ప్రస్తుతం *ప్రస్తుత చిరునామా: కొలోన్ 50931, జర్మనీ, కొలోన్ ఎక్సలెన్స్ క్లస్టర్ రీసెర్చ్ ఆన్ సెల్యులార్ స్ట్రెస్ రెస్పాన్స్ ఇన్ ఏజింగ్-రిలేటెడ్ డిసీజెస్ (CECAD).
మైటోకాన్డ్రియల్ వ్యాధుల వల్ల కలిగే న్యూరోడిజెనరేషన్ కోలుకోలేనిదిగా పరిగణించబడుతుంది, ఎందుకంటే న్యూరాన్ల జీవక్రియ ప్లాస్టిసిటీ పరిమితంగా ఉంటుంది. కానీ, శరీరంలో న్యూరాన్ల జీవక్రియ యొక్క కణ స్వయంప్రతిపత్తిపై మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల కలిగే ప్రభావం గురించి అంతగా అవగాహన లేదు. ఇక్కడ, దెబ్బతిన్న మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్ డైనమిక్స్ వల్ల క్రమంగా ఆక్స్‌ఫాస్ (OXPHOS) లోపంతో బాధపడుతున్న పర్కింజే న్యూరాన్ల యొక్క కణ-నిర్దిష్ట ప్రోటీయోమ్‌ను మేము పరిచయం చేస్తున్నాము. మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం ప్రోటీయోమిక్స్ రంగంలో ఒక ప్రగాఢమైన మార్పును ప్రేరేపించిందని, ఇది చివరికి కణ మరణానికి ముందు నిర్దిష్ట జీవక్రియ కార్యక్రమాల క్రమబద్ధమైన క్రియాశీలతకు దారితీసిందని మేము కనుగొన్నాము. ఊహించని విధంగా, TCA సైకిల్ ఇంటర్మీడియట్‌లను భర్తీ చేయడానికి సంబంధించిన పైరువేట్ కార్బాక్సిలేస్ (PCx) మరియు ఇతర పెరాక్సిడేస్‌ల స్పష్టమైన ప్రేరణను మేము నిర్ధారించాము. PCx నిరోధం ఆక్సిడేటివ్ ఒత్తిడిని మరియు న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను తీవ్రతరం చేసింది, ఇది ఆక్స్‌ఫాస్ (OXPHOS) లేని న్యూరాన్లలో అథెరోస్క్లెరోసిస్ ఒక రక్షణాత్మక ప్రభావాన్ని కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది. పూర్తిగా క్షీణించిన న్యూరాన్లలో మైటోకాన్డ్రియల్ ఫ్యూజన్‌ను పునరుద్ధరించడం ఈ జీవక్రియ లక్షణాలను పూర్తిగా తిప్పికొడుతుంది, తద్వారా కణ మరణాన్ని నివారిస్తుంది. మా పరిశోధన ఫలితాలు, మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని తట్టుకునే శక్తిని ఇచ్చే, ఇంతకుముందు తెలియని మార్గాలను గుర్తించాయి మరియు వ్యాధి చివరి దశలలో కూడా నరాల క్షీణతను తిప్పికొట్టవచ్చని చూపిస్తున్నాయి.
మానవ మైటోకాండ్రియా వ్యాధులతో సంబంధం ఉన్న విస్తృతమైన నాడీ సంబంధిత లక్షణాల ద్వారా నాడీ కణాల శక్తి జీవక్రియను నిర్వహించడంలో మైటోకాండ్రియా యొక్క కేంద్ర పాత్ర నొక్కి చెప్పబడింది. ఈ వ్యాధులలో చాలా వరకు మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యు వ్యక్తీకరణను నియంత్రించే జన్యు ఉత్పరివర్తనాల (1, 2) లేదా మైటోకాన్డ్రియల్ డైనమిక్స్‌కు సంబంధించిన జన్యు విధ్వంసం వల్ల సంభవిస్తాయి, ఇవి పరోక్షంగా మైటోకాన్డ్రియల్ DNA (mtDNA) యొక్క స్థిరత్వాన్ని ప్రభావితం చేస్తాయి (3, 4). జంతు నమూనాలలో చేసిన పరిశోధనలు, చుట్టుపక్కల కణజాలాలలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి ప్రతిస్పందనగా, సంప్రదాయ జీవక్రియ మార్గాలు (5-7) సక్రియం చేయబడతాయని చూపించాయి, తద్వారా ఈ సంక్లిష్ట వ్యాధుల వ్యాధిజననంపై ముఖ్యమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తున్నాయి. దీనికి పూర్తి విరుద్ధంగా, మెదడు మైటోకాన్డ్రియల్ అడెనోసిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (ATP) ఉత్పత్తి యొక్క సాధారణ వైఫల్యం వల్ల నిర్దిష్ట కణ రకాలలో కలిగే జీవక్రియ మార్పులపై మన అవగాహన ప్రాథమికమైనది (8), ఇది వ్యాధిని నివారించడానికి లేదా నిరోధించడానికి ఉపయోగపడే చికిత్సా లక్ష్యాలను గుర్తించాల్సిన అవసరాన్ని నొక్కి చెబుతుంది. న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను నివారించడం (9). చుట్టుపక్కల కణజాలాలలోని కణ రకాలతో పోలిస్తే నాడీ కణాలకు చాలా పరిమిత జీవక్రియ సౌలభ్యం ఉందని విస్తృతంగా పరిగణించబడుతున్న వాస్తవంపై సమాచారం కొరత ఉంది (10). సినాప్టిక్ ప్రసారాన్ని ప్రోత్సహించడానికి మరియు గాయం మరియు వ్యాధి పరిస్థితులకు ప్రతిస్పందించడానికి న్యూరాన్‌లకు జీవక్రియల సరఫరాను సమన్వయం చేయడంలో ఈ కణాలు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి కాబట్టి, మెదడు కణజాలం యొక్క సవాలుతో కూడిన పరిస్థితులకు కణ జీవక్రియను అనుగుణంగా మార్చుకునే సామర్థ్యం దాదాపుగా గ్లియల్ కణాలకే పరిమితం (11-14). అదనంగా, మెదడు కణజాలం యొక్క సహజమైన సెల్యులార్ వైవిధ్యం నిర్దిష్ట న్యూరోనల్ ఉప సమూహాలలో సంభవించే జీవక్రియ మార్పుల అధ్యయనాన్ని ఎక్కువగా అడ్డుకుంటుంది. ఫలితంగా, న్యూరాన్‌లలో మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల కలిగే కచ్చితమైన సెల్యులార్ మరియు జీవక్రియ పరిణామాల గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.
మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల కలిగే జీవక్రియ పరిణామాలను అర్థం చేసుకోవడానికి, మైటోకాన్డ్రియల్ ఔటర్ మెంబ్రేన్ ఫ్యూజన్ (Mfn2) నాశనం కావడం వల్ల కలిగే న్యూరోడిజెనరేషన్ యొక్క వివిధ దశలలో ఉన్న పర్కింజే న్యూరాన్‌లను (PNs) మేము వేరు చేశాము. మానవులలో Mfn2 ఉత్పరివర్తనలు చార్కోట్-మేరీ-టూత్ టైప్ 2A (15) అని పిలువబడే ఒక రకమైన వంశపారంపర్య మోటార్ సెన్సరీ న్యూరోపతితో సంబంధం కలిగి ఉన్నప్పటికీ, ఎలుకలలో Mfn2 యొక్క షరతులతో కూడిన నాశనం అనేది ఆక్సీకరణ ఫాస్ఫోరైలేషన్ (OXPHOS) పనిచేయకపోవడాన్ని ప్రేరేపించే ఒక సుప్రసిద్ధ పద్ధతి. వివిధ న్యూరల్ ఉపరకాలు (16-19) మరియు ఫలితంగా వచ్చే న్యూరోడిజెనరేటివ్ ఫినోటైప్, కదలిక రుగ్మతలు (18, 19) లేదా సెరెబెల్లార్ అటాక్సియా (16) వంటి ప్రగతిశీల నాడీ సంబంధిత లక్షణాలతో కూడి ఉంటాయి. లేబుల్-రహిత పరిమాణాత్మక (LFQ) ప్రోటీయోమిక్స్, మెటాబోలోమిక్స్, ఇమేజింగ్ మరియు వైరాలజికల్ పద్ధతుల కలయికను ఉపయోగించి, ప్రగతిశీల న్యూరోడిజెనరేషన్, ఇన్ వివోలో PNల ఆర్టీరియోస్క్లెరోసిస్‌లో పాల్గొనే పైరువేట్ కార్బాక్సిలేస్ (PCx) మరియు ఇతర కారకాల ఎంజైమ్‌ల వ్యక్తీకరణను బలంగా ప్రేరేపిస్తుందని మేము చూపిస్తున్నాము. ఈ ఆవిష్కరణ యొక్క ప్రాముఖ్యతను ధృవీకరించడానికి, మేము ప్రత్యేకంగా Mfn2-లోపం ఉన్న PNలలో PCx వ్యక్తీకరణను తగ్గించాము మరియు ఈ చర్య ఆక్సీకరణ ఒత్తిడిని తీవ్రతరం చేసి, న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను వేగవంతం చేసిందని కనుగొన్నాము. తద్వారా అజూస్పెర్మియా కణ మరణానికి జీవక్రియ అనుకూలతను కల్పిస్తుందని నిరూపించబడింది. MFN2 యొక్క తీవ్రమైన వ్యక్తీకరణ, తీవ్రమైన OXPHOS లోపం, మైటోకాండ్రియల్ DNA యొక్క భారీ వినియోగం మరియు స్పష్టంగా దెబ్బతిన్న మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్‌తో ఉన్న టెర్మినల్ డిజెనరేషన్ PNను పూర్తిగా రక్షించగలదు. ఇది, ఈ రకమైన న్యూరోడిజెనరేషన్ కణ మరణానికి ముందు వ్యాధి యొక్క అధునాతన దశలో కూడా కోలుకోగలదని మరింత నొక్కి చెబుతుంది.
Mfn2 నాకౌట్ PNలలో మైటోకాండ్రియాను దృశ్యమానం చేయడానికి, మేము క్రీ-ఆధారిత మైటోకాండ్రియాను పసుపు ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (YFP) (mtYFP) (20) క్రీ వ్యక్తీకరణను లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి అనుమతించే మౌస్ జాతిని ఉపయోగించాము మరియు వివోలో మైటోకాండ్రియల్ స్వరూపాన్ని తనిఖీ చేసాము. PNలలో Mfn2 జన్యువు యొక్క నాశనం మైటోకాండ్రియల్ నెట్‌వర్క్ యొక్క క్రమమైన విభజనకు దారితీస్తుందని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి S1A), మరియు తొలి మార్పు 3 వారాల వయస్సులో కనుగొనబడింది. దీనికి విరుద్ధంగా, కాల్బిండిన్ ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కోల్పోవడం ద్వారా రుజువైనట్లుగా, PN కణ పొర యొక్క గణనీయమైన క్షీణత 12 వారాల వయస్సు వరకు ప్రారంభం కాలేదు (మూర్తి 1, A మరియు B). మైటోకాండ్రియల్ స్వరూపంలో తొలి మార్పులకు మరియు న్యూరాన్ మరణం యొక్క కనిపించే ప్రారంభానికి మధ్య ఉన్న సమయ వ్యత్యాసం, కణ మరణానికి ముందు మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడం వల్ల ప్రేరేపించబడిన జీవక్రియ మార్పులను పరిశోధించడానికి మమ్మల్ని పురికొల్పింది. మేము YFP (YFP+) ను వ్యక్తపరిచే PN (పటం 1C) ను, మరియు నియంత్రణ ఎలుకలలో (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ఇకపై CTRL అని పిలవబడే వాటిని (పటం S1B) వేరుచేయడానికి ఫ్లోరోసెన్స్-యాక్టివేటెడ్ సెల్ సార్టింగ్ (FACS)-ఆధారిత వ్యూహాన్ని అభివృద్ధి చేశాము. YFP సిగ్నల్ యొక్క సాపేక్ష తీవ్రత ఆధారంగా గేటింగ్ వ్యూహాన్ని ఆప్టిమైజ్ చేయడం ద్వారా, మేము PN ల యొక్క YFP+ బాడీని (YFPhigh) నాన్-PN ల (YFPneg) (పటం S1B) నుండి లేదా ఫ్లోరోసెంట్ ఆక్సాన్/డెండ్రైటిక్ శకలాల (YFPlow; పటం S1D, ఎడమ) నుండి శుద్ధి చేయగలిగాము, దీనిని కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా నిర్ధారించాము (పటం S1D, కుడి). వర్గీకరించబడిన జనాభా యొక్క గుర్తింపును ధృవీకరించడానికి, మేము LFQ ప్రోటీయోమిక్స్ మరియు తరువాత ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము, మరియు YFPhigh మరియు YFPneg కణాల మధ్య స్పష్టమైన విభజన ఉందని కనుగొన్నాము (పటం S1C). YFPhigh కణాలు తెలిసిన PN మార్కర్ల (అంటే Calb1, Pcp2, Grid2 మరియు Itpr3) నికర సమృద్ధిని చూపించాయి (21, 22), కానీ న్యూరాన్లు లేదా ఇతర కణ రకాలలో సాధారణంగా వ్యక్తమయ్యే ప్రోటీన్ల సమృద్ధిని చూపించలేదు (మూర్తి 1D). స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో సేకరించిన వర్గీకరించబడిన YFPhigh కణాలలోని నమూనాల మధ్య పోలిక 0.9 కంటే ఎక్కువ సహసంబంధ గుణకాన్ని చూపించింది, ఇది జీవసంబంధమైన ప్రతిరూపాల మధ్య మంచి పునరుత్పత్తిని ప్రదర్శిస్తుంది (మూర్తి S1E). సారాంశంలో, ఈ డేటా సాధ్యమయ్యే PN యొక్క తక్షణ మరియు నిర్దిష్ట ఐసోలేషన్ కోసం మా ప్రణాళికను ధృవీకరించింది. ఉపయోగించిన L7-cre డ్రైవర్ సిస్టమ్ డెలివరీ తర్వాత మొదటి వారంలో మొజాయిక్ రీకాంబినేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది కాబట్టి (23), మేము CTRL మరియు కండిషనల్ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) నుండి ఎలుకలను ఎంపిక చేసి న్యూరాన్లను సేకరించడం ప్రారంభించాము. రీకాంబినేషన్ పూర్తయిన తర్వాత, 4 వారాల వయస్సులో దీనిని Mfn2cKO అని పిలుస్తారు. అంతిమ బిందువుగా, స్పష్టమైన మైటోకాండ్రియల్ శకలాలు ఉన్నప్పటికీ PN పొర చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న 8 వారాల వయస్సును మేము ఎంచుకున్నాము (మూర్తి 1B మరియు మూర్తి S1A). మొత్తం మీద, మేము 3013 ప్రోటీన్‌లను లెక్కించాము, వాటిలో సుమారు 22% మైటోకార్టా 2.0 ఉల్లేఖనాలపై ఆధారపడి ఉన్నాయి, ఇవి మైటోకాండ్రియాగా మైటోకాండ్రియల్ ప్రోటీయోమ్‌పై ఆధారపడి ఉన్నాయి (మూర్తి 1E) (మూర్తి 1E) (24). 8వ వారంలో నిర్వహించిన భేదాత్మక జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణలో, అన్ని ప్రోటీన్‌లలో 10.5% మాత్రమే గణనీయమైన మార్పులను కలిగి ఉన్నాయని తేలింది (మూర్తి 1F మరియు మూర్తి S1F), వాటిలో 195 ప్రోటీన్‌లు డౌన్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయి మరియు 120 ప్రోటీన్‌లు అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయి (మూర్తి 1F). ఈ డేటా సెట్ యొక్క "నూతన మార్గ విశ్లేషణ" ప్రకారం, భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువులు ప్రధానంగా నిర్దిష్ట జీవక్రియ మార్గాల యొక్క పరిమిత సమితికి చెందినవని గమనించడం ముఖ్యం (మూర్తి 1G). ఆసక్తికరంగా, OXPHOS మరియు కాల్షియం సిగ్నలింగ్‌కు సంబంధించిన మార్గాల డౌన్-రెగ్యులేషన్, ఫ్యూజన్-లోపం ఉన్న PNలలో మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని నిర్ధారించినప్పటికీ, ప్రధానంగా అమైనో ఆమ్ల జీవక్రియకు సంబంధించిన ఇతర విభాగాలు గణనీయంగా అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయి, ఇది మైటోకాండ్రియల్ PNలలో జరిగే జీవక్రియకు అనుగుణంగా ఉంది. రీవైరింగ్ స్థిరంగా ఉంది. పనిచేయకపోవడం.
