణనీయంగా పెరిగింది, అయితే ఫ్యూజన్ సంఘటనలు నియంత్రణలో ఉన్నట్లే ఉన్నాయి. 5 mM PPA వద్ద ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్ సంఘటనల సంఖ్యలో పెరుగుదల గమనించబడింది, కానీ ఈ మార్పులు సుమారుగా అనుపాతంలో ఉన్నాయి, ఇది అధిక సాంద్రతల వద్ద ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్ కైనటిక్స్ సమతుల్యతను చేరుకుంటాయని సూచిస్తుంది (Fig. 2b). సగటు మైటోకాండ్రియల్ పరిమాణం 3 మరియు 5 mM PPA రెండింటి వద్ద మారకుండా ఉంది, ఇది మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్ యొక్క సమగ్రత సంరక్షించబడిందని సూచిస్తుంది (Fig. 2d). ఇది, నెట్‌వర్క్ విచ్ఛిన్నానికి కారణం కాకుండా హోమియోస్టాసిస్‌ను సమర్థవంతంగా నిర్వహించడానికి, తేలికపాటి జీవక్రియ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందించే డైనమిక్ మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌ల సామర్థ్యాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. 3 mM PPA వద్ద, విచ్ఛిన్నంలో పెరుగుదల ఒక కొత్త సమతౌల్యానికి పరివర్తనను ప్రోత్సహించడానికి సరిపోతుంది, కానీ అధిక సాంద్రత గల PPA ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా మరింత లోతైన కైనెటిక్ పునఃరూపకల్పన అవసరం.
రెండు PPA ఒత్తిడి సాంద్రతల వద్ద మైటోకాండ్రియాల సంఖ్య పెరిగింది, కానీ సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ పరిమాణంలో గణనీయమైన మార్పు రాలేదు (పటం 2c). ఇది పెరిగిన బయోజెనిసిస్ లేదా పెరిగిన విభజన కారణంగా కావచ్చు; అయితే, సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ పరిమాణంలో గణనీయమైన తగ్గుదల లేనప్పుడు, బయోసింథసిస్ పెరిగే అవకాశం ఎక్కువగా ఉంది. అయినప్పటికీ, పటం 2లోని డేటా రెండు పరిహార యంత్రాంగాల ఉనికిని సమర్థిస్తుంది: మైటోకాన్డ్రియల్ ఫిషన్ యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్‌కు అనుగుణంగా ఫిషన్ సంఘటనల సంఖ్యలో పెరుగుదల, మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్‌కు అనుగుణంగా సంఘటనల సంఖ్యలో పెరుగుదల. అంతిమంగా, తేలికపాటి ఒత్తిడికి డైనమిక్ పరిహారం అనేది ఫిషన్, ఫ్యూజన్, బయోజెనిసిస్ మరియు మైటోఫేజీలతో కూడిన ఏకకాల ప్రక్రియలను కలిగి ఉండవచ్చు. మునుపటి రచయితలు PPA మైటోసిస్30,39 మరియు మైటోఫేజీ29లను పెంచుతుందని చూపినప్పటికీ, మేము PPAకు ప్రతిస్పందనగా మైటోకాన్డ్రియల్ ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్ డైనమిక్స్ యొక్క పునర్నిర్మాణానికి సాక్ష్యాలను అందిస్తున్నాము. ఈ డేటా TEM ద్వారా గమనించిన మార్ఫలాజికల్ మార్పులను నిర్ధారిస్తుంది మరియు PPA-ప్రేరిత మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో సంబంధం ఉన్న యంత్రాంగాలపై మరింత అంతర్దృష్టిని అందిస్తుంది.
TEM లేదా MEL విశ్లేషణ రెండూ గమనించిన స్వరూప మార్పులకు ఆధారమైన జన్యు నియంత్రణ యంత్రాంగాలకు ప్రత్యక్ష సాక్ష్యాలను అందించనందున, మేము మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియ, జీవజననం మరియు గతిశీలతలో పాల్గొన్న జన్యువుల RNA వ్యక్తీకరణను పరిశీలించాము. cMYC ప్రోటో-ఆంకోజీన్ అనేది మైటోకాన్డ్రియా, గ్లైకోలిసిస్, అమైనో ఆమ్లం మరియు కొవ్వు ఆమ్ల జీవక్రియల నియంత్రణలో పాల్గొనే ఒక ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్40. అదనంగా, cMYC, NRF1 మరియు TFAM41తో సహా, మైటోకాన్డ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్, ట్రాన్స్లేషన్ మరియు కాంప్లెక్స్ అసెంబ్లీలో పాల్గొన్న దాదాపు 600 మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను నియంత్రిస్తుందని తెలిసింది. NRF1 మరియు TFAM అనేవి మైటోసిస్ యొక్క రెండు కేంద్ర నియంత్రకాలు, ఇవి mtDNA ప్రతిరూపణను సక్రియం చేయడానికి PGC-1α తర్వాత పనిచేస్తాయి. ఈ మార్గం cAMP మరియు AMPK సిగ్నలింగ్ ద్వారా సక్రియం చేయబడుతుంది మరియు శక్తి వ్యయం మరియు జీవక్రియ ఒత్తిడికి సున్నితంగా ఉంటుంది. PPA ప్రభావాలు ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించవచ్చో లేదో నిర్ధారించడానికి, మేము మైటోకాన్డ్రియల్ జీవజననం యొక్క రెడాక్స్ నియంత్రకం అయిన NFE2L2ను కూడా పరిశీలించాము.
NFE2L2 వ్యక్తీకరణలో మార్పు లేనప్పటికీ, 3 mM మరియు 5 mM PPA తో 24 గంటల చికిత్స తర్వాత cMYC, NRF1 మరియు TFAM వ్యక్తీకరణలో మోతాదుపై ఆధారపడిన స్థిరమైన తగ్గుదలను మేము కనుగొన్నాము (Fig. 3a–c). cMYC వ్యక్తీకరణ తగ్గడం అనేది మైటోకాండ్రియల్ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా గతంలో నివేదించబడింది42, మరియు దీనికి విరుద్ధంగా, cMYC వ్యక్తీకరణ తగ్గడం అనేది మైటోకాండ్రియల్ జీవక్రియ, నెట్‌వర్క్ కనెక్టివిటీ మరియు మెంబ్రేన్ పోలరైజేషన్‌ను పునర్నిర్మించడం ద్వారా మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి కారణమవుతుంది43. ఆసక్తికరంగా, cMYC మైటోకాండ్రియల్ విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీనం యొక్క నియంత్రణలో కూడా పాల్గొంటుంది42,43 మరియు కణ విభజన సమయంలో DRP1 ఫాస్ఫోరైలేషన్ మరియు మైటోకాండ్రియల్ స్థానికీకరణను పెంచుతుందని44, అలాగే న్యూరోనల్ స్టెమ్ కణాలలో మైటోకాండ్రియల్ స్వరూప పునర్నిర్మాణానికి మధ్యవర్తిత్వం వహిస్తుందని45 తెలుసు. నిజానికి, cMYC-లోపం ఉన్న ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు తగ్గిన మైటోకాండ్రియల్ పరిమాణాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి, ఇది PPA43 ఒత్తిడి ద్వారా ప్రేరేపించబడిన మార్పులకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. ఈ డేటా cMYC మరియు మైటోకాండ్రియల్ డైనమిక్స్ మధ్య ఆసక్తికరమైన కానీ ఇంకా అస్పష్టంగా ఉన్న సంబంధాన్ని వివరిస్తుంది, ఇది PPA ఒత్తిడి-ప్రేరిత పునర్నిర్మాణంపై భవిష్యత్ అధ్యయనాలకు ఒక ఆసక్తికరమైన లక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది.
NRF1 మరియు TFAM ల తగ్గుదల, cMYC ఒక ముఖ్యమైన ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ యాక్టివేటర్‌గా పోషిస్తున్న పాత్రకు అనుగుణంగా ఉంది. ఈ డేటా, మానవ పెద్దప్రేగు క్యాన్సర్ కణాలపై గతంలో జరిపిన అధ్యయనాలతో కూడా సరిపోలుతుంది. ఆ అధ్యయనాల ప్రకారం, PPA 22 గంటల వద్ద NRF1 mRNA వ్యక్తీకరణను తగ్గించింది, ఇది ATP క్షీణత మరియు ROS46 పెరుగుదలతో ముడిపడి ఉంది. ఈ రచయితలు TFAM వ్యక్తీకరణ 8.5 గంటల వద్ద పెరిగిందని, కానీ 22 గంటల వద్ద ప్రాథమిక స్థాయికి తిరిగి వచ్చిందని కూడా నివేదించారు. దీనికి విరుద్ధంగా, కిమ్ మరియు ఇతరులు (2019) SH-SY5Y కణాలలో 4 గంటల PPA ఒత్తిడి తర్వాత TFAM mRNA వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గిందని చూపించారు; అయితే, 72 గంటల తర్వాత, TFAM ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా పెరిగింది మరియు mtDNA కాపీ సంఖ్య కూడా గణనీయంగా పెరిగింది. అందువల్ల, 24 గంటల తర్వాత మనం గమనించిన మైటోకాండ్రియల్ బయోజెనిసిస్ జన్యువుల సంఖ్యలో తగ్గుదల, మైటోకాండ్రియాల సంఖ్యలో పెరుగుదల అనేది అంతకు ముందు సమయాల్లో బయోజెనిసిస్ క్రియాశీలతతో ముడిపడి ఉందనే అవకాశాన్ని తోసిపుచ్చదు. గత అధ్యయనాలు PPA, SH-SY5Y కణాలలో 4 గంటల 30 నిమిషాల వద్ద PGC-1α mRNA మరియు ప్రోటీన్‌ను గణనీయంగా పెంచుతుందని, అదే సమయంలో ప్రొపియోనిక్ ఆమ్లం 12 గంటల 39 నిమిషాల వద్ద దూడ కాలేయ కణాలలో PGC-1α ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ బయోజెనిసిస్‌ను పెంచుతుందని చూపించాయి. ఆసక్తికరంగా, PGC-1α అనేది NRF1 మరియు TFAM యొక్క ప్రత్యక్ష ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ రెగ్యులేటర్ మాత్రమే కాకుండా, ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్‌ను నియంత్రించడం ద్వారా MFN2 మరియు DRP1 యొక్క కార్యాచరణను కూడా నియంత్రిస్తుందని చూపబడింది47. వీటన్నింటినీ కలిపి చూస్తే, ఇది PPA ప్రేరేపిత మైటోకాన్డ్రియల్ పరిహార ప్రతిస్పందనలను నియంత్రించే యంత్రాంగాల మధ్య ఉన్న సన్నిహిత సంబంధాన్ని స్పష్టం చేస్తుంది. అంతేకాకుండా, మా డేటా PPA ఒత్తిడిలో బయోజెనిసిస్ మరియు జీవక్రియ యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణలో గణనీయమైన అస్తవ్యస్తతను ప్రతిబింబిస్తుంది.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 మరియు DRP1 జన్యువులు మైటోకాన్డ్రియల్ ఫిషన్, ఫ్యూజన్ మరియు డైనమిక్స్ యొక్క కేంద్ర నియంత్రకాలలో ఉన్నాయి37,48,49. మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌లో పాల్గొనే అనేక ఇతర జన్యువులు ఉన్నాయి, అయితే, STOML2, OPA1 మరియు MFN2 గతంలో ASD సమూహాలలో విభిన్నంగా మిథైలేట్ చేయబడినట్లు కనుగొనబడింది,16 మరియు అనేక స్వతంత్ర అధ్యయనాలు మైటోకాన్డ్రియల్ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా ఈ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలలో మార్పులను నివేదించాయి50,51. 52. 3 mM మరియు 5 mM PPA చికిత్స ద్వారా OPA1 మరియు STOML2 రెండింటి వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది (Fig. 3e, f). OPA1 అనేది MFN1 మరియు 2 తో ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య ద్వారా మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ యొక్క సాంప్రదాయ నియంత్రకాలలో ఒకటి మరియు క్రిస్టే పునర్నిర్మాణం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపంలో పాత్ర పోషిస్తుంది53. మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌లో STOML2 యొక్క ఖచ్చితమైన పాత్ర అస్పష్టంగానే ఉంది, కానీ ఇది మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్, బయోజెనిసిస్ మరియు మైటోఫేజీలో పాత్ర పోషిస్తుందని ఆధారాలు సూచిస్తున్నాయి.