(A) CTRL మరియు Mfn2cKO ఎలుకల సెరెబెల్లార్ విభాగాల ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ ఫోటోగ్రాఫ్‌లు, PNల (కాల్బిండిన్, బూడిద రంగు) క్రమక్షయాన్ని చూపుతున్నాయి; కేంద్రకాలకు DAPIతో కౌంటర్‌స్టెయిన్ చేయబడింది. (B) (A) యొక్క పరిమాణీకరణ (వన్-వే విశ్లేషణ, ***P<0.001; మూడు ఎలుకల నుండి n = 4 నుండి 6 వృత్తాలు). (C) ప్రయోగాత్మక వర్క్‌ఫ్లో. (D) పర్కింజే (పైన) మరియు ఇతర కణ రకాలకు (మధ్యలో) ప్రత్యేకమైన మార్కర్‌ల హీట్ మ్యాప్ పంపిణీ. (E) వర్గీకరించబడిన PNలో గుర్తించబడిన మైటోకాండ్రియల్ ప్రోటీన్‌ల సంఖ్యను చూపే వెన్ రేఖాచిత్రం. (F) 8 వారాల వద్ద Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే ప్రోటీన్‌ల వోల్కానో ప్లాట్ (ప్రాముఖ్యత కట్-ఆఫ్ విలువ 1.3). (G) సృజనాత్మకత మార్గ విశ్లేషణ, 8 వారాలుగా వర్గీకరించబడిన Mfn2cKO PNలో ఐదు అత్యంత ముఖ్యమైన అప్-రెగ్యులేషన్ (ఎరుపు) మరియు డౌన్-రెగ్యులేషన్ (నీలం) మార్గాలను చూపుతుంది. గుర్తించబడిన ప్రతి ప్రోటీన్ యొక్క సగటు వ్యక్తీకరణ స్థాయి చూపబడింది. గ్రేస్కేల్ హీట్ మ్యాప్: సర్దుబాటు చేయబడిన P విలువ. ns, ముఖ్యమైనది కాదు.
ప్రోటీయోమిక్స్ డేటా ప్రకారం కాంప్లెక్స్ I, III, మరియు IV యొక్క ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ క్రమంగా తగ్గింది. కాంప్లెక్స్ I, III, మరియు IV అన్నీ అవసరమైన mtDNA-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన సబ్‌యూనిట్‌లను కలిగి ఉన్నాయి, అయితే కేవలం న్యూక్లియర్-కోడెడ్ అయిన కాంప్లెక్స్ II ప్రాథమికంగా ప్రభావితం కాలేదు (మూర్తి 2A మరియు మూర్తి S2A). ప్రోటీయోమిక్స్ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, సెరెబెల్లార్ కణజాల విభాగాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ PNలోని కాంప్లెక్స్ IV యొక్క MTCO1 (మైటోకాండ్రియల్ సైటోక్రోమ్ C ఆక్సిడేస్ సబ్‌యూనిట్ 1) సబ్‌యూనిట్ స్థాయి క్రమంగా తగ్గిందని చూపించింది (మూర్తి 2B). mtDNA-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన సబ్‌యూనిట్ Mtatp8 గణనీయంగా తగ్గింది (మూర్తి S2A), అయితే న్యూక్లియర్-ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ATP సింథేస్ సబ్‌యూనిట్ యొక్క స్థిర-స్థాయి మారకుండా ఉంది, ఇది mtDNA వ్యక్తీకరణ స్థిరంగా ఉన్నప్పుడు తెలిసిన స్థిరమైన ATP సింథేస్ సబ్‌అసెంబ్లీ F1 కాంప్లెక్స్ ఏర్పడటానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. అంతరాయం (7). రియల్-టైమ్ పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (qPCR) ద్వారా క్రమబద్ధీకరించిన Mfn2cKO PNలలోని mtDNA స్థాయిని మూల్యాంకనం చేయగా, mtDNA కాపీ సంఖ్యలో క్రమంగా తగ్గుదల ఉన్నట్లు నిర్ధారించబడింది. నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, 8 వారాల వయస్సులో, సుమారు 20% mtDNA స్థాయి మాత్రమే నిలుపుకోబడింది (పటం 2C). ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, DNAను గుర్తించడానికి Mfn2cKO PNలకు చేసిన కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ స్టెయినింగ్, మైటోకాన్డ్రియల్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క సమయాధారిత వినియోగాన్ని చూపిస్తుంది (పటం 2D). మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్ క్షీణత మరియు ఒత్తిడి ప్రతిస్పందనలో పాల్గొనే కొన్ని అభ్యర్థులు మాత్రమే అప్-రెగ్యులేట్ అయినట్లు మేము కనుగొన్నాము, వాటిలో Lonp1, Afg3l2 మరియు Clpx, మరియు OXPHOS కాంప్లెక్స్ అసెంబ్లీ కారకాలు ఉన్నాయి. అపోప్టోసిస్‌లో పాల్గొనే ప్రోటీన్ల స్థాయిలలో ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులు గుర్తించబడలేదు (పటం S2B). అదేవిధంగా, కాల్షియం రవాణాలో పాల్గొనే మైటోకాన్డ్రియా మరియు ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్ ఛానెల్‌లలో స్వల్ప మార్పులు మాత్రమే ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (పటం S2C). అదనంగా, ఆటోఫాజీ-సంబంధిత ప్రోటీన్ల మూల్యాంకనంలో ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు, ఇది ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ మరియు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా ఇన్ వివోలో గమనించిన ఆటోఫాగోసోమ్‌ల యొక్క దృశ్యమాన ప్రేరణకు అనుగుణంగా ఉంది (చిత్రం S3). అయితే, PNsలో క్రమంగా పెరుగుతున్న OXPHOS పనిచేయకపోవడం స్పష్టమైన అల్ట్రాస్ట్రక్చరల్ మైటోకాండ్రియల్ మార్పులతో కూడి ఉంటుంది. 5 మరియు 8 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO PNs యొక్క కణ దేహాలు మరియు డెండ్రిటిక్ ట్రీలలో మైటోకాండ్రియల్ సమూహాలను చూడవచ్చు, మరియు లోపలి పొర నిర్మాణం తీవ్రమైన మార్పులకు గురైంది (చిత్రం S4, A మరియు B). ఈ అల్ట్రాస్ట్రక్చరల్ మార్పులు మరియు mtDNAలో గణనీయమైన తగ్గుదలకు అనుగుణంగా, టెట్రామెథైల్‌రోడామైన్ మిథైల్ ఎస్టర్ (TMRM)తో చేసిన అక్యూట్ సెరెబ్రల్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌ల విశ్లేషణలో Mfn2cKO PNsలో మైటోకాండ్రియల్ పొర పొటెన్షియల్ గణనీయంగా తగ్గిందని తేలింది (చిత్రం S4C).
(A) OXPHOS కాంప్లెక్స్ యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయి యొక్క కాలక్రమేణా విశ్లేషణ. 8 వారాల వద్ద P<0.05 ఉన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే పరిగణించండి (టూ-వే ANOVA). చుక్కల గీత: CTRLతో పోలిస్తే ఎటువంటి సర్దుబాటు లేదు. (B) ఎడమవైపు: యాంటీ-MTCO1 యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ విభాగానికి ఒక ఉదాహరణ (స్కేల్ బార్, 20 μm). పర్కింజే కణ దేహాలు ఆక్రమించిన ప్రాంతం పసుపు రంగుతో కప్పబడి ఉంది. కుడివైపు: MTCO1 స్థాయిల పరిమాణీకరణ (వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్; మూడు ఎలుకల నుండి విశ్లేషించబడిన n = 7 నుండి 20 కణాలు). (C) క్రమబద్ధీకరించబడిన PNలో mtDNA కాపీ సంఖ్య యొక్క qPCR విశ్లేషణ (వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్; n = 3 నుండి 7 ఎలుకలు). (D) ఎడమవైపు: యాంటీ-DNA యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌కు ఒక ఉదాహరణ (స్కేల్ బార్, 20 μm). పర్కింజే కణ దేహాలు ఆక్రమించిన ప్రాంతం పసుపు రంగుతో కప్పబడి ఉంది. కుడివైపు: mtDNA గాయాల పరిమాణీకరణ (ఏకదిశ విశ్లేషణ; మూడు ఎలుకల నుండి n = 5 నుండి 9 కణాలు). (E) హోల్-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లో మైటోవైఎఫ్‌పి + పర్కింజే కణాలను (బాణం) చూపిస్తున్న ఒక తీవ్రమైన సెరెబెల్లార్ విభాగానికి ఉదాహరణ. (F) IV వక్రరేఖ యొక్క పరిమాణీకరణ. (G) CTRL మరియు Mfn2cKO పర్కింజే కణాలలో డిపోలరైజింగ్ కరెంట్ ఇంజెక్షన్ యొక్క ప్రతినిధి రికార్డింగ్‌లు. పై ట్రేస్: APని ప్రేరేపించిన మొదటి పల్స్. కింది ట్రేస్: గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీ. (H) పోస్ట్‌సినాప్టిక్ ఆకస్మిక ఇన్‌పుట్‌ల (sPSPలు) పరిమాణీకరణ. ప్రతినిధి రికార్డింగ్ ట్రేస్ మరియు దాని జూమ్ నిష్పత్తి (I)లో చూపబడ్డాయి. ఏకదిశ విశ్లేషణ మూడు ఎలుకల నుండి n = 5 నుండి 20 కణాలను విశ్లేషించింది. డేటా సగటు±SEMగా వ్యక్తీకరించబడింది; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) పెర్ఫోరేటెడ్ ప్యాచ్ క్లాంప్ మోడ్‌ను ఉపయోగించి రికార్డ్ చేయబడిన ఆకస్మిక AP యొక్క ప్రతినిధి ట్రేస్‌లు. పై ట్రేస్: గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీ. కింది ట్రేస్: ఒకే AP యొక్క జూమ్. (K) (J) ప్రకారం సగటు మరియు గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీని లెక్కించండి. మాన్-విట్నీ పరీక్ష; నాలుగు ఎలుకల నుండి n = 5 కణాలను విశ్లేషించారు. డేటా సగటు±SEM గా వ్యక్తీకరించబడింది; ఇది ముఖ్యం కాదు.
8 వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO PNలో స్పష్టమైన OXPHOS నష్టం కనుగొనబడింది, ఇది న్యూరాన్‌ల శారీరక పనితీరు తీవ్రంగా అసాధారణంగా ఉందని సూచిస్తుంది. అందువల్ల, మేము 4 నుండి 5 వారాలు మరియు 7 నుండి 8 వారాల వయస్సులో OXPHOS-లోపం ఉన్న న్యూరాన్‌ల నిష్క్రియాత్మక విద్యుత్ లక్షణాలను, అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లలో హోల్-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లను నిర్వహించడం ద్వారా విశ్లేషించాము (చిత్రం 2E). ఊహించని విధంగా, Mfn2cKO న్యూరాన్‌ల సగటు విశ్రాంతి పొర పొటెన్షియల్ మరియు ఇన్‌పుట్ రెసిస్టెన్స్ నియంత్రణ సమూహంతో సమానంగా ఉన్నాయి, అయినప్పటికీ కణాల మధ్య సూక్ష్మమైన తేడాలు ఉన్నాయి (పట్టిక 1). అదేవిధంగా, 4 నుండి 5 వారాల వయస్సులో, కరెంట్-వోల్టేజ్ సంబంధంలో (IV కర్వ్) ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు (చిత్రం 2F). అయితే, 7 నుండి 8 వారాల వయస్సు గల ఏ Mfn2cKO న్యూరాన్‌లు కూడా IV విధానాన్ని (హైపర్‌పోలరైజేషన్ దశ) తట్టుకోలేకపోయాయి, ఇది ఈ చివరి దశలో హైపర్‌పోలరైజేషన్ పొటెన్షియల్‌కు స్పష్టమైన సున్నితత్వం ఉందని సూచిస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో, పునరావృత యాక్షన్ పొటెన్షియల్ (AP) డిశ్చార్జ్‌లకు కారణమయ్యే డీపోలరైజింగ్ కరెంట్‌లు బాగా తట్టుకోబడతాయి, ఇది వాటి మొత్తం డిశ్చార్జ్ నమూనాలు 8 వారాల వయస్సు గల కంట్రోల్ న్యూరాన్‌ల నమూనాల నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా లేవని సూచిస్తుంది (పట్టిక 1 మరియు చిత్రం 2G). అదేవిధంగా, ఆకస్మిక పోస్ట్‌సినాప్టిక్ కరెంట్‌ల (sPSCs) ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు ఆంప్లిట్యూడ్ కంట్రోల్ గ్రూప్‌తో పోల్చదగినవిగా ఉన్నాయి, మరియు సంఘటనల ఫ్రీక్వెన్సీ 4 వారాల నుండి 5 వారాలకు, 7 వారాలకు, 8 వారాలకు ఒకే విధమైన పెరుగుదలతో పెరిగింది (చిత్రం 2, H మరియు I). PNsలో సినాప్టిక్ పరిపక్వత కాలం (25). చిల్లులు గల PNs ప్యాచ్‌ల తర్వాత కూడా ఇలాంటి ఫలితాలే వచ్చాయి. ఈ కాన్ఫిగరేషన్, హోల్-సెల్ ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్‌లో జరగగల సెల్యులార్ ATP లోపాల యొక్క సాధ్యమయ్యే పరిహారాన్ని నిరోధిస్తుంది. ప్రత్యేకించి, Mfn2cKO న్యూరాన్‌ల యొక్క విశ్రాంతి పొర పొటెన్షియల్ మరియు ఆకస్మిక ఫైరింగ్ ఫ్రీక్వెన్సీ ప్రభావితం కాలేదు (చిత్రం 2, J మరియు K). సారాంశంలో, ఈ ఫలితాలు స్పష్టమైన OXPHOS లోపం ఉన్న PNలు అధిక-ఫ్రీక్వెన్సీ డిశ్చార్జ్ నమూనాలను బాగా తట్టుకోగలవని సూచిస్తున్నాయి, ఇది దాదాపు సాధారణ ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ ప్రతిస్పందనలను కొనసాగించడానికి వీలు కల్పించే ఒక పరిహార యంత్రాంగం ఉందని తెలియజేస్తుంది.
డేటాను మీన్ ± SEM (వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్, హోల్మ్-సిడాక్ మల్టిపుల్ కంపారిజన్ టెస్ట్; *P<0.05) గా వ్యక్తీకరించారు. యూనిట్ సంఖ్యను బ్రాకెట్లలో సూచించారు.
ప్రోటీయోమిక్స్ డేటాసెట్‌లోని (చిత్రం 1G) ఏదైనా వర్గం తీవ్రమైన OXPHOS లోపాన్ని ఎదుర్కోగల మార్గాలను కలిగి ఉందో లేదో పరిశోధించడానికి మేము బయలుదేరాము, తద్వారా ప్రభావితమైన PN దాదాపు సాధారణ ఎలక్ట్రోఫిజియాలజీని (చిత్రం 2, E నుండి K) ఎందుకు నిర్వహించగలదో వివరిస్తుంది. ప్రోటీయోమిక్స్ విశ్లేషణలో బ్రాంచెడ్ చైన్ అమైనో ఆమ్లాల (BCAA) విచ్ఛిన్నంలో పాల్గొన్న ఎంజైమ్‌లు గణనీయంగా అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయని (చిత్రం 3A మరియు చిత్రం S5A) మరియు తుది ఉత్పత్తి ఎసిటైల్-CoA (CoA) లేదా సక్సినిల్ CoA ఆర్టీరియోస్క్లెరోసిస్ యాసిడ్ (TCA) చక్రంలో ట్రైకార్బాక్సిలేట్‌లను భర్తీ చేయగలవని చూపించింది. BCAA ట్రాన్సామినేస్ 1 (BCAT1) మరియు BCAT2 రెండింటి పరిమాణం పెరిగిందని మేము కనుగొన్నాము. అవి α-కీటోగ్లుటారేట్ (26) నుండి గ్లుటామేట్‌ను ఉత్పత్తి చేయడం ద్వారా BCAA విచ్ఛిన్నం యొక్క మొదటి దశను ఉత్ప్రేరకపరిచాయి. బ్రాంచెడ్ చైన్ కీటో యాసిడ్ డీహైడ్రోజినేస్ (BCKD) కాంప్లెక్స్‌ను తయారుచేసే అన్ని సబ్‌యూనిట్‌లు అప్‌రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయి (ఈ కాంప్లెక్స్, ఫలితంగా ఏర్పడిన BCAA కార్బన్ స్కెలిటన్ యొక్క తదుపరి మరియు కోలుకోలేని డీకార్బాక్సిలేషన్‌ను ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది) (చిత్రం 3A మరియు చిత్రం S5A). అయితే, క్రమబద్ధీకరించిన PNలో BCAAలోనే ఎటువంటి స్పష్టమైన మార్పులు కనుగొనబడలేదు, దీనికి కారణం ఈ ఆవశ్యక అమైనో ఆమ్లాలను కణాలు ఎక్కువగా గ్రహించడం లేదా TCA చక్రాన్ని భర్తీ చేయడానికి ఇతర వనరులను (గ్లూకోజ్ లేదా లాక్టిక్ యాసిడ్) ఉపయోగించడం కావచ్చు (చిత్రం S5B). OXPHOS లేని PNలు 8 వారాల వయస్సులో గ్లూటమైన్ విచ్ఛిన్నం మరియు ట్రాన్స్‌అమినేషన్ కార్యకలాపాలు పెరిగినట్లు కూడా చూపించాయి, ఇది మైటోకాండ్రియల్ ఎంజైమ్‌లైన గ్లూటమినేస్ (GLS) మరియు గ్లూటమైన్ పైరువేట్ ట్రాన్స్‌అమినేస్ 2 (GPT2) యొక్క అప్‌-రెగ్యులేషన్ ద్వారా ప్రతిబింబిస్తుంది (చిత్రం 3, A మరియు C). GLS యొక్క అప్-రెగ్యులేషన్ స్ప్లైస్డ్ ఐసోఫార్మ్ గ్లుటామినేస్ C (GLS-GAC) కి మాత్రమే పరిమితం అని గమనించడం ముఖ్యం (Mfn2cKO/CTRL యొక్క మార్పు సుమారుగా 4.5 రెట్లు, P = 0.05), మరియు క్యాన్సర్ కణజాలాలలో దాని నిర్దిష్ట అప్-రెగ్యులేషన్ మైటోకాండ్రియల్ బయోఎనర్జీకి మద్దతు ఇస్తుంది. (27).
(A) హీట్ మ్యాప్ 8 వారాల వద్ద నిర్దిష్ట మార్గం కోసం ప్రోటీన్ స్థాయిలో రెట్లు మార్పును చూపుతుంది. (B) యాంటీ-PCx యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ స్లైస్ యొక్క ఉదాహరణ (స్కేల్ బార్, 20 μm). పసుపు బాణం పర్కింజే కణ దేహాన్ని సూచిస్తుంది. (C) అథెరోస్క్లెరోసిస్‌కు ముఖ్యమైన అభ్యర్థిగా గుర్తించబడిన టైమ్ కోర్స్ ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ (మల్టిపుల్ t-టెస్ట్, *FDR <5%; n = 3-5 ఎలుకలు). (D) పైన: [1-13C]పైరువేట్ ట్రేసర్‌లో ఉన్న లేబుల్ చేయబడిన కార్బన్ ప్రవేశించే వివిధ మార్గాలను (అంటే, PDH లేదా ట్రాన్స్-ఆర్టీరియల్ మార్గం ద్వారా) చూపే ఒక స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. కింద: వయోలిన్ చార్ట్ [1-13C]పైరువేట్‌తో అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లను లేబుల్ చేసిన తర్వాత ఆస్పార్టిక్ ఆమ్లం, సిట్రిక్ ఆమ్లం మరియు మాలిక్ ఆమ్లంగా మార్చబడిన సింగిల్-లేబుల్డ్ కార్బన్ (M1) శాతాన్ని చూపుతుంది (పెయిర్డ్ t-టెస్ట్; ** P <0.01). (E) సూచించిన మార్గం యొక్క సమగ్ర టైమ్ హిస్టరీ విశ్లేషణ. 8 వారాల వద్ద P<0.05 ఉన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే పరిగణించండి. చుక్కల గీత: సర్దుబాటు విలువ లేదు (రెండు-మార్గాల విశ్లేషణ; * P <0.05; *** P <0.001). డేటా సగటు±SEM గా వ్యక్తీకరించబడింది.
మా విశ్లేషణలో, BCAA విచ్ఛిన్నం కీలకమైన అప్-రెగ్యులేషన్ మార్గాలలో ఒకటిగా మారింది. ఈ వాస్తవం, OXPHOS లేని PNలో TCA చక్రంలోకి ప్రవేశించే వెంటిలేషన్ పరిమాణం మారవచ్చని గట్టిగా సూచిస్తుంది. ఇది న్యూరోనల్ మెటబాలిక్ రీవైరింగ్ యొక్క ఒక ప్రధాన రూపాన్ని సూచిస్తుంది, ఇది తీవ్రమైన OXPHOS పనిచేయకపోవడాన్ని నిర్వహించే సమయంలో న్యూరోనల్ ఫిజియాలజీ మరియు మనుగడపై ప్రత్యక్ష ప్రభావాన్ని కలిగి ఉండవచ్చు. ఈ పరికల్పనకు అనుగుణంగా, ప్రధాన యాంటీ-అథెరోస్క్లెరోటిక్ ఎంజైమ్ PCx అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడిందని మేము కనుగొన్నాము (Mfn2cKO/CTRL సుమారు 1.5 రెట్లు మారుతుంది; చిత్రం 3A), ఇది పైరువేట్‌ను ఆక్సలోఅసిటేట్‌గా మార్చడాన్ని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది (28), దీని వ్యక్తీకరణ మెదడు కణజాలంలోని ఆస్ట్రోసైట్‌లకు మాత్రమే పరిమితం అని నమ్ముతారు (29, 30). ప్రోటీయోమిక్స్ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలలో PCx వ్యక్తీకరణ ప్రత్యేకంగా మరియు గణనీయంగా పెరిగిందని, అయితే నియంత్రణ సమూహంలో PCx ప్రతిచర్య ప్రధానంగా ప్రక్కనే ఉన్న బెర్గ్‌మాన్ గ్లియల్ కణాలకు మాత్రమే పరిమితమైందని చూపించింది (పటం 3B). గమనించిన PCx యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్‌ను క్రియాత్మకంగా పరీక్షించడానికి, మేము అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లను [1-13C]పైరువేట్ ట్రేసర్‌తో ట్రీట్ చేశాము. పైరువేట్, పైరువేట్ డీహైడ్రోజినేస్ (PDH) ద్వారా ఆక్సీకరణం చెందినప్పుడు, దాని ఐసోటోప్ లేబుల్ అదృశ్యమైంది, కానీ వాస్కులర్ ప్రతిచర్యల ద్వారా పైరువేట్ జీవక్రియ చెందినప్పుడు అది TCA సైకిల్ ఇంటర్మీడియేట్స్‌లో చేర్చబడుతుంది (పటం 3D). మా ప్రోటీయోమిక్స్ డేటాకు మద్దతుగా, మేము Mfn2cKO స్లైస్‌ల యొక్క ఆస్పార్టిక్ ఆమ్లంలో ఈ ట్రేసర్ నుండి పెద్ద సంఖ్యలో మార్కర్‌లను గమనించాము, అయితే సిట్రిక్ ఆమ్లం మరియు మాలిక్ ఆమ్లం కూడా గణనీయమైనది కానప్పటికీ, ఒక మోస్తరు ధోరణిని కలిగి ఉన్నాయి (పటం 3D).
మైటోపార్క్ ఎలుకల డోపమైన్ న్యూరాన్లలో, ప్రత్యేకంగా మైటోకాండ్రియల్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ A జన్యువు (Tfam)ను నాశనం చేయడం వల్ల కలిగే మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో (చిత్రం S6B), PCx వ్యక్తీకరణ కూడా గణనీయంగా పెరిగింది (31), ఇది శరీరంలో న్యూరోనల్ OXPHOS పనిచేయకపోవడం వల్ల అసిటోన్ యాసిడ్ ఆర్టీరియోస్క్లెరోసిస్ వ్యాధి సంభవించడం నియంత్రించబడుతుందని సూచిస్తుంది. ఆర్టీరియోస్క్లెరోసిస్‌తో సంబంధం కలిగి ఉండే న్యూరాన్లలో వ్యక్తీకరించబడే ప్రత్యేక ఎంజైమ్‌లు (32-34), OXPHOS లేని PNsలో గణనీయంగా పెరిగాయని కనుగొనబడింది, అవి ప్రొపియోనిల్-CoA కార్బాక్సిలేస్ (PCC-A), మలోనైల్-CoAను సక్సినిల్-CoAగా మార్చేది మరియు మైటోకాండ్రియల్ మాలిక్ ఎంజైమ్ 3 (ME3), దీని ప్రధాన పాత్ర మాలేట్ నుండి పైరువేట్‌ను పునరుద్ధరించడం (చిత్రం 3, A మరియు C) (33, 35). అదనంగా, PDH (36) ను ఫాస్ఫోరైలేట్ చేసి, తద్వారా నిష్క్రియం చేసే Pdk3 ఎంజైమ్‌లో గణనీయమైన పెరుగుదలను మేము కనుగొన్నాము, అయితే PDH ను సక్రియం చేసే Pdp1 ఎంజైమ్‌లో లేదా PDH ఎంజైమ్ కాంప్లెక్స్‌లో ఎటువంటి మార్పులు కనుగొనబడలేదు (చిత్రం 3A). స్థిరంగా, Mern2cKO PNs లో, Ser293 వద్ద PDH కాంప్లెక్స్ యొక్క పైరువేట్ డీహైడ్రోజినేస్ E1 భాగం యొక్క α1 సబ్‌యూనిట్ α (PDHE1α) యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్ (PDH యొక్క ఎంజైమ్ కార్యాచరణను నిరోధిస్తుందని తెలిసినది) పెరిగింది (చిత్రం S6C). పైరువేట్‌కు వాస్కులర్ యాక్సెస్ లేదు.
చివరగా, నివేదికల ప్రకారం, యాక్టివేషన్ ప్రక్రియలో సెరైన్ మరియు గ్లైసిన్ బయోసింథసిస్ యొక్క సూపర్ పాత్‌వే, సంబంధిత మైటోకాండ్రియల్ ఫోలేట్ (1C) సైకిల్ మరియు ప్రోలిన్ బయోసింథసిస్ (మూర్తి 1G మరియు మూర్తి S5C) అన్నీ గణనీయంగా అప్-రెగ్యులేట్ చేయబడ్డాయని మేము కనుగొన్నాము. మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో చుట్టుపక్కల కణజాలాలు యాక్టివేట్ చేయబడతాయి (5-7). ఈ ప్రోటీయోమిక్స్ డేటాకు మద్దతు ఇచ్చే కాన్ఫోకల్ విశ్లేషణలో, OXPHOS లోపించిన PNలో, 8 వారాల వయస్సు గల ఎలుకల సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లు మైటోకాండ్రియల్ ఫోలేట్ సైకిల్‌లోని కీలక ఎంజైమ్ అయిన సెరైన్ హైడ్రాక్సిమిథైల్‌ట్రాన్స్‌ఫెరేస్ 2 (SHMT2)కు గురయ్యాయని చూపించింది. గణనీయమైన రోగనిరోధక ప్రతిస్పందన (మూర్తి S5D). 13 CU-గ్లూకోజ్‌తో ఇంక్యుబేట్ చేయబడిన అక్యూట్ సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లలో, మెటబాలిక్ ట్రేసింగ్ ప్రయోగాలు సెరైన్ మరియు ప్రోలిన్ బయోసింథసిస్ యొక్క అప్-రెగ్యులేషన్‌ను మరింతగా నిర్ధారించాయి, ఇది సెరైన్ మరియు ప్రోలిన్‌లోకి కార్బన్ ఐసోఫామ్‌ల ప్రవాహం పెరిగిందని సూచిస్తుంది (మూర్తి S5E). GLS మరియు GPT2 ద్వారా ప్రోత్సహించబడిన ప్రతిచర్యలు గ్లుటామిన్ నుండి గ్లుటామేట్ సంశ్లేషణకు మరియు గ్లుటామేట్ మరియు α-కీటోగ్లుటారేట్ మధ్య ట్రాన్సామినేషన్‌కు బాధ్యత వహిస్తాయి కాబట్టి, వాటి అప్‌రెగ్యులేషన్ OXPHOS-లోపం ఉన్న న్యూరాన్‌లకు గ్లుటామేట్ కోసం పెరిగిన డిమాండ్ ఉందని సూచిస్తుంది, ఇది ప్రోలిన్ యొక్క పెరిగిన బయోసింథసిస్‌ను నిర్వహించడానికి ఉద్దేశించబడవచ్చు (చిత్రం S5C). ఈ మార్పులకు విరుద్ధంగా, PN-నిర్దిష్ట Mfn2cKO ఎలుకల నుండి సెరెబెల్లార్ ఆస్ట్రోసైట్‌ల ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణలో ఈ మార్గాలు (అన్ని యాంటీపెరాక్సిడేస్‌లతో సహా) వ్యక్తీకరణలో గణనీయంగా మారలేదని తేలింది, తద్వారా ఈ జీవక్రియ మళ్లింపు క్షీణించిన PNకి మాత్రమే ఎంపిక చేయబడిందని నిరూపించబడింది (చిత్రం S6, D నుండి G).
సారాంశంలో, ఈ విశ్లేషణలు PNలలో నిర్దిష్ట జీవక్రియ మార్గాల తాత్కాలిక క్రియాశీలత యొక్క గణనీయంగా విభిన్నమైన నమూనాలను వెల్లడించాయి. అసాధారణ న్యూరోనల్ మైటోకాండ్రియల్ పనితీరు ప్రారంభ అథెరోస్క్లెరోసిస్ మరియు 1C పునర్నిర్మాణానికి (చిత్రం 3E మరియు చిత్రం S5C), మరియు I మరియు IV కాంప్లెక్స్‌ల వ్యక్తీకరణలో ఊహించదగిన మార్పులకు కూడా దారితీసినప్పటికీ, సెరైన్ డి నోవో సంశ్లేషణలోని మార్పులు చివరి దశలలో మాత్రమే స్పష్టమయ్యాయి. OXPHOS పనిచేయకపోవడం (చిత్రం 3E మరియు చిత్రం S5C). ఈ ఫలితాలు ఒక క్రమబద్ధమైన ప్రక్రియను నిర్వచిస్తాయి, దీనిలో ఒత్తిడి-ప్రేరిత మైటోకాండ్రియల్ (1C చక్రం) మరియు సైటోప్లాస్మిక్ (సెరైన్ బయోసింథసిస్) ప్రతిస్పందన, TCA చక్రంలో అథెరోస్క్లెరోసిస్ పెరుగుదలతో సినర్జిస్టిక్‌గా పనిచేసి న్యూరోనల్ జీవక్రియను పునర్నిర్మిస్తాయి.
8 వారాల వయస్సు గల OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలు అధిక-ఫ్రీక్వెన్సీ ఉత్తేజిత కార్యాచరణను కొనసాగించగలవు మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని భర్తీ చేయడానికి గణనీయమైన జీవక్రియ పునఃసంబంధానికి లోనవుతాయి. ఈ ఆవిష్కరణ ఒక ఆసక్తికరమైన అవకాశాన్ని లేవనెత్తుతుంది, అదేమిటంటే, ఈ దశలో కూడా, ఈ కణాలు న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను ఆలస్యం చేయడానికి లేదా నిరోధించడానికి చికిత్సా జోక్యాన్ని పొందవచ్చు. మేము రెండు స్వతంత్ర జోక్యాల ద్వారా ఈ అవకాశాన్ని పరిష్కరించాము. మొదటి పద్ధతిలో, మేము క్రీ-ఆధారిత అడెనో-అసోసియేటెడ్ వైరస్ (AAV) వెక్టర్‌ను రూపొందించాము, తద్వారా MFN2ను వివోలో OXPHOS-లోపం ఉన్న PNలలో ఎంపికగా వ్యక్తీకరించవచ్చు (చిత్రం S7A). MFN2 మరియు ఫ్లోరోసెంట్ రిపోర్టర్ జన్యువు mCherry (Mfn2-AAV)ను ఎన్‌కోడ్ చేసే AAVను ఇన్ విట్రోలో ప్రాథమిక న్యూరాన్ కల్చర్‌లలో ధృవీకరించాము, ఇది MFN2ను క్రీ-ఆధారిత పద్ధతిలో వ్యక్తీకరించడానికి కారణమైంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ స్వరూపాన్ని పునరుద్ధరించింది, తద్వారా Mfn2cKO న్యూరాన్‌లలో న్యూరోమ్యుటేషన్‌ను నిరోధించింది (చిత్రం S7, B, D మరియు E). తరువాత, మేము 8 వారాల వయస్సు గల Mfn2-AAV ను Mfn2cKO మరియు నియంత్రణ ఎలుకల సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్‌కు స్టీరియోటాక్టిక్‌గా అందించడానికి ఇన్ వివో ప్రయోగాలు నిర్వహించాము మరియు 12 వారాల వయస్సు గల ఎలుకలను విశ్లేషించాము (మూర్తి 4A). చికిత్స పొందిన Mfn2cKO ఎలుకలు మరణించాయి (మూర్తి 1, A మరియు B) (16). ఇన్ వివోలో వైరల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ కొన్ని సెరెబెల్లార్ వలయాలలో PN యొక్క ఎంపిక చేసిన వ్యక్తీకరణకు దారితీసింది (మూర్తి S7, G మరియు H). కేవలం mCherry (Ctrl-AAV) ను మాత్రమే వ్యక్తీకరించే నియంత్రణ AAV యొక్క ఇంజెక్షన్ Mfn2cKO జంతువులలో న్యూరోడిజెనరేషన్ స్థాయిపై ఎటువంటి ముఖ్యమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు. దీనికి విరుద్ధంగా, Mfn2-AAV తో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన Mfn2cKO ల విశ్లేషణ PN కణ పొర యొక్క ముఖ్యమైన రక్షణాత్మక ప్రభావాన్ని చూపింది (మూర్తి 4, B మరియు C). ముఖ్యంగా, న్యూరాన్ సాంద్రత నియంత్రణ జంతువుల నుండి దాదాపుగా గుర్తించలేనిదిగా కనిపిస్తుంది (మూర్తి 4, B మరియు C, మరియు మూర్తి S7, H మరియు I). న్యూరోనల్ మరణాన్ని నివారించడంలో MFN1 వ్యక్తీకరణ, MFN2 వ్యక్తీకరణ కానంతగా సమానంగా ప్రభావవంతంగా ఉంది (పటం 4C మరియు పటం S7, C మరియు F), ఇది ఎక్టోపిక్ MFN1 వ్యక్తీకరణ MFN2 లోపాన్ని సమర్థవంతంగా భర్తీ చేయగలదని సూచిస్తుంది. ఒక్కో PN స్థాయిలో చేసిన తదుపరి విశ్లేషణలో, Mfn2-AAV మైటోకాండ్రియా యొక్క అల్ట్రాస్ట్రక్చర్‌ను చాలా వరకు పునరుద్ధరించిందని, mtDNA స్థాయిలను సాధారణ స్థితికి తెచ్చిందని, మరియు యాంటీ-యాంజియోజెనిసిస్ మార్కర్ PCx యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను తిప్పికొట్టిందని తేలింది (పటం 4, C నుండి E). పునరుద్ధరించబడిన Mfn2cKO ఎలుకలను విశ్రాంతి స్థితిలో దృశ్యమానంగా పరిశీలించినప్పుడు, వాటి భంగిమ మరియు మోటార్ లక్షణాలు (కదలిక S1 నుండి S3) మెరుగుపడ్డాయని గమనించబడింది. ముగింపుగా, ఈ ప్రయోగాలు ఏమి చూపిస్తున్నాయంటే, OXPHOS తీవ్రంగా లోపించిన PNలలోకి MFN2ను ఆలస్యంగా తిరిగి ప్రవేశపెట్టడం అనేది mtDNA వినియోగాన్ని తిప్పికొట్టడానికి మరియు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి సరిపోతుంది, తద్వారా ఇన్ వివోలో ఆక్సాన్ క్షీణత మరియు న్యూరోనల్ మరణాన్ని నివారిస్తుంది.