STOML2 మైటోకాన్డ్రియల్ శ్వాసకోశ కప్లింగ్ మరియు శ్వాసకోశ గొలుసు కాంప్లెక్స్‌ల ఏర్పాటును నిర్వహించడంలో పాల్గొంటుంది54,55 మరియు క్యాన్సర్ కణాల జీవక్రియ లక్షణాలను తీవ్రంగా మారుస్తుందని చూపబడింది56. BAN మరియు కార్డియోలిపిన్‌తో పరస్పర చర్య ద్వారా STOML2 మైటోకాన్డ్రియల్ పొర పొటెన్షియల్ మరియు బయోజెనిసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి55, 57, 58. అదనంగా, STOML2 మరియు PINK1 మధ్య పరస్పర చర్య మైటోఫేజీని నియంత్రిస్తుందని స్వతంత్ర అధ్యయనాలు చూపించాయి59,60. ముఖ్యంగా, STOML2 నేరుగా MFN2తో సంకర్షణ చెంది దానిని స్థిరీకరిస్తుందని మరియు OPA1 క్షీణతకు కారణమయ్యే ప్రొటీజ్‌ను నిరోధించడం ద్వారా పొడవైన OPA1 ఐసోఫామ్‌లను స్థిరీకరించడంలో కూడా ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని నివేదించబడింది53,61,62. PPA చర్యలలో గమనించిన STOML2 వ్యక్తీకరణలో తగ్గుదల ఈ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లను యుబిక్విటిన్- మరియు ప్రొటీజోమ్-ఆధారిత మార్గాల ద్వారా క్షీణతకు మరింత సున్నితంగా మార్చవచ్చు48. PPA కు డైనమిక్ ప్రతిస్పందనలో STOML2 మరియు OPA1 యొక్క ఖచ్చితమైన పాత్ర అస్పష్టంగా ఉన్నప్పటికీ, ఈ ఫ్యూజన్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణ తగ్గడం (మూర్తి 3) విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీనం మధ్య సమతుల్యతను దెబ్బతీసి, మైటోకాన్డ్రియల్ పరిమాణం తగ్గడానికి దారితీయవచ్చు (మూర్తి 3). 1).
మరోవైపు, 24 గంటల తర్వాత OPA1 ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణలో ఎటువంటి మార్పు లేదు, అయితే PPA చికిత్స తర్వాత MFN1, MFN2 లేదా DRP1 యొక్క mRNA మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలు గణనీయంగా మారలేదు (Fig. 3g-i, Fig. 4). మైటోకాన్డ్రియల్ సంలీనం మరియు విచ్ఛిన్నంలో పాల్గొనే ఈ కారకాల నియంత్రణలో ఎటువంటి మార్పులు లేవని ఇది సూచించవచ్చు. అయితే, ఈ నాలుగు జన్యువులలో ప్రతి ఒక్కటి ప్రోటీన్ కార్యాచరణను నియంత్రించే పోస్ట్ ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మార్పుల (PTMలు) ద్వారా కూడా నియంత్రించబడుతుందని గమనించడం ముఖ్యం. OPA1కు ఎనిమిది ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లైస్ వేరియంట్లు ఉన్నాయి, ఇవి మైటోకాండ్రియాలో ప్రోటీయోలైటిక్‌గా విచ్ఛిన్నం చేయబడి రెండు విభిన్న ఐసోఫామ్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి 63. పొడవైన మరియు చిన్న ఐసోఫామ్‌ల మధ్య సమతుల్యత చివరికి మైటోకాన్డ్రియల్ సంలీనం మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్ నిర్వహణలో OPA1 పాత్రను నిర్ణయిస్తుంది64. DRP1 కార్యాచరణ కాల్షియం/కాల్మోడ్యులిన్-ఆధారిత ప్రోటీన్ కినేస్ II (CaMKII) ఫాస్ఫోరైలేషన్ ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది, అయితే DRP1 క్షీణత యుబిక్విటినేషన్ మరియు SUMOylation ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది65. చివరగా, DRP1 మరియు MFN1/2 రెండూ GTPases, కాబట్టి మైటోకాండ్రియాలో GTP ఉత్పత్తి రేటు ద్వారా వాటి కార్యాచరణ ప్రభావితం కావచ్చు 66. అందువల్ల, ఈ ప్రోటీన్ల వ్యక్తీకరణ స్థిరంగా ఉన్నప్పటికీ, ఇది మారిన ప్రోటీన్ కార్యాచరణ లేదా స్థానాన్ని ప్రతిబింబించకపోవచ్చు 67,68. నిజానికి, ఇప్పటికే ఉన్న PTM ప్రోటీన్ సముదాయాలు తరచుగా తీవ్రమైన ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలను మధ్యవర్తిత్వం వహించడానికి బాధ్యత వహించే మొదటి రక్షణ శ్రేణిగా పనిచేస్తాయి. మన నమూనాలో మితమైన జీవక్రియ ఒత్తిడి ఉన్నప్పుడు, mRNA లేదా ప్రోటీన్ స్థాయిలో ఈ జన్యువుల అదనపు క్రియాశీలత అవసరం లేకుండా మైటోకాన్డ్రియల్ సమగ్రతను తగినంతగా పునరుద్ధరించడానికి PTM, ఫ్యూజన్ మరియు ఫిషన్ ప్రోటీన్ల కార్యాచరణను పెంచుతుందని భావిస్తున్నారు.
మొత్తంగా చూస్తే, పైన పేర్కొన్న డేటా మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం యొక్క సంక్లిష్టమైన మరియు సమయ-ఆధారిత నియంత్రణను, అలాగే ఈ యంత్రాంగాలను వివరించడంలో ఉన్న సవాళ్లను హైలైట్ చేస్తుంది. జన్యు వ్యక్తీకరణను అధ్యయనం చేయడానికి, ముందుగా ఆ మార్గంలో నిర్దిష్ట లక్ష్య జన్యువులను గుర్తించడం అవసరం. అయితే, ఒకే మార్గంలోని జన్యువులు ఒకే రకమైన ఒత్తిడికి ఒకే విధంగా స్పందించవని మా డేటా చూపిస్తుంది. వాస్తవానికి, ఒకే మార్గంలోని వేర్వేరు జన్యువులు వేర్వేరు తాత్కాలిక ప్రతిస్పందన ప్రొఫైల్‌లను ప్రదర్శించవచ్చని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి30,46. అదనంగా, ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు జన్యు పనితీరు మధ్య సంబంధాన్ని దెబ్బతీసే సంక్లిష్టమైన పోస్ట్-ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ యంత్రాంగాలు ఉన్నాయి. ప్రోటీయోమిక్ అధ్యయనాలు PTMల ప్రభావం మరియు ప్రోటీన్ పనితీరుపై అంతర్దృష్టిని అందించగలవు, కానీ అవి తక్కువ-త్రూపుట్ పద్ధతులు, అధిక సిగ్నల్-టు-నాయిస్ నిష్పత్తులు మరియు పేలవమైన రిజల్యూషన్ వంటి సవాళ్లను కూడా కలిగి ఉంటాయి.
ఈ సందర్భంలో, TEM మరియు MEL ఉపయోగించి మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని అధ్యయనం చేయడం ద్వారా, మైటోకాన్డ్రియల్ గతిశీలత మరియు పనితీరు మధ్య ఉన్న సంబంధం గురించి మరియు ఇది వ్యాధిని ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందనే ప్రాథమిక ప్రశ్నలను పరిష్కరించడానికి గొప్ప అవకాశం ఉంది. అన్నింటికన్నా ముఖ్యంగా, మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం మరియు గతిశీలత యొక్క ఏకీకృత అంతిమ బిందువుగా మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని కొలవడానికి TEM ఒక ప్రత్యక్ష పద్ధతిని అందిస్తుంది51. MEL కూడా త్రిమితీయ కణ వాతావరణంలో విచ్ఛిత్తి మరియు సంలీన సంఘటనలను దృశ్యమానం చేయడానికి ఒక ప్రత్యక్ష పద్ధతిని అందిస్తుంది, ఇది జన్యు వ్యక్తీకరణలో మార్పులు లేనప్పటికీ గతిశీల మైటోకాన్డ్రియల్ పునర్నిర్మాణాన్ని పరిమాణీకరించడానికి అనుమతిస్తుంది33. ఇక్కడ మేము ద్వితీయ మైటోకాన్డ్రియల్ వ్యాధులలో మైటోకాన్డ్రియల్ ఇమేజింగ్ పద్ధతుల యొక్క ప్రయోజనాన్ని హైలైట్ చేస్తున్నాము. ఈ వ్యాధులు సాధారణంగా తీవ్రమైన మైటోకాన్డ్రియల్ నష్టం కంటే, మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌ల యొక్క సూక్ష్మమైన పునర్నిర్మాణం ద్వారా వర్గీకరించబడిన దీర్ఘకాలిక తేలికపాటి జీవక్రియ ఒత్తిడి ద్వారా వర్గీకరించబడతాయి. అయితే, దీర్ఘకాలిక ఒత్తిడిలో మైటోసిస్‌ను నిర్వహించడానికి అవసరమైన మైటోకాన్డ్రియల్ పరిహారం తీవ్రమైన క్రియాత్మక పరిణామాలను కలిగి ఉంటుంది. న్యూరోసైన్స్ సందర్భంలో, ఈ పరిహార యంత్రాంగాల గురించి మెరుగైన అవగాహన, మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో సంబంధం ఉన్న ప్లియోట్రోపిక్ న్యూరోపాథాలజీ గురించి ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందించవచ్చు.
అంతిమంగా, న్యూరోనల్ మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌ను నియంత్రించే జన్యు వ్యక్తీకరణ, ప్రోటీన్ మార్పులు మరియు ప్రోటీన్ కార్యకలాపాల మధ్య ఉన్న సంక్లిష్టమైన పరస్పర చర్యల యొక్క క్రియాత్మక పరిణామాలను అర్థం చేసుకోవడానికి ఇమేజింగ్ టెక్నిక్‌ల ప్రయోజనాన్ని మా డేటా హైలైట్ చేస్తుంది. ASD యొక్క మైటోకాన్డ్రియల్ అంశంపై అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, మేము ఒక న్యూరోనల్ సెల్ మోడల్‌లో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని మోడల్ చేయడానికి PPAను ఉపయోగించాము. PPAతో చికిత్స పొందిన SH-SY5Y కణాలు మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపంలో మార్పులను చూపించాయి: TEM ద్వారా గమనించినప్పుడు మైటోకాన్డ్రియా చిన్నవిగా మరియు గుండ్రంగా మారాయి, మరియు క్రిస్టేలు సరిగా నిర్వచించబడలేదు. తేలికపాటి జీవక్రియ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా మైటోకాన్డ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌ను నిర్వహించడానికి ఫిషన్ మరియు ఫ్యూజన్ సంఘటనలలో పెరుగుదలతో పాటు ఈ మార్పులు ఏకకాలంలో సంభవిస్తాయని MEL విశ్లేషణ చూపిస్తుంది. అంతేకాకుండా, PPA మైటోకాన్డ్రియల్ జీవక్రియ మరియు హోమియోస్టాసిస్ యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణను గణనీయంగా దెబ్బతీస్తుంది. PPA ఒత్తిడి ద్వారా దెబ్బతిన్న cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, మరియు OPA1లను కీలక మైటోకాన్డ్రియల్ రెగ్యులేటర్లుగా మేము గుర్తించాము మరియు ఇవి PPA-ప్రేరిత మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపం మరియు పనితీరులో మార్పులకు మధ్యవర్తిత్వం వహించడంలో పాత్ర పోషించవచ్చు. జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు ప్రోటీన్ కార్యకలాపాలు, స్థానికీకరణ మరియు పోస్ట్-ట్రాన్స్‌లేషనల్ మార్పులలో PPA-ప్రేరిత తాత్కాలిక మార్పులను మరింత మెరుగ్గా వర్గీకరించడానికి భవిష్యత్ అధ్యయనాలు అవసరం. మైటోకాన్డ్రియల్ ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనను మధ్యవర్తిత్వం చేసే నియంత్రణ యంత్రాంగాల సంక్లిష్టత మరియు పరస్పర ఆధారపడటాన్ని మా డేటా హైలైట్ చేస్తుంది మరియు మరింత లక్షిత యాంత్రిక అధ్యయనాల కోసం TEM మరియు ఇతర ఇమేజింగ్ టెక్నిక్‌ల ప్రయోజనాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది.