(A) సూచించిన జీవక్రియ మార్గం ఉత్తేజితమైనప్పుడు MFN2ను ఎన్‌కోడ్ చేసే AAVను ఇంజెక్ట్ చేయడానికి ప్రయోగాత్మక షెడ్యూల్‌ను చూపించే ఒక పథకం. (B) 8 వారాల వయస్సులో Mfn2cKO ఎలుకల ద్వారా ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడి, యాంటీ-కాల్బిండిన్ యాంటీబాడీతో లేబుల్ చేయబడిన 12 వారాల వయస్సు గల సెరెబెల్లార్ విభాగాల యొక్క ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ ఫోటోగ్రాఫ్‌లు. కుడివైపు: ఆక్సాన్ ఫైబర్‌ల స్కేలింగ్. ఆక్సాన్ జూమ్ యొక్క స్కేల్ 450 మరియు 75 μm. (C) ఎడమవైపు: AAV ట్రాన్స్‌డక్షన్ లూప్ (AAV+)లో పర్కింజే కణ సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్; n = 3 ఎలుకలు). కుడివైపు: 12వ వారంలో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన PNలో mtDNA ఫోకస్ విశ్లేషణ (అన్‌పెయిర్డ్ t-టెస్ట్; మూడు ఎలుకల నుండి n = 6 కణాలు). * P <0.05; ** P <0.01. (D) సూచించిన వైరల్ వెక్టర్స్‌తో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన Mfn2cKO సెరెబెల్లార్ విభాగాల యొక్క PNల ప్రతినిధి ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు. గులాబీ రంగు మాస్క్ డెండ్రైట్‌లు ఆక్రమించిన ప్రాంతాన్ని సూచిస్తుంది, మరియు పసుపు చుక్కల చతురస్రం కుడి వైపున అందించిన జూమ్‌ను సూచిస్తుంది; n కేంద్రకాన్ని సూచిస్తుంది. స్కేల్ బార్, 1μm. (E) 12 వారాల వద్ద ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన PNలో PCx స్టెయినింగ్ యొక్క ఉదాహరణను చూపుతుంది. స్కేల్ బార్, 20μm. OE, ఓవర్‌ఎక్స్‌ప్రెషన్; FC, ఫోల్డ్ చేంజ్.
చివరగా, OXPHOS పనిచేయకపోవడాన్ని ఎదుర్కొన్న PNలలో పెరాక్సిడేస్-ప్రేరిత కణ మనుగడ యొక్క ప్రాముఖ్యతను మేము పరిశోధించాము. మేము ప్రత్యేకంగా మౌస్ PCx mRNA (AAV-shPCx)ను లక్ష్యంగా చేసుకుని, mCherryను ఎన్‌కోడ్ చేసే AAV-shRNAను ఉత్పత్తి చేసి, ఆ వైరస్‌ను లేదా దాని స్క్రాంబుల్డ్ కంట్రోల్ (AAV-scr)ను Mfn2cKO ఎలుకల సెరెబెల్లమ్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేశాము. PCx వ్యక్తీకరణ పెరిగిన (పటం 3C) మరియు PN కణ పొర చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న (పటం 1A) కాలంలో సమర్థవంతమైన PCx నాక్‌డౌన్‌ను సాధించడానికి, ఈ ఇంజెక్షన్‌ను నాలుగవ వారం వయస్సులో (పటం 5A) నిర్వహించారు. PCxను నాక్‌డౌన్ చేయడం (పటం S8A) PN మరణాన్ని గణనీయంగా వేగవంతం చేస్తుందని, ఇది సంక్రమణ యొక్క ఏకైక పరిమిత వలయం (పటం 5, B మరియు C) అని గమనించడం ముఖ్యం. PCx అప్-రెగ్యులేషన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన జీవక్రియ ప్రభావాల యంత్రాంగాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి, గ్లూటాథియోన్ పెప్టైడ్ రెడాక్స్ పొటెన్షియల్ (38) యొక్క సాపేక్ష మార్పును అంచనా వేయడానికి, PCx నాక్‌డౌన్ మరియు AAV-మధ్యవర్తిత్వ ఆప్టికల్ బయోసెన్సార్ Grx1-roGFP2 ఏకకాలంలో వ్యక్తీకరించబడిన తర్వాత PNల రెడాక్స్ స్థితిని మేము అధ్యయనం చేసాము (మూర్తి S8, B నుండి D). తరువాత, FLIM పరిస్థితులను ధృవీకరించిన తర్వాత సైటోప్లాస్మిక్ రెడాక్స్ స్థితిలో సంభావ్య మార్పులను గుర్తించడానికి, 7-వారాల వయస్సు గల Mfn2cKO లేదా నియంత్రణ లిటర్‌మేట్స్ యొక్క అక్యూట్ బ్రెయిన్ స్లైస్‌లలో మేము టూ-ఫోటాన్ ఫ్లోరోసెన్స్ లైఫ్‌టైమ్ ఇమేజింగ్ మైక్రోస్కోపీ (FLIM)ని నిర్వహించాము (మూర్తి S8, E నుండి G). ఈ విశ్లేషణలో, PCx వ్యక్తీకరణ లేని ఒకే Mfn2cKO PNల ఆక్సీకరణ స్థితిలో గణనీయమైన పెరుగుదల కనిపించింది, ఇది నియంత్రణ న్యూరాన్‌లు లేదా స్క్ర్యాంబుల్డ్ shRNAను మాత్రమే వ్యక్తీకరించే Mfn2cKO PNల నుండి భిన్నంగా ఉంది (మూర్తి 5, D మరియు E). PCx వ్యక్తీకరణను తగ్గించినప్పుడు, అధిక ఆక్సీకరణ స్థితిని చూపే Mfn2cKO PNల శాతం మూడు రెట్ల కంటే ఎక్కువగా పెరిగింది (పటం 5E), ఇది PCx నియంత్రణ క్షీణించిన న్యూరాన్‌ల రెడాక్స్ సామర్థ్యాన్ని కాపాడుతుందని సూచిస్తుంది.
(A) సూచించిన జీవక్రియ మార్గం ఉత్తేజితమైనప్పుడు shPCxను ఎన్‌కోడ్ చేసే AAVను ఇంజెక్ట్ చేయడానికి ప్రయోగాత్మక షెడ్యూల్‌ను చూపించే ఒక పథకం. (B) 4 వారాల వయస్సులో యాంటీ-కాల్సిన్యూరిన్ యాంటీబాడీతో ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడి, లేబుల్ చేయబడిన Mfn2cKO ఎలుకలలోని 8 వారాల వయస్సు గల సెరెబెల్లార్ విభాగాల ప్రతినిధి కాన్ఫోకల్ ఫోటోగ్రాఫ్‌లు. స్కేల్ బార్, 450μm. (C) AAV-ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన లూప్‌లలో పర్కింజే కణ సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్; n = 3 నుండి 4 ఎలుకలు). డేటా సగటు±SEMగా వ్యక్తీకరించబడింది; ***P<0.001. (D) నిర్దిష్ట ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులలో గ్లూటాథియోన్ రెడాక్స్ సెన్సార్ Grx1-roGFP2ను వ్యక్తీకరించే 7 వారాల వయస్సు గల PN యొక్క సగటు జీవిత కాలాన్ని చూపించే ప్రతినిధి FLIM చిత్రం. LUT (లుక్-అప్ టేబుల్) నిష్పత్తి: మనుగడ సమయ విరామం (పికోసెకన్లలో). స్కేల్ బార్, 25μm. (E) హిస్టోగ్రామ్ (D) నుండి Grx1-roGFP2 జీవితకాల విలువల పంపిణీని చూపుతుంది (ప్రతి పరిస్థితిలో రెండు ఎలుకలలో n=158 నుండి 368 కణాలు). ప్రతి హిస్టోగ్రామ్ పైన ఉన్న పై చార్ట్: CTRL-AAV-scr లో సగటు జీవితకాల విలువ యొక్క 1 SD ని మించిన, గణనీయంగా ఎక్కువ (ఎరుపు, ఆక్సీకరణం చెందిన) లేదా తక్కువ (నీలం, క్షయకరణం చెందిన) జీవితకాల విలువలు కలిగిన కణాల సంఖ్యను చూపుతుంది. (F) ప్రతిపాదిత నమూనా న్యూరోనల్ PCx యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్ యొక్క రక్షణాత్మక ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.
మొత్తం మీద, మేము ఇక్కడ అందించే డేటా ప్రకారం, MFN2 యొక్క పునఃవ్యక్తీకరణ తీవ్రమైన OXPHOS లోపం, తీవ్రమైన mtDNA క్షీణత మరియు అత్యంత అసాధారణమైన ఇస్టా-వంటి స్వరూపం కలిగిన అధునాతన PNను పూర్తిగా రక్షించగలదని, తద్వారా అధునాతన వ్యాధులలో కూడా నిరంతర పురోగతిని అందిస్తుందని తెలుస్తుంది. న్యూరోడిజెనరేషన్ కణ మరణానికి ముందు దశకు తిరగవేయగల సాక్ష్యాన్ని అందిస్తుంది. ఈ స్థాయి జీవక్రియ సౌలభ్యం, న్యూరాన్‌లు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను (TCA చక్రం యొక్క పునఃసంస్థీకరణ) ప్రేరేపించే సామర్థ్యం ద్వారా మరింత నొక్కి చెప్పబడింది, ఇది OXPHOS లేని PNలలో PCx వ్యక్తీకరణను నిరోధిస్తుంది మరియు కణ మరణాన్ని పెంచుతుంది, తద్వారా రక్షణాత్మక పాత్ర పోషిస్తుంది (చిత్రం 5F).
ఈ అధ్యయనంలో, జీవక్రియ కార్యక్రమాల ద్వారా సక్రియం చేయబడిన భేదాత్మక క్రియాశీలత మార్గం ద్వారా, OXPHOS పనిచేయకపోవడానికి PNల ప్రతిస్పందన క్రమంగా TCA చక్రపు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌కు దారితీస్తుందని మేము ఆధారాలను అందించాము. మేము అనేక పరిపూరక పద్ధతులతో ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణను ధృవీకరించాము మరియు తీవ్రమైన మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో సవాలు చేయబడినప్పుడు, న్యూరాన్‌లు ఇంతకు ముందు తెలియని ఒక రకమైన జీవక్రియ స్థితిస్థాపకతను కలిగి ఉన్నాయని వెల్లడించాము. మా ఆశ్చర్యానికి, మొత్తం పునఃసంధాన ప్రక్రియ క్రమంగా మరియు కోలుకోలేని విధంగా న్యూరోడిజెనరేషన్‌తో పాటు వచ్చే అంతిమ జీవక్రియ స్థితిని తప్పనిసరిగా సూచించదు, కానీ కణ మరణానికి ముందు దశలో కూడా ఇది ఒక నిర్వహణ న్యూరాన్ క్రియాత్మక పరిహార యంత్రాంగాన్ని ఏర్పరుస్తుందని మా డేటా సూచిస్తుంది. ఈ ఆవిష్కరణ శరీరంలోని న్యూరాన్‌లు గణనీయమైన స్థాయిలో జీవక్రియ ప్లాస్టిసిటీని కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తుంది. ఈ వాస్తవం MFN2 యొక్క తరువాతి పునఃప్రవేశం కీలక జీవక్రియ మార్కర్ల వ్యక్తీకరణను తిప్పికొట్టగలదని మరియు PN క్షీణతను నిరోధించగలదని రుజువు చేస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, ఇది అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు నరాలను వేగవంతం చేస్తుంది.
మా పరిశోధనలో అత్యంత ఆసక్తికరమైన ఆవిష్కరణలలో ఒకటి ఏమిటంటే, OXPHOS లోపించిన PNలు, ప్రత్యేకంగా ఆర్టెరియోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రేరేపించే ఎంజైమ్‌లను అప్-రెగ్యులేట్ చేయడం ద్వారా TCA సైకిల్ జీవక్రియను సవరించగలవు. జీవక్రియ పునర్వ్యవస్థీకరణ అనేది క్యాన్సర్ కణాల యొక్క ఒక సాధారణ లక్షణం, వాటిలో కొన్ని రిడ్యూసింగ్ ఈక్వివలెంట్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి TCA సైకిల్ ఇంటర్మీడియట్‌లను భర్తీ చేయడానికి గ్లూటమైన్‌పై ఆధారపడతాయి, ఇవి శ్వాసకోశ గొలుసును నడిపిస్తాయి మరియు లిపిడ్ మరియు న్యూక్లియోటైడ్ బయోసింథసిస్ పూర్వగాముల ఉత్పత్తిని నిర్వహిస్తాయి (39, 40). ఇటీవలి ఒక అధ్యయనం ప్రకారం, OXPHOS పనిచేయకపోవడాన్ని అనుభవిస్తున్న పరిధీయ కణజాలాలలో, గ్లూటమైన్/గ్లూటమేట్ జీవక్రియ యొక్క పునఃసంబంధం కూడా ఒక ప్రముఖ లక్షణం (5, 41), ఇక్కడ TCA సైకిల్‌లోకి గ్లూటమైన్ ప్రవేశించే దిశ OXPHOS గాయం యొక్క తీవ్రతపై ఆధారపడి ఉంటుంది (41). అయితే, శరీరంలో న్యూరోనల్ జీవక్రియ ప్లాస్టిసిటీ యొక్క ఏదైనా సారూప్యత మరియు వ్యాధి సందర్భంలో దాని సాధ్యమైన సంబంధంపై స్పష్టమైన ఆధారాలు లేవు. ఇటీవలి ఇన్ విట్రో అధ్యయనంలో, ప్రాథమిక కార్టికల్ న్యూరాన్లు న్యూరోట్రాన్స్మిషన్ కోసం గ్లూటమేట్ పూల్స్‌ను సమీకరించడం ద్వారా జీవక్రియ ఒత్తిడి పరిస్థితులలో ఆక్సీకరణ జీవక్రియ మరియు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తాయని చూపబడింది (42). TCA సైకిల్ ఎంజైమ్ సక్సినేట్ డీహైడ్రోజినేస్ యొక్క ఫార్మకోలాజికల్ నిరోధం కింద, కల్చర్డ్ సెరెబెల్లార్ గ్రాన్యుల్ న్యూరాన్‌లలో ఆక్సలోఅసిటేట్ సంశ్లేషణను పైరువేట్ కార్బాక్సిలేషన్ నిర్వహిస్తుందని నమ్ముతారు (34). అయితే, మెదడు కణజాలానికి ఈ యంత్రాంగాల యొక్క శారీరక సంబంధం (అథెరోస్క్లెరోసిస్ ప్రధానంగా ఆస్ట్రోసైట్‌లకు మాత్రమే పరిమితం అని నమ్ముతారు) ఇప్పటికీ ముఖ్యమైన శారీరక ప్రాముఖ్యతను కలిగి ఉంది (43). ఈ సందర్భంలో, శరీరంలో OXPHOS ద్వారా దెబ్బతిన్న PNలు BCAA క్షీణత మరియు పైరువేట్ కార్బాక్సిలేషన్‌కు మారగలవని మా డేటా చూపిస్తుంది, ఇవి TCA పూల్ ఇంటర్మీడియట్‌ల సప్లిమెంటేషన్‌కు రెండు ప్రధాన వనరులు. న్యూరోనల్ శక్తి జీవక్రియకు BCAA విచ్ఛిన్నం యొక్క ఊహాజనిత సహకారం, న్యూరోట్రాన్స్‌మిషన్ కోసం గ్లూటామేట్ మరియు GABA పాత్రతో పాటు (44) ప్రతిపాదించబడినప్పటికీ, వివోలో ఈ యంత్రాంగాలకు ఇంకా ఎటువంటి ఆధారాలు లేవు. అందువల్ల, పనిచేయని PNలు అథెరోస్క్లెరోసిస్‌ను పెంచడం ద్వారా సమీకరణ ప్రక్రియ ద్వారా నడిచే TCA ఇంటర్మీడియట్‌ల వినియోగాన్ని స్వయంచాలకంగా భర్తీ చేయగలవని ఊహించడం సులభం. ప్రత్యేకించి, ఆస్పార్టిక్ ఆమ్లం కోసం పెరిగిన డిమాండ్‌ను నిర్వహించడానికి PCx యొక్క అప్‌రెగ్యులేషన్ అవసరం కావచ్చు, ఇది మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడంతో వృద్ధి చెందుతున్న కణాలలో చూపబడింది (45). అయితే, మా మెటాబోలోమిక్స్ విశ్లేషణ Mfn2cKO PNలలో ఆస్పార్టిక్ ఆమ్లం యొక్క స్థిర-స్థాయిలో ఎటువంటి ముఖ్యమైన మార్పులను వెల్లడించలేదు (మూర్తి S6A), ఇది బహుశా వృద్ధి చెందుతున్న కణాలు మరియు పోస్ట్-మైటోటిక్ న్యూరాన్‌ల మధ్య ఆస్పార్టిక్ ఆమ్లం యొక్క విభిన్న జీవక్రియ వినియోగాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. వివోలో పనిచేయని న్యూరాన్‌లలో PCx అప్‌రెగ్యులేషన్ యొక్క ఖచ్చితమైన విధానం ఇంకా వర్గీకరించబడనప్పటికీ, ఈ అకాల ప్రతిస్పందన న్యూరాన్‌ల రెడాక్స్ స్థితిని నిర్వహించడంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని మేము ప్రదర్శించాము, ఇది సెరెబెల్లార్ స్లైస్‌లపై FLIM ప్రయోగాలలో ప్రదర్శించబడింది. ప్రత్యేకించి, PNs PCxను అప్‌రెగ్యులేట్ చేయకుండా నిరోధించడం మరింత ఆక్సీకరణ స్థితికి దారితీస్తుంది మరియు కణ మరణాన్ని వేగవంతం చేస్తుంది. BCAA క్షీణత యొక్క క్రియాశీలత మరియు పైరువేట్ యొక్క కార్బాక్సిలేషన్ అనేవి మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క పరిధీయ కణజాలాలను వర్గీకరించే మార్గాలు కావు (7). అందువల్ల, అవి OXPHOS-లోపం ఉన్న న్యూరాన్‌ల యొక్క ప్రాధాన్యత లక్షణంగా కనిపిస్తాయి, ఇది న్యూరోడిజెనరేషన్‌కు ముఖ్యమైన ఏకైక లక్షణం కాకపోయినప్పటికీ.