SH-SY5Y కణ శ్రేణి (ECACC, 94030304-1VL)ని సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ నుండి కొనుగోలు చేశారు. SH-SY5Y కణాలను 25 cm2 ఫ్లాస్క్‌లలో డల్బెక్కోస్ మాడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియం/F-12 న్యూట్రియెంట్ మిశ్రమం (DMEM/F-12) మరియు L-గ్లూటమైన్ (SC09411, సైన్‌సెల్)లో పెంచారు. దీనికి 20% ఫీటల్ బోవైన్ సీరం (FBS) (10493106, థర్మోఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు 1% పెన్సిలిన్-స్ట్రెప్టోమైసిన్ (P4333-20ML, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)లను అనుబంధంగా చేర్చారు. ఈ కణాలను 37 °C, 5% CO2 వద్ద పెంచారు. 0.05% ట్రిప్సిన్-EDTA (15400054, థర్మోఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి కణాలను 80% సాంద్రతకు సబ్‌కల్చర్ చేసి, 300 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సుమారుగా 7 × 10⁵ కణాలు/ml సాంద్రతతో ప్లేట్ చేశారు. అన్ని ప్రయోగాలు 19–22 పాసేజ్‌ల మధ్య ఉన్న అవ్యవస్థీకృత SH-SY5Y కణాలపై నిర్వహించబడ్డాయి. PPAను NaP రూపంలో ఇస్తారు. NaP పౌడర్‌ను (CAS నం. 137-40-6, రసాయన ఫార్ములా C₃H₅NaO₂, P5436-100G, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) గోరువెచ్చని మిల్లీక్యూ నీటిలో 1 M గాఢతకు కరిగించి, 4 °C వద్ద నిల్వ చేయండి. చికిత్స రోజున, ఈ ద్రావణాన్ని 1 M PPAతో కలిపి సీరమ్-రహిత మాధ్యమంలో (L-గ్లూటమైన్‌తో కూడిన DMEM/F-12) 3 mM మరియు 5 mM PPA గాఢతలకు పలుచగా చేయండి. అన్ని ప్రయోగాలకు చికిత్స గాఢతలు PPA లేకుండా (0 mM, నియంత్రణ), 3 mM, మరియు 5 mM PPA గా ఉన్నాయి. ప్రయోగాలు కనీసం మూడు జీవసంబంధమైన పునరావృత్తులలో నిర్వహించబడ్డాయి.
SH-SY5Y కణాలను 25 cm⁵ ఫ్లాస్క్‌లలో 5.5 × 10⁵ కణాలు/ml చొప్పున వేసి, 24 గంటల పాటు పెంచారు. 24 గంటల ఇంక్యుబేషన్‌కు ముందు ఫ్లాస్క్‌కు PPA ట్రీట్‌మెంట్ జోడించబడింది. సాధారణ క్షీరద కణజాల సబ్‌కల్చర్ ప్రోటోకాల్‌లను (పైన వివరించినవి) అనుసరించి కణ గుళికలను (సెల్ పెల్లెట్‌లను) సేకరించండి. కణ గుళికను 100 µl 2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్, 1× PBSలో తిరిగి కలిపి, ప్రాసెస్ చేసే వరకు 4 °C వద్ద నిల్వ చేయండి. కణాలను గుళికగా మార్చడానికి మరియు 2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్, 1× PBS ద్రావణాన్ని తొలగించడానికి SH-SY5Y కణాలను క్లుప్తంగా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. అవక్షేపాన్ని స్వేదన జలంలో తయారుచేసిన 4% అగరోస్ జెల్‌లో తిరిగి కలపండి (అగరోస్ మరియు అవక్షేప పరిమాణం నిష్పత్తి 1:1). అగరోస్ ముక్కలను చదునైన పలకలపై గ్రిడ్ల మీద ఉంచి, అధిక-పీడన ఫ్రీజింగ్‌కు ముందు 1-హెక్సాడెసీన్‌తో పూత పూశారు. నమూనాలను 100% పొడి అసిటోన్‌లో -90°C వద్ద 24 గంటల పాటు ఘనీభవింపజేయడం జరిగింది. ఆ తర్వాత ఉష్ణోగ్రతను -80°C కి పెంచి, 1% ఓస్మియం టెట్రాక్సైడ్ మరియు 0.1% గ్లూటరాల్డిహైడ్ ద్రావణాన్ని కలపడం జరిగింది. నమూనాలను -80°C వద్ద 24 గంటల పాటు నిల్వ ఉంచడం జరిగింది. దీని తర్వాత, ఉష్ణోగ్రతను అనేక రోజుల పాటు క్రమంగా గది ఉష్ణోగ్రతకు పెంచడం జరిగింది: –80°C నుండి –50°C కి 24 గంటల పాటు, –30°C కి 24 గంటల పాటు, –10°C కి 24 గంటల పాటు మరియు చివరగా గది ఉష్ణోగ్రతకు పెంచడం జరిగింది.
క్రయోజెనిక్ తయారీ తర్వాత, నమూనాలకు రెసిన్‌ను పూసి, లీకా రీచెర్ట్ అల్ట్రాకట్ఎస్ అల్ట్రామైక్రోటోమ్ (లీకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి అతి సన్నని సెక్షన్లను (∼100 nm) తయారు చేశారు. సెక్షన్లకు 2% యురేనిల్ అసిటేట్ మరియు లెడ్ సిట్రేట్‌తో రంగు వేశారు. నమూనాలను 200 kV (Lab6 ట్రాన్స్‌మిటర్) వద్ద పనిచేసే FEI టెక్నై 20 ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (థర్మోఫిషర్ (పూర్వం FEI), ఐండ్‌హోవెన్, నెదర్లాండ్స్) మరియు ట్రైడియమ్ ఎనర్జీ ఫిల్టర్‌తో కూడిన గాటన్ CCD కెమెరా (గాటన్, UK) ఉపయోగించి పరిశీలించారు.
ప్రతి సాంకేతిక పునరావృతంలో, కనీసం 24 ఏక కణ చిత్రాలను సేకరించారు, మొత్తం 266 చిత్రాలు. అన్ని చిత్రాలను రీజియన్ ఆఫ్ ఇంటరెస్ట్ (ROI) మాక్రో మరియు మైటోకాండ్రియా మాక్రో ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. మైటోకాండ్రియా మాక్రో ప్రచురించబడిన పద్ధతులు17,31,32 పై ఆధారపడి ఉంటుంది మరియు Fiji/ImageJ69లో TEM చిత్రాల సెమీ-ఆటోమేటెడ్ బ్యాచ్ ప్రాసెసింగ్‌ను అనుమతిస్తుంది. క్లుప్తంగా చెప్పాలంటే: రోలింగ్ బాల్ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సబ్‌ట్రాక్షన్ (60 పిక్సెల్ వ్యాసార్థం) మరియు ఒక FFT బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్ (వరుసగా 60 మరియు 8 పిక్సెల్ ఎగువ మరియు దిగువ పరిమితులను ఉపయోగించి) మరియు 5% ఓరియంటేషన్ టాలరెన్స్‌తో వర్టికల్ లైన్ సప్రెషన్ ఉపయోగించి చిత్రాన్ని విలోమం చేస్తారు. ప్రాసెస్ చేయబడిన చిత్రం గరిష్ట ఎంట్రోపీ అల్గోరిథం ఉపయోగించి స్వయంచాలకంగా థ్రెషోల్డ్ చేయబడుతుంది మరియు ఒక బైనరీ మాస్క్ ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది. ముడి TEM చిత్రాలలో మాన్యువల్‌గా ఎంచుకున్న ROIలతో అనుబంధించబడిన చిత్ర ప్రాంతాలు సంగ్రహించబడ్డాయి, ఇవి మైటోకాండ్రియాను వర్గీకరించి, ప్లాస్మా పొర మరియు ఇతర అధిక-కాంట్రాస్ట్ ప్రాంతాలను మినహాయించాయి. సంగ్రహించిన ప్రతి ROI కోసం, 600 పిక్సెల్‌ల కంటే పెద్దవైన బైనరీ కణాలను విశ్లేషించారు, మరియు Fiji/ImageJ యొక్క అంతర్నిర్మిత కొలత ఫంక్షన్‌లను ఉపయోగించి కణ వైశాల్యం, చుట్టుకొలత, ప్రధాన మరియు చిన్న అక్షాలు, ఫెరెట్ వ్యాసం, గుండ్రదనం మరియు వృత్తాకారతను కొలిచారు. మెరిల్, ఫ్లిప్పో మరియు స్ట్రాక్ (2017)ను అనుసరించి, ఈ డేటా నుండి వైశాల్యం 2, కణ ఆస్పెక్ట్ రేషియో (ప్రధాన నుండి చిన్న అక్షం నిష్పత్తి), మరియు షేప్ ఫ్యాక్టర్ (FF)లను లెక్కించారు, ఇక్కడ FF = చుట్టుకొలత 2/4pi x వైశాల్యం. పారామెట్రిక్ ఫార్ములా యొక్క నిర్వచనాన్ని మెరిల్, ఫ్లిప్పో మరియు స్ట్రాక్ (2017)లో చూడవచ్చు. పేర్కొన్న మాక్రోలు GitHubలో అందుబాటులో ఉన్నాయి (డేటా లభ్యత ప్రకటన చూడండి). సగటున, ప్రతి PPA చికిత్సకు సుమారు 5,600 కణాలను విశ్లేషించారు, మొత్తం మీద సుమారు 17,000 కణాలు (డేటా చూపబడలేదు).
SH-SH5Y కణాలను రాత్రిపూట అంటుకోవడానికి వీలుగా 8-ఛాంబర్ కల్చర్ డిష్‌లలో (థర్మోఫిషర్, #155411) ఉంచి, ఆపై TMRE 1:1000 (థర్మోఫిషర్, #T669) మరియు హోచ్స్ట్ 33342 1:200 (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, H6024) తో ఇంక్యుబేట్ చేసి రంగు వేశారు. 10 నిమిషాల వ్యవధిలో 405 nm మరియు 561 nm లేజర్‌లను ఉపయోగించి చిత్రాలను సేకరించారు, మరియు 12 వరుస సమయ పాయింట్ల వద్ద, ఇమేజ్ ఫ్రేమ్‌ల మధ్య 0.2 μm az స్టెప్‌తో 10 ఇమేజ్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లను కలిగి ఉన్న z-స్టాక్‌లుగా ముడి చిత్రాలను సేకరించారు. LCI ప్లాన్ అపోక్రోమేట్ 100x/1.4 ఆయిల్ DIC M27 లెన్స్‌ను ఉపయోగించి కార్ల్ జీస్ LSM780 ఎలిరా PS.1 సూపర్-రిజల్యూషన్ ప్లాట్‌ఫారమ్ (కార్ల్ జీస్, ఓబర్‌కోచెన్, జర్మనీ) ద్వారా చిత్రాలను సేకరించారు. ఫ్యూజన్ మరియు ఫిషన్ ఈవెంట్‌లు, మైటోకాన్డ్రియల్ నిర్మాణాల సగటు సంఖ్య మరియు ప్రతి కణానికి సగటు మైటోకాన్డ్రియల్ పరిమాణాన్ని కొలవడానికి, గతంలో వివరించిన పైప్‌లైన్ మరియు ImageJ ప్లగిన్‌ను ఉపయోగించి ImageJలో చిత్రాలు విశ్లేషించబడ్డాయి33. MEL మాక్రోలు GitHubలో అందుబాటులో ఉన్నాయి (డేటా లభ్యత ప్రకటనను చూడండి).