సెరెబెల్లార్ వ్యాధి అనేది ఒక వైవిధ్యమైన న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధి, ఇది సాధారణంగా అటాక్సియాగా వ్యక్తమవుతుంది మరియు తరచుగా PNలను దెబ్బతీస్తుంది (46). ఈ న్యూరాన్ జనాభా మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడానికి ప్రత్యేకంగా గురవుతుంది, ఎందుకంటే ఎలుకలలో వాటి ఎంపిక చేసిన క్షీణత మానవ స్పైనోసెరెబెల్లార్ అటాక్సియాను వర్గీకరించే అనేక మోటార్ లక్షణాలను పునరుత్పత్తి చేయడానికి సరిపోతుంది (16, 47, 48). నివేదికల ప్రకారం, ఒక మ్యుటెంట్ జన్యువుతో కూడిన ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుక నమూనా మానవ స్పైనోసెరెబెల్లార్ అటాక్సియాతో సంబంధం కలిగి ఉంది మరియు మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడాన్ని కలిగి ఉంది (49, 50), ఇది PNPHలో OXPHOS లోపం యొక్క పరిణామాలను అధ్యయనం చేయవలసిన ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది. అందువల్ల, ఈ ప్రత్యేకమైన న్యూరాన్ జనాభాను సమర్థవంతంగా వేరుచేసి అధ్యయనం చేయడానికి ఇది ప్రత్యేకంగా అనుకూలంగా ఉంటుంది. అయినప్పటికీ, PNలు ఒత్తిడికి చాలా సున్నితంగా ఉంటాయి మరియు మొత్తం సెరెబెల్లార్ కణ జనాభాలో తక్కువ నిష్పత్తిని కలిగి ఉంటాయి కాబట్టి, అనేక ఓమిక్స్-ఆధారిత అధ్యయనాలకు, వాటిని పూర్తి కణాలుగా ఎంపిక చేసి వేరుచేయడం ఇప్పటికీ ఒక సవాలుతో కూడిన అంశం. ఇతర కణ రకాల (ముఖ్యంగా వయోజన కణజాలాలు) కాలుష్యం పూర్తిగా లేకుండా చేయడం దాదాపు అసాధ్యం అయినప్పటికీ, తదుపరి ప్రోటీయోమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం తగిన సంఖ్యలో జీవకణాలను పొందడానికి మేము FACS తో ఒక సమర్థవంతమైన విడదీసే దశను కలిపాము, మరియు మొత్తం సెరెబెల్లమ్ యొక్క ఇప్పటికే ఉన్న డేటా సెట్ (51) తో పోలిస్తే చాలా అధిక ప్రోటీన్ కవరేజీని (సుమారు 3000 ప్రోటీన్లు) కలిగి ఉన్నాము. మొత్తం కణాల జీవశక్తిని కాపాడటం ద్వారా, మేము ఇక్కడ అందించే పద్ధతి మైటోకాండ్రియాలోని జీవక్రియ మార్గాలలో మార్పులను తనిఖీ చేయడానికి మాత్రమే కాకుండా, దాని సైటోప్లాస్మిక్ భాగాలలో మార్పులను తనిఖీ చేయడానికి కూడా అనుమతిస్తుంది, ఇది సంక్లిష్ట కణజాలాలలో మైటోకాండ్రియా సంఖ్య కోసం కణ రకాలకు ప్రత్యేకమైన మైటోకాండ్రియల్ పొర లేబుల్ సుసంపన్నత యొక్క కొత్త పద్ధతికి పూరకంగా ఉంటుంది (52, 53). మేము వివరించే పద్ధతి పర్కింజే కణాల అధ్యయనానికి మాత్రమే సంబంధించినది కాదు, కానీ మైటోకాండ్రియల్ పనిచేయకపోవడం యొక్క ఇతర నమూనాలతో సహా, వ్యాధిగ్రస్త మెదళ్లలో జీవక్రియ మార్పులను పరిష్కరించడానికి ఏ రకమైన కణానికైనా సులభంగా వర్తింపజేయవచ్చు.
చివరగా, ఈ జీవక్రియ పునర్వ్యవస్థీకరణ ప్రక్రియలో కణ ఒత్తిడి యొక్క కీలక సంకేతాలను పూర్తిగా తిప్పికొట్టి, నాడీ క్షీణతను నివారించగల ఒక చికిత్సా అవకాశాన్ని మేము గుర్తించాము. అందువల్ల, ఇక్కడ వివరించిన ఈ పునర్వ్యవస్థీకరణ యొక్క క్రియాత్మక ప్రభావాలను అర్థం చేసుకోవడం, మైటోకాన్డ్రియల్ పనిచేయకపోవడం సమయంలో నాడీ కణాల జీవశక్తిని కాపాడటానికి సాధ్యమయ్యే చికిత్సల గురించి ప్రాథమిక అంతర్దృష్టులను అందించవచ్చు. ఈ సూత్రం ఇతర నాడీ సంబంధిత వ్యాధులకు ఎంతవరకు వర్తిస్తుందో పూర్తిగా వెల్లడి చేయడానికి, ఇతర మెదడు కణ రకాలలో శక్తి జీవక్రియలో మార్పులను విశ్లేషించే లక్ష్యంతో భవిష్యత్తులో పరిశోధన జరగాల్సి ఉంది.
మైటోపార్క్ ఎలుకలను ఇంతకు ముందు వివరించారు (31). Mfn2 జన్యువులకు ఇరువైపులా loxP ఉన్న C57BL/6N ఎలుకలను ఇంతకు ముందు వివరించారు (18) మరియు L7-Cre ఎలుకలతో సంకరం చేశారు (23). ఫలితంగా వచ్చిన డబుల్ హెటెరోజైగస్ సంతానాన్ని, Mfn2 కోసం పర్కింజే-నిర్దిష్ట జన్యు నాకౌట్‌లను (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ఉత్పత్తి చేయడానికి హోమోజైగస్ Mfn2loxP/Mfn2loxP ఎలుకలతో సంకరం చేశారు. సంకరం యొక్క ఒక ఉపసమితిలో, అదనపు సంకరాల ద్వారా Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP అల్లెల్ (stop-mtYFP) ప్రవేశపెట్టబడింది (20). అన్ని జంతు ప్రక్రియలు యూరోపియన్, జాతీయ మరియు సంస్థాగత మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు జర్మనీలోని నార్త్ రైన్-వెస్ట్‌ఫాలియాలోని ఉమ్వెల్ట్ మరియు వెర్బ్రౌచర్‌షుట్జ్‌కు చెందిన లాండెస్అమ్ట్‌ఫర్‌నాటూర్ ద్వారా ఆమోదించబడ్డాయి. జంతువులపై చేసే పని యూరోపియన్ ఫెడరేషన్ ఆఫ్ లాబొరేటరీ యానిమల్ సైన్సెస్ అసోసియేషన్స్ మార్గదర్శకాలను కూడా అనుసరిస్తుంది.
గర్భిణీ స్త్రీకి మత్తుమందు ఇచ్చి, ఆమె మెడను విరిచిన తర్వాత, ఎలుక పిండాన్ని వేరు చేశారు (E13). కార్టెక్స్‌ను 10 mM హెపెస్ కలిపిన హాంక్స్ బ్యాలెన్స్‌డ్ సాల్ట్ సొల్యూషన్ (HBSS)లో విడదీసి, పాపైన్ (20 U/ml) మరియు సిస్టీన్ (1μg/ml) కలిగిన డల్బెక్కోస్ మోడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియంలోకి మార్చారు. కణజాలాన్ని DMEMలో ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఎంజైమాటిక్ డైజెషన్ ద్వారా విడగొట్టారు. 37°C వద్ద 20 నిమిషాల పాటు ఉంచి, ఆ తర్వాత 10% ఫీటల్ బోవైన్ సీరమ్ కలిపిన DMEMలో యాంత్రికంగా మెత్తగా నూరారు. కణాలను పాలీలైసిన్‌తో పూత పూసిన గ్లాస్ కవర్‌స్లిప్స్‌పై 6 సెం.మీ కల్చర్ డిష్‌కు 2×10⁶ కణాల సాంద్రతతో లేదా ఇమేజింగ్ విశ్లేషణ కోసం 0.5×10⁵ కణాలు/సెం.మీ² సాంద్రతతో విత్తారు. 4 గంటల తర్వాత, మీడియంను 1% B27 సప్లిమెంట్ మరియు 0.5 mM గ్లూటామాక్స్ కలిగిన న్యూరోబేసల్ సీరమ్-ఫ్రీ మీడియంతో మార్చారు. ప్రయోగం అంతటా న్యూరాన్‌లను 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద ఉంచి, వారానికి ఒకసారి ఆహారం అందించారు. ఇన్ విట్రోలో పునఃసంయోగాన్ని ప్రేరేపించడానికి, ఇన్ విట్రోలో రెండవ రోజున న్యూరాన్‌లకు చికిత్స చేయడానికి 3μl (24-వెల్ కల్చర్ డిష్) లేదా 0.5μl (24-వెల్ ప్లేట్) కింది AAV9 వైరస్ వెక్టర్‌ను ఉపయోగించారు: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, కేటలాగ్ నంబర్ 105530-AAV9) మరియు AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, కేటలాగ్ నంబర్ 105545-AAV9).
మౌస్ Mfn1 మరియు Mfn2 కాంప్లిమెంటరీ DNA (వరుసగా Addgene ప్లాస్మిడ్ #23212 మరియు #23213 నుండి పొందబడినవి) C-టెర్మినస్ వద్ద V5 సీక్వెన్స్ (GKPIPNPLLGLDST) తో గుర్తించబడ్డాయి, మరియు T2A సీక్వెన్స్ ద్వారా mCherry తో ఇన్-ఫ్రేమ్‌లో ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి. Grx1-roGFP2 అనేది హైడెల్‌బర్గ్ TP డిక్ DFKZ (డ్యూట్షెస్ క్రెబ్స్‌ఫోర్ష్‌జెంట్రమ్) నుండి బహుమతిగా లభించింది. సాంప్రదాయ క్లోనింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి tdTomato క్యాసెట్‌ను మార్చడం ద్వారా, ఆ క్యాసెట్‌ను pAAV-CAG-FLEX-tdTomato బ్యాక్‌బోన్ (Addgene రిఫరెన్స్ నంబర్ 28306) లోకి సబ్‌క్లోన్ చేసి pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 మరియు pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 వెక్టర్లను రూపొందించారు. pAAV-CAG-FLEX-mCherry అనే కంట్రోల్ వెక్టర్‌ను రూపొందించడానికి కూడా ఇదే విధమైన వ్యూహాన్ని ఉపయోగించారు. AAV-shPCx కన్‌స్ట్రక్ట్‌ను రూపొందించడానికి, ఒక ప్లాస్మిడ్ AAV వెక్టర్ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) అవసరం. ఇది U6 ప్రమోటర్ నియంత్రణలో మౌస్ PCxను లక్ష్యంగా చేసుకునే shRNAను ఎన్‌కోడ్ చేసే DNA సీక్వెన్స్‌ను (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) కలిగి ఉంటుంది, మరియు CMV ప్రమోటర్ నియంత్రణలో mCherry ఉపయోగించబడుతుంది. సహాయక AAV వెక్టర్ల ఉత్పత్తి తయారీదారు సూచనల (సెల్ బయోలాబ్స్) ప్రకారం నిర్వహించబడింది. సంక్షిప్తంగా, కాల్షియం ఫాస్ఫేట్ పద్ధతిని ఉపయోగించి, 293AAV కణాలలో mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) కోడింగ్ జన్యువును, అలాగే AAV1 క్యాప్సిడ్ ప్రోటీన్ మరియు అనుబంధ ప్రోటీన్‌ను కోడింగ్ చేసే ట్రాన్స్‌ఫర్ ప్లాస్మిడ్‌ను ప్యాకేజింగ్ ప్లాస్మిడ్‌గా వాడండి. డ్రై ఐస్/ఇథనాల్ బాత్‌లో ఫ్రీజ్-థా సైకిల్స్ ద్వారా ముడి వైరస్ సూపర్నాటెంట్‌ను పొందారు మరియు ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ (PBS)లో కణాలను లైస్ చేశారు. AAV వెక్టర్‌ను డిస్కంటిన్యూస్ అయోడిక్సానోల్ గ్రేడియంట్ అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూగేషన్ (32,000 rpm మరియు 4°C వద్ద 24 గంటలు) ద్వారా శుద్ధి చేసి, అమికాన్ అల్ట్రా-15 సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించి గాఢతను పెంచారు. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 జీనోమ్ కాపీ (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) మరియు AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) యొక్క జీనోమ్ టైటర్‌ను గతంలో వివరించిన విధంగా (54) రియల్-టైమ్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (qPCR) ద్వారా కొలిచారు.
ప్రాథమిక న్యూరాన్‌లను అతి శీతల 1x PBSలో గీరి తీసి, పెల్లెట్ చేసి, ఆపై ఫాస్ఫటేజ్ మరియు ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ (రోష్) కలిగిన 0.5% ట్రైటాన్ X-100 / 0.5% సోడియం డియోక్సికోలేట్/PBS లైసిస్ బఫర్‌లో హోమోజనైజ్ చేశారు. బైసిన్కోనినిక్ యాసిడ్ ఎస్సే (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ పరిమాణ నిర్ధారణ చేశారు. ఆ తర్వాత ప్రోటీన్‌లను SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ ద్వారా వేరు చేసి, ఆపై పాలివినైలిడెన్ ఫ్లోరైడ్ మెంబ్రేన్ (GE హెల్త్‌కేర్) పైకి బ్లాట్ చేశారు. నిర్దిష్టేతర సైట్‌లను బ్లాక్ చేసి, TBST (ట్రిస్-బఫర్డ్ సెలైన్ విత్ ట్వీన్)లోని 5% పాలలో ప్రాథమిక యాంటీబాడీతో (వివరాల కోసం పట్టిక S1 చూడండి) ఇంక్యుబేట్ చేయండి, వాషింగ్ దశలు మరియు TBSTలో సెకండరీ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రాథమిక యాంటీబాడీతో +4°C వద్ద రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేయండి. కడిగిన తర్వాత, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు సెకండరీ యాంటీబాడీని అప్లై చేయండి. తదనంతరం, అదే బ్లాట్‌ను యాంటీ-β-యాక్టిన్ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా, అదే లోడింగ్‌ను నిర్ధారించారు. కెమిలుమినెసెన్స్‌గా మార్చడం మరియు కెమిలుమినెసెన్స్‌ను మెరుగుపరచడం ద్వారా గుర్తించడం (GE హెల్త్‌కేర్).