చికిత్సకు ముందు, SH-SY5Y కణాలను ఆరు-బావుల ప్లేట్లలో 0.3 × 10⁶ కణాలు/mL సాంద్రతతో 24 గంటల పాటు పెంచారు. క్విక్-RNA™ మినీప్రెప్ ప్రోటోకాల్ (ZR R1055, జైమో రీసెర్చ్) ను ఉపయోగించి, స్వల్ప మార్పులతో RNA ను సంగ్రహించారు: తొలగించే ముందు ప్రతి బావికి 300 μl RNA లైసిస్ బఫర్‌ను జోడించి, చివరి దశగా ప్రతి నమూనాను 30 μl DNase/RNase ఎల్యూషన్ -రహిత నీటితో లైసిస్ చేశారు. అన్ని నమూనాల పరిమాణం మరియు నాణ్యతను నానోడ్రాప్ ND-1000 UV-విస్ స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌ను ఉపయోగించి తనిఖీ చేశారు. కణ లైసేట్‌ల నుండి మొత్తం ప్రోటీన్‌ను 200 μl RIPA లైసిస్ బఫర్‌ను ఉపయోగించి పొందారు, మరియు బ్రాడ్‌ఫోర్డ్ ప్రోటీన్ అస్సే⁷⁰ ను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ సాంద్రతను లెక్కించారు.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం, కొన్ని మార్పులతో టెట్రో™ cDNA సింథసిస్ కిట్ (BIO-65043, మెరిడియన్ బయోసైన్స్) ఉపయోగించి cDNA సంశ్లేషణ జరిగింది. 0.7 నుండి 1 μg మొత్తం RNA ఉపయోగించి 20-μl రియాక్షన్లలో cDNA సంశ్లేషణ చేయబడింది. గతంలో ప్రచురించిన పత్రాలు 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (పట్టిక S1) నుండి ప్రైమర్‌లు ఎంపిక చేయబడ్డాయి మరియు ఇంటిగ్రేటెడ్ DNA టెక్నాలజీస్ వారి ప్రైమర్‌క్వెస్ట్ టూల్ ఉపయోగించి అనుబంధ ప్రోబ్‌లు రూపొందించబడ్డాయి. ఆసక్తి ఉన్న అన్ని జన్యువులు న్యూక్లియర్ B2M జన్యువుకు సాధారణీకరించబడ్డాయి. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC మరియు OPA1 యొక్క జన్యు వ్యక్తీకరణ RT-qPCR ద్వారా కొలవబడింది. మాస్టర్ మిక్స్‌లో లూనా టాక్ పాలిమరేస్ (M3003L, న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్), 10 μM ఫార్వర్డ్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్‌లు, cDNA, మరియు PCR-గ్రేడ్ నీరు ఉన్నాయి, దీని ఫలితంగా ప్రతి చర్యకు 10 μL తుది పరిమాణం లభిస్తుంది. విభజన మరియు విచ్ఛిత్తి జన్యువుల (DRP1, MFN1/2) వ్యక్తీకరణను టాక్‌మ్యాన్ మల్టీప్లెక్స్ అస్సేలను ఉపయోగించి కొలిచారు. లూనా యూనివర్సల్ ప్రోబ్ qPCR మాస్టర్ మిక్స్ (M3004S, న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)ను తయారీదారు సూచనల ప్రకారం చిన్న మార్పులతో ఉపయోగించారు. మల్టీప్లెక్స్ RT-qPCR మాస్టర్ మిక్స్‌లో 1X లూనా టాక్ పాలిమరేస్, 10 μM ఫార్వర్డ్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్‌లు, 10 μM ప్రోబ్, cDNA, మరియు PCR-గ్రేడ్ నీరు ఉంటాయి, దీని ఫలితంగా ప్రతి చర్యకు 20 μL తుది పరిమాణం లభిస్తుంది. RT-qPCRను రోటర్-జీన్ Q 6-ప్లెక్స్ (QIAGEN RG—సీరియల్ నంబర్: R0618110) ఉపయోగించి నిర్వహించారు. సైక్లింగ్ పరిస్థితులు పట్టిక S1లో చూపబడ్డాయి. అన్ని cDNA నమూనాలను ట్రిప్లికేట్‌లో విస్తరించారు మరియు పది రెట్లు పలుచనల శ్రేణిని ఉపయోగించి ఒక ప్రామాణిక వక్రరేఖను రూపొందించారు. డేటా పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి, సైకిల్ థ్రెషోల్డ్ ప్రామాణిక విచలనం (Ct) >0.5 ఉన్న ట్రిప్లికేట్ నమూనాలలో అవుట్‌లయర్‌లను విశ్లేషణ నుండి తొలగించారు30,72. సాపేక్ష జన్యు వ్యక్తీకరణను 2-ΔΔCt79 పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించారు.