ముందుగా గ్లాస్ కవర్‌స్లిప్‌లపై వేయబడిన న్యూరాన్‌లను, నిర్దిష్ట సమయంలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 4% పారాఫార్మాల్డిహైడ్ (PFA)/PBSతో స్థిరీకరించారు. కవర్‌స్లిప్‌లను మొదట గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాల పాటు 0.1% ట్రైటాన్ X-100/PBSతో, ఆపై బ్లాకింగ్ బఫర్ [3% బోవైన్ సీరం ఆల్బుమిన్ (BSA)/PBS]తో పారగమ్యం చేశారు. రెండవ రోజు, కవర్‌స్లిప్‌లను బ్లాకింగ్ బఫర్‌తో కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు తగిన ఫ్లోరోఫోర్-సంయుక్త సెకండరీ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు; చివరగా, నమూనాలను PBSలో పూర్తిగా కడిగి, 4′,6-డయామిడినో-2-ఫినైలిండోల్ (DAPI)తో కౌంటర్‌స్టెయిన్ చేసి, ఆపై ఆక్వా-పాలీ/మౌంట్‌తో మైక్రోస్కోప్ స్లైడ్‌పై స్థిరీకరించారు.
ఎలుకలకు (మగ మరియు ఆడ) ఇంట్రాపెరిటోనియల్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా కెటమైన్ (130 mg/kg) మరియు జైలాజైన్ (10 mg/kg) ఇచ్చి మత్తు కలిగించారు, మరియు చర్మం కింద కార్ప్రోఫెన్ అనాల్జేసిక్ (5 mg/kg) ఇచ్చారు. ఆ తర్వాత వాటిని వెచ్చని ప్యాడ్ అమర్చిన స్టీరియోటాక్టిక్ పరికరంలో (కోఫ్) ఉంచారు. పుర్రెను బహిర్గతం చేసి, డెంటల్ డ్రిల్ ఉపయోగించి, MIS ఎముకకు (లాంబ్డా నుండి: తోక 1.8, పార్శ్వం 1, ఇవి లోబ్యూల్స్ IV మరియు V లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి) సంబంధించిన సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్ భాగాన్ని పల్చగా చేశారు. కింద ఉన్న రక్తనాళాలకు అంతరాయం కలగకుండా, వంగిన సిరంజి సూదిని ఉపయోగించి పుర్రెలో జాగ్రత్తగా ఒక చిన్న రంధ్రం చేశారు. తరువాత, పలుచగా లాగిన గాజు కేశనాళికను నెమ్మదిగా సూక్ష్మ రంధ్రంలోకి (డ్యూరా మేటర్ యొక్క ఉదర భాగంలో -1.3 నుండి -1 వరకు) చొప్పించి, 10 నుండి 20 నిమిషాల వ్యవధిలో, మాన్యువల్ సిరంజిల (నరిషిగే)తో 200 నుండి 300 nl AAV ని తక్కువ పీడనంతో మైక్రో-ఇంజెక్టర్ (నరిషిగే) లోకి అనేకసార్లు ఇంజెక్ట్ చేస్తారు. ఇన్ఫ్యూజన్ తరువాత, వైరస్ పూర్తిగా వ్యాపించడానికి వీలుగా కేశనాళికను మరో 10 నిమిషాల పాటు ఉంచుతారు. కేశనాళికలను వెలికితీసిన తరువాత, గాయం వాపును తగ్గించడానికి మరియు జంతువు కోలుకోవడానికి వీలుగా చర్మానికి జాగ్రత్తగా కుట్లు వేస్తారు. ఆపరేషన్ తర్వాత కొన్ని రోజుల పాటు జంతువులకు నొప్పి నివారణ మందులతో (కాస్పోఫెన్) చికిత్స అందించారు, ఈ సమయంలో వాటి శారీరక పరిస్థితిని జాగ్రత్తగా పర్యవేక్షించారు మరియు తరువాత పేర్కొన్న సమయానికి వాటిని కారుణ్య మరణానికి గురిచేశారు. అన్ని విధానాలు యూరోపియన్, జాతీయ మరియు సంస్థాగత మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి మరియు జర్మనీలోని నార్త్ రైన్-వెస్ట్‌ఫాలియాకు చెందిన ఉమ్వెల్ట్ మరియు వెర్బ్రౌచర్‌షుట్జ్ యొక్క లాండెస్అమ్ట్‌ఫర్‌నాటూర్ ద్వారా ఆమోదించబడ్డాయి.
జంతువులకు కెటమైన్ (100 mg/kg) మరియు జైలాజైన్ (10 mg/kg) తో మత్తుమందు ఇచ్చి, మొదట 0.1 M PBS తో, ఆపై PBS లో 4% PFA తో గుండెను పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు. కణజాలాన్ని వేరు చేసి, 4°C వద్ద రాత్రిపూట 4% PFA/PBS లో స్థిరీకరించారు. PBS లో స్థిరీకరించిన మెదడు నుండి సాజిటల్ సెక్షన్లను (50 μm మందం) తయారు చేయడానికి వైబ్రేటింగ్ కత్తిని (లీకా మైక్రోసిస్టమ్స్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) ఉపయోగించారు. ప్రత్యేకంగా పేర్కొనకపోతే, ఫ్రీ-ఫ్లోటింగ్ సెక్షన్ల స్టెయినింగ్ పైన వివరించిన విధంగా (13) గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద మరియు కదిలిస్తూ నిర్వహించబడింది. క్లుప్తంగా, మొదట, పొందిన స్లైస్‌లను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 0.5% ట్రైటాన్ X-100/PBS తో పర్మియబిలైజ్ చేశారు; కొన్ని ఎపిటోప్‌ల (Pcx మరియు Shmt2) కోసం, ఈ దశకు బదులుగా 80°C (PH 9) వద్ద ట్రైస్-EDTA బఫర్‌లో స్లైస్‌లను 25 నిమిషాల పాటు వేడి చేశారు. తరువాత, విభాగాలను బ్లాకింగ్ బఫర్ (3% BSA/PBS)లో ప్రాథమిక యాంటీబాడీ (పట్టిక S1 చూడండి)తో 4°C వద్ద రాత్రంతా కలుపుతూ ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మరుసటి రోజు, విభాగాలను బ్లాకింగ్ బఫర్‌తో కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు తగిన ఫ్లోరోఫోర్-సంయుక్త ద్వితీయ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు; చివరగా, విభాగాలను PBSలో పూర్తిగా కడిగి, DAPIతో కౌంటర్-స్టెయిన్ చేసి, ఆపై మైక్రోస్కోప్ స్లైడ్‌పై ఆక్వాపాలిమౌంట్‌తో స్థిరీకరించారు.
నమూనాను చిత్రీకరించడానికి, ఒక తెల్లని కాంతి లేజర్ మరియు 405 డయోడ్ అతినీలలోహిత లేజర్‌తో కూడిన లేజర్ స్కానింగ్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (TCS SP8-X లేదా TCS డిజిటల్ లైట్ షీట్, లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించబడింది. ఫ్లోరోఫోర్‌ను ఉత్తేజపరిచి, హైబ్రిడ్ డిటెక్టర్ (HyDs)తో సిగ్నల్‌ను సేకరించడం ద్వారా, సీక్వెన్షియల్ మోడ్‌లో నైక్విస్ట్ శాంప్లింగ్‌కు అనుగుణంగా స్టాక్డ్ చిత్రాలను సేకరించడానికి LAS-X సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించబడింది: పరిమాణాత్మకం కాని ప్యానెళ్ల కోసం, ఇది అత్యంత డైనమిక్ సిగ్నల్స్ (ఉదాహరణకు, దైహిక కణాలు మరియు డెండ్రైట్‌లలో mtYFP) బ్రైట్‌ఆర్ మోడ్‌లో PNల సంఖ్యను గుర్తించడానికి HyDని ఉపయోగించండి. బ్యాక్‌గ్రౌండ్‌ను తగ్గించడానికి 0.3 నుండి 6 ns వరకు గేటింగ్ వర్తింపజేయబడింది.
క్రమబద్ధీకరించిన కణాల రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్. 1% B27 సప్లిమెంట్ మరియు 0.5 mM గ్లూటామాక్స్ కలిగిన న్యూరోబేసల్-A మీడియంలో క్రమబద్ధీకరించిన తర్వాత, కణాలను వెంటనే పాలి-ఎల్-లైసిన్ పూత పూసిన గాజు స్లైడ్‌లపై (μ-Slide8 Well, Ibidi, కేటలాగ్ నంబర్ 80826) విత్తారు, ఆపై కణాలు స్థిరపడటానికి వీలుగా దానిని 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద 1 గంట పాటు ఉంచారు. రియల్-టైమ్ ఇమేజింగ్‌ను వైట్ లేజర్, HyD, 63×[1.4 న్యూమరికల్ అపర్చర్ (NA)] ఆయిల్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ మరియు హీటింగ్ స్టేజ్‌తో కూడిన లైకా SP8 లేజర్ స్కానింగ్ కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌పై నిర్వహించారు.
ఎలుకకు కార్బన్ డయాక్సైడ్‌తో త్వరగా మత్తు ఇచ్చి, తల నరికారు, పుర్రె నుండి మెదడును త్వరగా తీసివేసి, కింది పదార్థాలతో నింపిన 200μm మందం (13C లేబులింగ్ ప్రయోగం కోసం) లేదా 275μm మందం (రెండు ఫోటాన్ ప్రయోగాల కోసం) సాజిటల్ సెక్షన్‌లుగా కత్తిరించారు. ఐస్ క్రీమ్ (HM-650 V, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్‌డార్ఫ్, జర్మనీ) కింది పదార్థాలతో నింపబడి ఉంటుంది: 125 mM అతి శీతల, కార్బన్-సంతృప్త (95% O2 మరియు 5% CO2) తక్కువ Ca2 + కృత్రిమ సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25 mM NaHCO3, 25 mM గ్లూకోజ్, 0.5 mM CaCl2 మరియు 3.5 mM MgCl2 (310 నుండి 330 mmol ద్రవాభిసరణ పీడనం). పొందిన మెదడు ముక్కలను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 2.0 mM MgCl2) మీడియం) pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mmol) కలిగిన ప్రీ-ఇంక్యుబేషన్ చాంబర్‌కు బదిలీ చేయండి.
ఇమేజింగ్ ప్రక్రియ సమయంలో, స్లైస్‌లను ఒక ప్రత్యేక ఇమేజింగ్ గదిలోకి తరలించారు, మరియు 32° నుండి 33°C స్థిర ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిరంతర ACSF పెర్ఫ్యూజన్ కింద ప్రయోగాన్ని నిర్వహించారు. స్లైస్ ఇమేజింగ్ కోసం, లైకా 25x ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (NA 0.95, వాటర్), Ti: సఫైర్ లేజర్ (కామెలియన్ విజన్ II, కోహెరెంట్) అమర్చిన మల్టీఫోటాన్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (TCS SP8 MP-OPO, లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్)ను ఉపయోగించారు. FLIM మాడ్యూల్ (పికోహార్ప్300, పికోక్వాంట్).
Grx1-roGFP2 యొక్క FLIM. సాజిటల్ బ్రెయిన్ స్లైస్‌లలో టూ-ఫోటాన్ FLIM ద్వారా PNల సైటోప్లాస్మిక్ రెడాక్స్ స్థితిలో మార్పులను కొలిచారు, ఇక్కడ Grx1-roGFP2 బయోసెన్సార్ PNలను లక్ష్యంగా చేసుకుంది. PN పొరలో, స్లైస్ ఉపరితలం నుండి సుమారు 50 నుండి 80 μm దిగువన అక్విజిషన్ ఫీల్డ్‌ను ఎంచుకున్నారు, తద్వారా అక్కడ ఒక సజీవ PN (అంటే, డెండ్రైట్‌ల వెంట పూసల వంటి నిర్మాణం లేదా న్యూరోనల్ మార్ఫలాజికల్ మార్పులు లేకపోవడం) ఉందని నిర్ధారించుకున్నారు. అలాగే, డబుల్ పాజిటివ్ roGFP2 సెన్సార్ మరియు shRNA PCx లేదా దాని కంట్రోల్ సీక్వెన్స్‌ను ఎన్‌కోడ్ చేసే AAV (ప్రతిదీ mCherryని సహ-వ్యక్తీకరిస్తుంది) కూడా ఉన్నాయి. 2x డిజిటల్ జూమ్‌తో సింగిల్-స్టాక్ చిత్రాలను సేకరించారు [ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యం: 890 nm; 512 nm 512 పిక్సెల్స్]. కర్వ్ ఫిట్టింగ్ కోసం తగినన్ని ఫోటాన్‌లు (మొత్తం 1000 ఫోటాన్‌లు) సేకరించబడ్డాయని నిర్ధారించుకోవడానికి, డిటెక్షన్: ఇంటర్నల్ HyD, ఫ్లోరోసెయిన్ ఐసోథయోసయనేట్ (FITC) ఫిల్టర్ గ్రూప్] మరియు 2 నుండి 3 నిమిషాలలోపు ఇమేజ్ యావరేజింగ్‌ను ఉపయోగిస్తారు. పెర్ఫ్యూజన్ ACSFకు ఎక్సోజెనస్ 10 mM H2O2ను జోడించినప్పుడు (ఆక్సీకరణను గరిష్ఠం చేసి, తద్వారా జీవితకాలాన్ని పెంచడానికి), మరియు తరువాత 2 mM డైథియోథ్రెయిటాల్‌ను జోడించినప్పుడు (క్షయకరణ స్థాయిని కనిష్ఠం చేసి, జీవితకాలాన్ని తగ్గించడానికి) roGFP2 యొక్క జీవితకాల విలువను పర్యవేక్షించడం ద్వారా Grx1-roGFP2 ప్రోబ్ యొక్క సెన్సిటివిటీ మరియు FLIM పరిస్థితుల ధృవీకరణ జరిగాయి (చిత్రం S8, D నుండి G). పొందిన ఫలితాలను విశ్లేషించడానికి FLIMfit 5.1.1 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి, మొత్తం ఇమేజ్ యొక్క సింగిల్ ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ డికే కర్వ్‌ను కొలవబడిన IRF (ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ రెస్పాన్స్ ఫంక్షన్)కు ఫిట్ చేయండి, మరియు χ2 సుమారుగా 1గా ఉంటుంది. ఒకే PN యొక్క జీవితకాలాన్ని లెక్కించడానికి, నరాల శరీరం చుట్టూ మాస్క్‌ను మాన్యువల్‌గా గీశారు, మరియు పరిమాణీకరణ కోసం ప్రతి మాస్క్‌లోని సగటు జీవితకాలాన్ని ఉపయోగించారు.
మైటోకాండ్రియల్ పొటెన్షియల్ విశ్లేషణ. పెర్ఫ్యూజ్డ్ ACSF లోకి నేరుగా 100 nM TMRM ను కలిపి, అక్యూట్ సెక్షన్‌ను 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసిన తర్వాత, PNs యొక్క మైటోకాండ్రియల్ పొటెన్షియల్ మార్పులను టూ-ఫోటాన్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా కొలిచారు. TMRM ఇమేజింగ్‌ను, ప్రోబ్‌ను 920 nm వద్ద ఉత్తేజపరిచి, సిగ్నల్స్ సేకరించడానికి ఇంటర్నల్ HyD (టెట్రామీథైల్‌రోడామైన్ ఐసోథయోసయనేట్: 585/40 nm) ను ఉపయోగించి నిర్వహించారు; అదే ఎక్సైటేషన్ వేవ్‌లెంగ్త్‌ను ఉపయోగించి, కానీ వేరొక ఇంటర్నల్ HyD (FITC :525/50) తో mtYFP ను ఇమేజ్ చేశారు. సింగిల్ సెల్ స్థాయిలో మైటోకాండ్రియల్ పొటెన్షియల్‌ను అంచనా వేయడానికి ImageJ యొక్క ఇమేజ్ కాలిక్యులేటర్ ప్లగ్-ఇన్‌ను ఉపయోగించండి. క్లుప్తంగా, సంబంధిత ఛానెల్ యొక్క సింగిల్-స్టాక్ కాన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లో పుర్కింజే సోమాలిలో TMRM సిగ్నల్‌ను చూపించే మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రాంతాన్ని గుర్తించడానికి, `signole = min (mtYFP, TMRM)` అనే ప్లగ్-ఇన్ సమీకరణాన్ని ఉపయోగించారు. ఆ తర్వాత, ఫలిత మాస్క్‌లోని పిక్సెల్ ప్రాంతాన్ని పరిమాణీకరించి, ఆపై మైటోకాండ్రియల్ పొటెన్షియల్‌ను చూపించే మైటోకాండ్రియల్ ఫ్రాక్షన్‌ను పొందడానికి mtYFP ఛానెల్ యొక్క సంబంధిత థ్రెషోల్డ్ సింగిల్-స్టాక్ ఇమేజ్‌పై సాధారణీకరిస్తారు.