ప్రోటీన్ నమూనాలను (60 μg) 2:1 నిష్పత్తిలో లామ్లీ లోడింగ్ బఫర్‌తో కలిపి, 12% రంగులేని ప్రోటీన్ జెల్ (బయో-రాడ్ #1610184) పై రన్ చేశారు. ట్రాన్స్-బ్లాట్ టర్బో సిస్టమ్ (#170-4155, బయో-రాడ్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్‌లను PVDF (పాలివినైలిడీన్ ఫ్లోరైడ్) మెంబ్రేన్ (#170-84156, బయో-రాడ్) కు బదిలీ చేశారు. మెంబ్రేన్‌ను బ్లాక్ చేసి, తగిన ప్రైమరీ యాంటీబాడీలతో (OPA1, MFN1, MFN2, మరియు DRP1) (1:1000 నిష్పత్తిలో పలుచబడినవి) 48 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు, ఆ తర్వాత సెకండరీ యాంటీబాడీలతో (1:10,000) 1 గంట పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. అనంతరం క్లారిటీ వెస్ట్రన్ ECL సబ్‌స్ట్రేట్ (#170-5061, బయో-రాడ్) ఉపయోగించి మెంబ్రేన్‌లను ఇమేజ్ చేసి, బయో-రాడ్ కెమిడాక్ MP సిస్టమ్ ద్వారా రికార్డ్ చేశారు. వెస్టర్న్ బ్లాట్ విశ్లేషణ కోసం ఇమేజ్‌ల్యాబ్ వెర్షన్ 6.1 ఉపయోగించబడింది. అసలు జెల్ మరియు బ్లాట్ చిత్రం S1లో చూపబడ్డాయి. యాంటీబాడీ సమాచారం పట్టిక S2లో అందించబడింది.
డేటా సెట్‌లు కనీసం మూడు స్వతంత్ర నమూనాల సగటు మరియు సగటు యొక్క ప్రామాణిక దోషం (SEM)గా ప్రదర్శించబడ్డాయి. గౌసియన్ పంపిణీ మరియు సమాన ప్రామాణిక విచలనాలను ఊహించి, విశ్లేషణలతో ముందుకు సాగడానికి ముందు, డేటా సెట్‌లు (వేరే విధంగా పేర్కొనకపోతే తప్ప) షాపిరో-విల్క్స్ పరీక్షను ఉపయోగించి సాధారణత కోసం పరీక్షించబడ్డాయి. ప్రాముఖ్యతను (p < 0.05) నిర్ధారించడానికి ఫిషర్ యొక్క MEL LSD (p < 0.05), వన్-వే ANOVA (ట్రీట్‌మెంట్ వర్సెస్ కంట్రోల్ సగటు), మరియు డన్నెట్ యొక్క బహుళ పోలిక పరీక్షను ఉపయోగించి డేటా సెట్‌ను విశ్లేషించడంతో పాటు. ముఖ్యమైన p విలువలు గ్రాఫ్‌లో *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001గా చూపబడ్డాయి. అన్ని గణాంక విశ్లేషణలు మరియు గ్రాఫ్‌లు గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 9.4.0 ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి మరియు రూపొందించబడ్డాయి.
TEM చిత్ర విశ్లేషణ కోసం Fiji/ImageJ మాక్రోలు GitHubలో అందరికీ అందుబాటులో ఉన్నాయి: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. మైటోకాండ్రియల్ ఈవెంట్ లొకేటర్ (MEL) మాక్రో GitHubలో అందరికీ అందుబాటులో ఉంది: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
మెయిలియానా ఎ., దేవి ఎన్ఎమ్ మరియు విజయ ఎ. మైటోకాండ్రియా: జీవక్రియ, హోమియోస్టాసిస్, ఒత్తిడి, వృద్ధాప్యం మరియు ఎపిజెనెటిక్స్ యొక్క మాస్టర్ రెగ్యులేటర్లు. ఇండోనేషియన్. బయోమెడికల్ సైన్స్. జె. 13, 221–241 (2021).
బెన్-షాచార్, డి. స్కిజోఫ్రీనియాలో బహుముఖ మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడం, కాంప్లెక్స్ I ఒక సాధ్యమైన రోగనిర్ధారణ లక్ష్యంగా. స్కిజోఫ్రీనియా. రిసోర్స్. 187, 3–10 (2017).
బోస్, ఎ. మరియు బీల్, ఎంఎఫ్ పార్కిన్సన్స్ వ్యాధిలో మైటోకాండ్రియా పనితీరు లోపం. జె. న్యూరోకెమిస్ట్రీ. 139, 216–231 (2016).
శర్మ వికె, సింగ్ టిజి మరియు మెహతా వి. ఒత్తిడికి గురైన మైటోకాండ్రియా: అల్జీమర్స్ వ్యాధిలో దాడికి లక్ష్యాలు. మైటోకాండ్రియా 59, 48–57 (2021).
బెలేంగర్ పి., డువార్టే జెఎమ్ఎన్, షుక్ పిఎఫ్ మరియు ఫెరీరా జికె మైటోకాండ్రియా మరియు మెదడు: బయోఎనర్జెటిక్స్ మరియు మరిన్ని. న్యూరోటాక్సిన్స్. రిసోర్స్. 36, 219–238 (2019).
రంగరాజు, వి. మరియు ఇతరులు. ప్లియోట్రోపిక్ మైటోకాండ్రియా: నాడీ కణాల అభివృద్ధి మరియు వ్యాధిపై మైటోకాండ్రియా ప్రభావం. జె. న్యూరోసైన్స్. 39, 8200–8208 (2019).
కార్డానో-రామోస్, సి. మరియు మొరైస్, వి.ఎ. న్యూరాన్లలో మైటోకాండ్రియా జీవజననం: ఎలా మరియు ఎక్కడ. అంతర్జాతీయత. జె. మోర్. ది సైన్స్. 22, 13059 (2021).
యు, ఆర్., లెండాల్, యు., నిస్టర్, ఎం. మరియు జావో, జె. క్షీరదాల మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్ నియంత్రణ: అవకాశాలు మరియు సవాళ్లు. ఫ్రంట్. ఎండోక్రైన్. (లౌసాన్) 11, 374 (2020).
ఖాచో, ఎం. మరియు స్లాక్, ఆర్.ఎస్. న్యూరోజెనిసిస్ నియంత్రణలో మైటోకాండ్రియా గతిశీలత: అభివృద్ధి చెందుతున్న మెదడు నుండి వయోజన మెదడు వరకు. డెవలప్‌మెంట్. డైనమిక్. 247, 47–53 (2018).