ఈ చిత్రాన్ని హ్యూజెన్స్ ప్రో (సైంటిఫిక్ వాల్యూమ్ ఇమేజింగ్) సాఫ్ట్‌వేర్‌తో డీకన్వాల్యూట్ చేయడం జరిగింది. స్కాన్ చేసిన టైల్స్ చిత్రాల కోసం, LAS-X సాఫ్ట్‌వేర్ అందించిన ఆటోమేటిక్ స్టిచింగ్ అల్గోరిథంను ఉపయోగించి ఒకే టైల్ యొక్క మాంటేజ్ తయారు చేయబడింది. ఇమేజ్ కాలిబ్రేషన్ తర్వాత, చిత్రాన్ని మరింత ప్రాసెస్ చేయడానికి మరియు ప్రకాశం, కాంట్రాస్ట్‌లను ఏకరీతిగా సర్దుబాటు చేయడానికి ImageJ మరియు Adobe Photoshopలను ఉపయోగించండి. గ్రాఫిక్ తయారీ కోసం Adobe Illustratorను ఉపయోగించండి.
mtDNA ఫోకస్ విశ్లేషణ. కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ద్వారా, DNAకు వ్యతిరేకంగా ఉండే యాంటీబాడీలతో లేబుల్ చేయబడిన సెరెబెల్లార్ సెక్షన్లపై mtDNA గాయాల సంఖ్యను లెక్కించారు. ప్రతి కణం యొక్క కణ దేహం మరియు కేంద్రకం కోసం ఒక్కో లక్ష్య ప్రాంతాన్ని సృష్టించి, ఆయా ప్రాంతాలను మల్టీ మెజర్ ప్లగ్-ఇన్ (ఇమేజ్‌జె సాఫ్ట్‌వేర్) ఉపయోగించి లెక్కించారు. కణద్రవ్య ప్రాంతాన్ని పొందడానికి కణ దేహం ప్రాంతం నుండి కేంద్రక ప్రాంతాన్ని తీసివేయాలి. చివరగా, థ్రెషోల్డ్ ఇమేజ్‌పై mtDNAను సూచించే కణద్రవ్య DNA పాయింట్లను స్వయంచాలకంగా లెక్కించడానికి ఎనలైజ్ పార్టికల్స్ ప్లగ్-ఇన్ (ఇమేజ్‌జె సాఫ్ట్‌వేర్)ను ఉపయోగించారు, మరియు పొందిన ఫలితాలను CTRL ఎలుకల PN సగటుకు సాధారణీకరించారు. ఫలితాలను ప్రతి కణానికి సగటు న్యూక్లియోసైడ్‌ల సంఖ్యగా వ్యక్తీకరించారు.
ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ. సింగిల్ సెల్ స్థాయిలో PNలో ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణను అంచనా వేయడానికి ImageJ యొక్క ఇమేజ్ కాలిక్యులేటర్ ప్లగ్-ఇన్‌ను ఉపయోగించండి. క్లుప్తంగా, సంబంధిత ఛానెల్ యొక్క సింగిల్-లేయర్ కాన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లో, సిగ్నల్ = min (mtYFP, యాంటీబాడీ) అనే సమీకరణం ద్వారా, పర్కినాలోని ఒక నిర్దిష్ట యాంటీబాడీకి ఇమ్యునోరియాక్టివిటీని చూపించే మైటోకాండ్రియల్ ప్రాంతం గుర్తించబడుతుంది. ఆ తర్వాత, ఫలిత మాస్క్‌లోని పిక్సెల్ ప్రాంతం పరిమాణీకరించబడుతుంది, మరియు ప్రదర్శించబడిన ప్రోటీన్ యొక్క మైటోకాండ్రియల్ ఫ్రాక్షన్‌ను పొందడానికి mtYFP ఛానెల్ యొక్క సంబంధిత థ్రెషోల్డ్ సింగిల్-స్టాక్ ఇమేజ్‌పై సాధారణీకరించబడుతుంది.
పర్కింజే కణ సాంద్రత విశ్లేషణ. లెక్కించిన పర్కింజే కణాల సంఖ్యను, ఆ కణాలు ఆక్రమించిన సెరెబెల్లార్ రింగ్ పొడవుతో భాగించడం ద్వారా పర్కింజే సాంద్రతను అంచనా వేయడానికి ImageJ యొక్క సెల్ కౌంటర్ ప్లగ్-ఇన్ ఉపయోగించబడింది.
నమూనా తయారీ మరియు సేకరణ. నియంత్రణ సమూహం మరియు Mfn2cKO ఎలుకల మెదళ్లను 0.1 M ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (PB)లో 2% PFA/2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్‌లో స్థిరీకరించారు, ఆపై సిలియేట్స్ (లీకా మైక్రోసిస్టెమ్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) ఉపయోగించి కరోనల్ సెక్షన్‌లను (మందం 50 నుండి 60 μm) తయారు చేశారు. తర్వాత గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు 1% ఓస్ టెట్రాక్సైడ్ మరియు 1.5% పొటాషియం ఫెర్రోసైనైడ్‌తో కూడిన PB బఫర్‌లో స్థిరీకరించారు. ఈ సెక్షన్‌లను స్వేదన జలంతో మూడుసార్లు కడిగి, ఆపై 1% యురేనిల్ అసిటేట్ కలిగిన 70% ఇథనాల్‌తో 20 నిమిషాల పాటు రంగు వేశారు. ఆ తర్వాత సెక్షన్‌లను గ్రేడెడ్ ఆల్కహాల్‌లో నిర్జలీకరణం చేసి, సిలికాన్ పూత పూసిన గాజు స్లైడ్‌ల మధ్య డర్కుపాన్ ACM (అరాల్డైట్ కాస్టింగ్ రెసిన్ M) ఎపాక్సీ రెసిన్ (ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ సైన్సెస్, కేటలాగ్ నంబర్ 14040)లో పొందుపరిచారు, మరియు చివరగా 60°C వద్ద ఓవెన్‌లో 48 గంటల పాటు పాలిమరైజ్ చేశారు. సెరెబెల్లార్ కార్టెక్స్ ప్రాంతాన్ని ఎంచుకుని, లీకా అల్ట్రాకట్ (లీకా మైక్రోసిస్టెమ్ GmbH, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) పై 50 nm అతి సన్నని సెక్షన్లను కత్తిరించి, పాలీస్టైరిన్ ఫిల్మ్‌తో పూత పూసిన 2×1 mm రాగి స్లిట్ గ్రిడ్‌పై ఉంచారు. ఈ సెక్షన్లకు H2O లోని 4% యురేనిల్ అసిటేట్ ద్రావణంతో 10 నిమిషాల పాటు రంగు వేసి, H2O తో చాలాసార్లు కడిగారు. ఆ తర్వాత H2O లోని రెనాల్డ్స్ లెడ్ సిట్రేట్‌తో 10 నిమిషాల పాటు రంగు వేసి, మళ్ళీ H2O తో చాలాసార్లు కడిగారు. TVIPS (టీట్జ్ వీడియో అండ్ ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ సిస్టమ్) టెంక్యామ్-F416 డిజిటల్ కెమెరా (TVIPS GmbH, గౌటింగ్, USA) ను ఉపయోగించి ఫిలిప్స్ CM100 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్థమ్, MA, USA) ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్‌తో మైక్రోగ్రాఫ్‌లను తీశారు.
AAV సోకిన ఎలుకల విషయంలో, మెదడును వేరు చేసి 1 మిమీ మందంతో నిలువు కోతగా కోశారు, మరియు AAV సోకిన వలయాన్ని (అంటే, mCherryని వ్యక్తపరిచే) గుర్తించడానికి సెరెబెల్లమ్‌ను ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి పరిశీలించారు. కనీసం రెండు వరుస సెరెబెల్లార్ వలయాలలో పర్కింజే కణ పొరలో (అంటే దాదాపు మొత్తం పొరలో) AAV ఇంజెక్షన్ చాలా అధిక ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని చూపించే ప్రయోగాలను మాత్రమే ఉపయోగించారు. AAV-ట్రాన్స్‌డ్యూస్డ్ లూప్‌ను రాత్రిపూట పోస్ట్-ఫిక్సేషన్ (0.1 M కోకోయేట్ బఫర్‌లో 4% PFA మరియు 2.5% గ్లూటరాల్డిహైడ్) కోసం మైక్రోడిసెక్ట్ చేసి, తదుపరి ప్రాసెస్ చేశారు. EPON ఎంబెడింగ్ కోసం, స్థిరీకరించిన కణజాలాన్ని 0.1 M సోడియం కోకోయేట్ బఫర్ (అప్లికెమ్)తో కడిగి, 0.1 M సోడియం కోకోయేట్ బఫర్ (అప్లికెమ్)లో 2% OsO4 (os, సైన్స్ సర్వీసెస్; కాకో)తో 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆపై 2 గంటల పాటు కడిగారు. 0.1 M కోకామైడ్ బఫర్‌తో 3 సార్లు పునరావృతం చేయండి. ఆ తరువాత, కణజాలాన్ని నిర్జలీకరణం చేయడానికి, ప్రతి ఇథనాల్ ద్రావణాన్ని 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయడానికి ఇథనాల్ యొక్క ఆరోహణ శ్రేణిని ఉపయోగించారు. కణజాలాన్ని ప్రొపైలిన్ ఆక్సైడ్‌కు బదిలీ చేసి, EPON (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)లో 4°C వద్ద రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేశారు. కణజాలాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు తాజా EPONలో ఉంచి, ఆపై దానిని 62°C వద్ద 72 గంటల పాటు ఎంబెడ్ చేయండి. 70 nm అతి సన్నని సెక్షన్‌లను కత్తిరించడానికి అల్ట్రామైక్రోటోమ్ (లీకా మైక్రోసిస్టమ్స్, UC6) మరియు డైమండ్ నైఫ్ (డయాటోమ్, బీల్, స్విట్జర్లాండ్) ఉపయోగించండి, మరియు 37°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 1.5% యురేనిల్ అసిటేట్‌తో, మరియు 4 నిమిషాల పాటు లెడ్ సిట్రేట్ ద్రావణంతో స్టెయిన్ చేయండి. కెమెరా వన్‌వ్యూ 4K 16-బిట్ (Gatan) మరియు డిజిటల్‌మైక్రోగ్రాఫ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (Gatan)తో కూడిన JEM-2100 ప్లస్ ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (JEOL)ను ఉపయోగించి ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు తీయబడ్డాయి. విశ్లేషణ కోసం, ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లను 5000× లేదా 10,000× డిజిటల్ జూమ్‌తో పొందారు.
మైటోకాండ్రియా యొక్క స్వరూప విశ్లేషణ. అన్ని విశ్లేషణల కోసం, ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి డిజిటల్ చిత్రాలలో ప్రతి మైటోకాండ్రియా యొక్క ఆకృతులను చేతితో గీశారు. వివిధ స్వరూప పారామితులను విశ్లేషించారు. మైటోకాండ్రియా సాంద్రతను శాతంగా వ్యక్తపరిచారు, దీనిని ప్రతి కణం యొక్క మొత్తం మైటోకాండ్రియా వైశాల్యాన్ని కణద్రవ్య వైశాల్యంతో (కణద్రవ్య వైశాల్యం = కణ వైశాల్యం - కణ కేంద్రక వైశాల్యం) భాగించి × 100 తో గుణించడం ద్వారా పొందారు. మైటోకాండ్రియా యొక్క గుండ్రదనాన్ని [4π∙(వైశాల్యం/చుట్టుకొలత²)] అనే సూత్రంతో లెక్కించారు. మైటోకాండ్రియా యొక్క స్వరూపాన్ని విశ్లేషించి, వాటి ప్రధాన ఆకారాల ప్రకారం రెండు వర్గాలుగా (“గొట్టం వంటి” మరియు “పొక్కు వంటి”) విభజించారు.
ఆటోఫాగోసోమ్/లైసోసోమ్ సంఖ్య మరియు సాంద్రత విశ్లేషణ. డిజిటల్ చిత్రంలో ప్రతి ఆటోఫాగోసోమ్/లైసోసోమ్ యొక్క ఆకృతులను మాన్యువల్‌గా గీయడానికి ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి. ప్రతి కణం యొక్క మొత్తం ఆటోఫాగోసోమ్/లైసోసోమ్ నిర్మాణ వైశాల్యాన్ని కణద్రవ్య వైశాల్యంతో భాగించి (కణద్రవ్య వైశాల్యం = కణ వైశాల్యం - కేంద్రక వైశాల్యం) × 100 గణించడం ద్వారా ఆటోఫాగోసోమ్/లైసోసోమ్ వైశాల్యాన్ని శాతంగా వ్యక్తపరుస్తారు. మొత్తం సంఖ్యను, ప్రతి కణానికి ఉన్న ఆటోఫాగోసోమ్/లైసోసోమ్ నిర్మాణాల సంఖ్యతో (కణద్రవ్య వైశాల్యం పరంగా) భాగించడం ద్వారా ఆటోఫాగోసోమ్‌లు/లైసోసోమ్‌ల సాంద్రతను గణిస్తారు (కణద్రవ్య వైశాల్యం = కణ వైశాల్యం - కేంద్రక వైశాల్యం).
తీవ్రమైన కోత మరియు నమూనా తయారీ కోసం లేబులింగ్. గ్లూకోజ్ లేబులింగ్ అవసరమయ్యే ప్రయోగాల కోసం, తీవ్రమైన మెదడు ముక్కలను ప్రీ-ఇంక్యుబేషన్ చాంబర్‌కు బదిలీ చేయండి, ఇందులో సంతృప్త కార్బన్ (95% O2 మరియు 5% CO2), అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mOsm కు సర్దుబాటు చేయబడింది) ఉంటాయి, దీనిలో గ్లూకోజ్ 13 C 6- గ్లూకోజ్ ప్రత్యామ్నాయం (యూరిసోటాప్, కేటలాగ్ నంబర్ CLM-1396). పైరువేట్ లేబులింగ్ అవసరమయ్యే ప్రయోగాల కోసం, అక్యూట్ బ్రెయిన్ స్లైస్‌లను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 2.0mM MgCl2 కలిపి, pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320mOsm కు సర్దుబాటు చేయండి) లోకి బదిలీ చేసి, 1mM 1-[1-13C]పైరువేట్ (యూరిసోటాప్, కేటలాగ్ నంబర్ CLM-1082) ను కలపండి. సెక్షన్‌లను 37°C వద్ద 90 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రయోగం చివరిలో, సెక్షన్‌లను 75 mM అమ్మోనియం కార్బోనేట్ కలిగిన జల ద్రావణంతో (pH 7.4) త్వరగా కడిగి, ఆపై 40:40:20 (v:v:v) ఎసిటోనైట్రైల్ (ACN): మిథనాల్: నీటిలో హోమోజనైజ్ చేయండి. విభాగాలను 30 నిమిషాల పాటు మంచు మీద పొదిగిన తర్వాత, నమూనాలను 4°C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 21,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు, మరియు స్పష్టమైన సూపర్నాటెంట్‌ను స్పీడ్‌వ్యాక్ కాన్సెంట్రేటర్‌లో ఎండబెట్టారు. ఫలితంగా వచ్చిన ఎండిన మెటబొలైట్ పెల్లెట్‌ను విశ్లేషణ చేసే వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
13 C-లేబుల్ చేయబడిన అమైనో ఆమ్లాల ద్రవ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ విశ్లేషణ. ద్రవ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) విశ్లేషణ కోసం, మెటబొలైట్ పెల్లెట్‌ను 75μl LC-MS గ్రేడ్ నీటిలో (హనీవెల్) తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు. 4°C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు 21,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేసిన తర్వాత, స్పష్టమైన సూపర్నాటెంట్ నుండి 20 μl ను అమైనో ఆమ్ల ఫ్లక్స్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించారు, అయితే మిగిలిన సారాన్ని వెంటనే ఆనయాన్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించారు (క్రింద చూడండి). ఇంతకు ముందు వివరించిన బెంజోయిల్ క్లోరైడ్ డెరివేటైజేషన్ ప్రోటోకాల్ (55, 56) ఉపయోగించి అమైనో ఆమ్ల విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. మొదటి దశలో, 20μl మెటబొలైట్ సారానికి 10μl 100 mM సోడియం కార్బోనేట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) జోడించబడింది, ఆపై LC గ్రేడ్ ACN కి 10μl 2% బెంజోయిల్ క్లోరైడ్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) జోడించబడింది. నమూనాను క్లుప్తంగా వోర్టెక్స్ చేసి, ఆపై 20°C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు 21,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. శుద్ధి చేసిన సూపర్నాటెంట్‌ను శంఖాకార గాజు ఇన్సర్ట్ (200 μl పరిమాణం) ఉన్న 2 ml ఆటోశాంప్లర్ వయల్‌లోకి బదిలీ చేయండి. నమూనాలను Q-ఎక్సాక్టివ్ (QE)-HF (అల్ట్రా హై ఫీల్డ్ ఆర్బిట్రాప్) హై-రిజల్యూషన్ ప్రెసిషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)కు అనుసంధానించబడిన అక్విటీ ఐక్లాస్ అల్ట్రా-హై పర్ఫార్మెన్స్ LC సిస్టమ్ (వాటర్స్) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. విశ్లేషణ కోసం, 1.8μm కణాలను కలిగి ఉన్న 100×1.0 mm హై-స్ట్రెంత్ సిలికా T3 కాలమ్ (వాటర్స్)లోకి 2μl డెరివటైజ్డ్ నమూనాను ఇంజెక్ట్ చేశారు. ప్రవాహ రేటు 100μl/min, మరియు బఫర్ సిస్టమ్‌లో బఫర్ A (నీటిలో 10 mM అమ్మోనియం ఫార్మేట్ మరియు 0.15% ఫార్మిక్ యాసిడ్) మరియు బఫర్ B (ACN) ఉంటాయి. ప్రవణత ఈ క్రింది విధంగా ఉంది: 0 నిమిషాల వద్ద 0%B; 0 నుండి 0.1 నిమిషాల వద్ద 0%B. 0 నుండి 15% B; 0.1 నుండి 0.5 నిమిషాల వద్ద 15 నుండి 17% B; 0.5 నుండి 14 నిమిషాల వద్ద 17 నుండి 55% B; 14 నుండి 14.5 నిమిషాల వద్ద 55 నుండి 70% B; 18 నిమిషాల వద్ద 14.5 నుండి 70 నుండి 100% B; 18 నుండి 19 నిమిషాల వద్ద 100% B; 19 నుండి 19.1 నిమిషాల వద్ద 100 నుండి 0% B; 19.1 నుండి 28 నిమిషాల వద్ద 0% B (55, 56). QE-HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ 50 నుండి 750 వరకు m/z (ద్రవ్యరాశి/ఆవేశ నిష్పత్తి) ద్రవ్యరాశి పరిధితో పాజిటివ్ అయనైజేషన్ మోడ్‌లో పనిచేస్తుంది. అనువర్తిత రిజల్యూషన్ 60,000, మరియు పొందిన గెయిన్ కంట్రోల్ (AGC) అయాన్ టార్గెట్ 3×10⁶, మరియు గరిష్ట అయాన్ సమయం 100 మిల్లీసెకన్లు. హీటెడ్ ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనైజేషన్ (ESI) సోర్స్ 3.5 kV స్ప్రే వోల్టేజ్, 250°C కేశనాళిక ఉష్ణోగ్రత, 60 AU (ఆర్బిటరీ యూనిట్లు) షీత్ ఎయిర్‌ఫ్లో, మరియు 20 AU సహాయక ఎయిర్‌ఫ్లో వద్ద పనిచేస్తుంది. S లెన్స్ 60 AUకి సెట్ చేయబడింది.
13C లేబుల్ చేయబడిన సేంద్రీయ ఆమ్లాల యొక్క ఆనయాన్ క్రోమాటోగ్రఫీ-MS విశ్లేషణ. మిగిలిన మెటబొలైట్ అవక్షేపాన్ని (55μl) QE-HF మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)కు అనుసంధానించబడిన డయోనెక్స్ అయాన్ క్రోమాటోగ్రఫీ సిస్టమ్ (ICS 5000+, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, 5μl మెటబొలైట్ సారాన్ని, HPLC (2 mm×250 mm, పార్టికల్ సైజు 4μm, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) అమర్చిన డయోనెక్స్ అయాన్‌ప్యాక్ AS11-HC కాలమ్‌లోకి, 1:1 ఫిల్లింగ్ నిష్పత్తితో పుష్-ఇన్ పార్షియల్ లూప్ మోడ్‌లో ఇంజెక్ట్ చేశారు. డయోనెక్స్ అయాన్‌ప్యాక్ AG11-HC గార్డ్ కాలమ్ (2 mm x 50 mm, 4μm, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్). కాలమ్ ఉష్ణోగ్రతను 30°C వద్ద, మరియు ఆటోశాంప్లర్‌ను 6°C వద్ద సెట్ చేసి నిర్వహించారు. ఎలుయెంట్ జనరేటర్ ద్వారా పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్ గ్రేడియంట్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, డీయోనైజ్డ్ నీటితో అందించబడిన పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్ కార్ట్రిడ్జ్‌ను ఉపయోగించారు. 380μl/min ప్రవాహ రేటు వద్ద, ఈ క్రింది గ్రేడియంట్‌ను వర్తింపజేస్తూ జీవక్రియా ఉత్పత్తులను వేరుచేయడం జరిగింది: 0 నుండి 3 నిమిషాల వరకు, 10 mM KOH; 3 నుండి 12 నిమిషాల వరకు, 10 నుండి 50 mM KOH; 12 నుండి 19 నిమిషాల వరకు, 50 నుండి 100 mM KOH; 19 నుండి 21 నిమిషాల వరకు, 100 mM KOH; 21 నుండి 21.5 నిమిషాల వరకు, 100 నుండి 10 mM KOH. కాలమ్‌ను 8.5 నిమిషాల పాటు 10 mM KOH కింద తిరిగి సమతుల్యం చేయడం జరిగింది.
కాలమ్ తర్వాత, వెలువడిన జీవక్రియా ఉత్పన్నాలను నిమిషానికి 150μl ఐసోప్రొపనాల్ అనుబంధ ప్రవాహంతో కలిపి, ఆపై నెగటివ్ అయనీకరణ మోడ్‌లో పనిచేసే అధిక-రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌కు పంపబడతాయి. MS, 60,000 రిజల్యూషన్‌తో m/z 50 నుండి 750 వరకు ఉన్న ద్రవ్యరాశి పరిధిని పర్యవేక్షిస్తుంది. AGC 1×10⁶ కు సెట్ చేయబడింది మరియు గరిష్ట అయాన్ సమయం 100 ms వద్ద ఉంచబడింది. వేడిచేసిన ESI సోర్స్ 3.5 kV స్ప్రే వోల్టేజ్ వద్ద పనిచేసింది. అయాన్ సోర్స్ యొక్క ఇతర సెట్టింగ్‌లు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి: కేశనాళిక ఉష్ణోగ్రత 275°C; షీత్ గ్యాస్ ప్రవాహం, 60 AU; సహాయక గ్యాస్ ప్రవాహం, 300°C వద్ద 20 AU, మరియు S లెన్స్ సెట్టింగ్ 60 AU.
13C లేబుల్ చేయబడిన జీవక్రియల డేటా విశ్లేషణ. ఐసోటోప్ నిష్పత్తి యొక్క డేటా విశ్లేషణ కోసం ట్రేస్‌ఫైండర్ సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 4.2, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించండి. ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క గుర్తింపు విశ్వసనీయమైన రిఫరెన్స్ సమ్మేళనం ద్వారా ధృవీకరించబడింది మరియు స్వతంత్రంగా విశ్లేషించబడింది. ఐసోటోప్ సుసంపన్నత విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి, ప్రతి 13C ఐసోటోప్ (Mn) యొక్క ఎక్స్‌ట్రాక్టెడ్ అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ (XIC) యొక్క ప్రాంతం [M + H]+ నుండి సంగ్రహించబడింది, ఇక్కడ n అనేది లక్ష్య సమ్మేళనం యొక్క కార్బన్ సంఖ్య, ఇది అమైనో ఆమ్లాలను విశ్లేషించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది లేదా [MH]+ అయాన్‌లను విశ్లేషించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది. XIC యొక్క ద్రవ్యరాశి ఖచ్చితత్వం మిలియన్‌కు ఐదు భాగాల కంటే తక్కువ, మరియు RT యొక్క ఖచ్చితత్వం 0.05 నిమిషాలు. సుసంపన్నత విశ్లేషణ అనేది గుర్తించబడిన ప్రతి ఐసోటోప్ యొక్క నిష్పత్తిని సంబంధిత సమ్మేళనం యొక్క అన్ని ఐసోటోప్‌ల మొత్తానికి లెక్కించడం ద్వారా నిర్వహించబడుతుంది. ఈ నిష్పత్తులు ప్రతి ఐసోటోప్‌కు శాతం విలువలుగా ఇవ్వబడ్డాయి మరియు ఫలితాలు గతంలో వివరించిన విధంగా (42) మోలార్ పర్సెంట్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ (MPE)గా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి.
ఘనీభవించిన న్యూరాన్ పెల్లెట్‌ను ఐస్-కోల్డ్ 80% మెథనాల్ (v/v)లో హోమోజనైజ్ చేసి, వోర్టెక్స్ చేసి, -20°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. నమూనాను మళ్ళీ వోర్టెక్స్ చేసి, +4°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు కదిలించండి. నమూనాను 4°C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు 21,000 g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు, ఆ తర్వాత వచ్చిన సూపర్నాటెంట్‌ను సేకరించి, తదుపరి విశ్లేషణ కోసం 25°C వద్ద స్పీడ్‌వ్యాక్ కాన్సెంట్రేటర్‌ను ఉపయోగించి ఎండబెట్టారు. పైన వివరించిన విధంగా, క్రమబద్ధీకరించిన కణాల అమైనో ఆమ్లాలపై LC-MS విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. ట్రేస్‌ఫైండర్ (వెర్షన్ 4.2, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి, ప్రతి సమ్మేళనం యొక్క మోనోఐసోటోపిక్ ద్రవ్యరాశిని ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. ప్రీప్రాసెస్‌కోర్ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (57)ని ఉపయోగించి మెటబొలైట్ డేటా యొక్క క్వాంటైల్ నార్మలైజేషన్ నిర్వహించబడింది.
ముక్కల తయారీ. ఎలుకకు కార్బన్ డయాక్సైడ్‌తో త్వరగా మత్తు ఇచ్చి, తల నరికారు, పుర్రె నుండి మెదడును త్వరగా తీసివేసి, మంచుతో నింపిన వైబ్రేటింగ్ కత్తిని (HM-650 V, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్‌డార్ఫ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి దానిని 300 నుండి 375 μm సాజిటల్ విభాగాలుగా కత్తిరించారు. కోల్డ్ కార్బన్ గ్యాసిఫికేషన్ (95% O2 మరియు 5% CO2) తక్కువ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 1.0 mM CaCl2 మరియు 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 మరియు 310 నుండి 330 mOsm కు సర్దుబాటు చేయండి). పొందిన మెదడు ముక్కలను అధిక Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM సోడియం ఫాస్ఫేట్ బఫర్, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-గ్లూకోజ్, 4.0 mM CaCl2 మరియు 3.5 mM MgCl2) pH 7.4 మరియు 310 నుండి 320 mOsm ఉన్న చాంబర్‌లోకి బదిలీ చేయండి. రికార్డింగ్‌కు ముందు వాటిని పునరుద్ధరించడానికి వీలుగా ముక్కలను 20 నుండి 30 నిమిషాల పాటు నిల్వ చేయండి.
రికార్డింగ్. అన్ని రికార్డింగ్‌ల కోసం, ఒక స్థిరమైన రికార్డింగ్ చాంబర్ మరియు 20x వాటర్ ఇమ్మర్షన్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (సైంటిఫికా) అమర్చిన మైక్రోస్కోప్ స్టేజ్‌ను ఉపయోగించారు. పుర్కింజే కణాలుగా భావించబడుతున్న వాటిని (i) వాటి శరీర పరిమాణం, (ii) సెరెబెల్లమ్‌లోని శరీర నిర్మాణ స్థానం, మరియు (iii) ఫ్లోరోసెంట్ mtYFP రిపోర్టర్ జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా గుర్తించారు. 5 నుండి 11 మెగాఓమ్‌ల కొన నిరోధకత కలిగిన ప్యాచ్ పైపెట్‌ను, ఒక బోరోసిలికేట్ గ్లాస్ కేశనాళిక (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, సైన్స్ ప్రొడక్ట్స్, హోఫ్‌హీమ్, జర్మనీ) మరియు ఒక క్షితిజ సమాంతర పైపెట్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్ (P-1000, సట్టర్), నోవాటో, CA) ఉపయోగించి బయటకు లాగారు. అన్ని రికార్డింగ్‌లను ELC-03XS npi ప్యాచ్ క్లాంప్ యాంప్లిఫైయర్ (npi ఎలక్ట్రానిక్ GmbH, టామ్, జర్మనీ) ద్వారా నిర్వహించారు, దీనిని సిగ్నల్ సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 6.0, కేంబ్రిడ్జ్ ఎలక్ట్రానిక్, కేంబ్రిడ్జ్, UK) ద్వారా నియంత్రించారు. ఈ ప్రయోగాన్ని 12.5 kHz శాంప్లింగ్ రేటు వద్ద రికార్డ్ చేశారు. సిగ్నల్‌ను వరుసగా 1.3 మరియు 10 kHz కటాఫ్ ఫ్రీక్వెన్సీలు గల రెండు షార్ట్-పాస్ బెసెల్ ఫిల్టర్‌లతో ఫిల్టర్ చేయబడింది. యాంప్లిఫయర్‌ను ఉపయోగించే కాంపెన్సేషన్ సర్క్యూట్ ద్వారా మెంబ్రేన్ మరియు పైపెట్ యొక్క కెపాసిటెన్స్ భర్తీ చేయబడింది. అన్ని ప్రయోగాలు ఓర్కా-ఫ్లాష్ 4.0 కెమెరా (హమామాట్సు, గెర్డెన్, జర్మనీ) నియంత్రణలో జరిగాయి, దీనిని హోకావో సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 2.8, హమామాట్సు, గెర్డెన్, జర్మనీ) ద్వారా నియంత్రించారు.
సాధారణ సంపూర్ణ-కణ ఆకృతీకరణ మరియు విశ్లేషణ. రికార్డింగ్ చేయడానికి సరిగ్గా ముందు, పైపెట్‌ను ఈ క్రింది పదార్థాలు కలిగిన అంతర్గత ద్రావణంతో నింపండి: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM పొటాషియం గ్లూకోనేట్, 10.0 mM హెపెస్, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM గ్వానోసిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (GTP) (Na) మరియు 10.0 mM క్రియాటినిన్ ఫాస్ఫేట్. వీటి pH 7.25కు సర్దుబాటు చేయబడింది, మరియు ద్రవాభిసరణ పీడనం 290 mOsm (సుక్రోజ్)గా ఉంది. పొరను పగలగొట్టడానికి 0 pA బలాన్ని ప్రయోగించిన వెంటనే, విశ్రాంతి పొర పొటెన్షియల్‌ను కొలిచారు. -40, -30, -20, మరియు -10 pAల హైపర్‌పోలరైజ్డ్ కరెంట్‌లను ప్రయోగించడం ద్వారా ఇన్‌పుట్ రెసిస్టెన్స్‌ను కొలుస్తారు. వోల్టేజ్ ప్రతిస్పందన యొక్క పరిమాణాన్ని కొలిచి, ఇన్‌పుట్ రెసిస్టెన్స్‌ను లెక్కించడానికి ఓమ్ నియమాన్ని ఉపయోగించండి. స్వచ్ఛంద చర్యను 5 నిమిషాల పాటు వోల్టేజ్ క్లాంప్‌లో రికార్డ్ చేశారు, మరియు సెమీ-ఆటోమేటిక్ రికగ్నిషన్ స్క్రిప్ట్‌ను ఉపయోగించి ఇగోర్ ప్రో (వెర్షన్ 32 7.01, వేవ్‌మెట్రిక్స్, లేక్ ఓస్వెగో, ఒరెగాన్, USA)లో sPSCని గుర్తించి కొలిచారు. IV కర్వ్ మరియు స్టెడీ-స్టేట్ కరెంట్‌ను, బ్యాటరీని వివిధ పొటెన్షియల్స్ వద్ద (-110 mV నుండి మొదలుపెట్టి) క్లాంప్ చేసి, వోల్టేజ్‌ను 5 mV స్టెప్స్‌లో పెంచడం ద్వారా కొలుస్తారు. డీపోలరైజింగ్ కరెంట్‌ను ప్రయోగించడం ద్వారా AP ఉత్పత్తిని పరీక్షించారు. డీపోలరైజింగ్ కరెంట్ పల్స్‌ను ప్రయోగిస్తూ సెల్‌ను -70 mV వద్ద క్లాంప్ చేయండి. ప్రతి రికార్డింగ్ యూనిట్ యొక్క స్టెప్ సైజ్‌ను విడివిడిగా (10 నుండి 60 pA) సర్దుబాటు చేయండి. అత్యధిక AP ఫ్రీక్వెన్సీకి కారణమయ్యే పల్స్ స్పైక్‌లను మాన్యువల్‌గా లెక్కించడం ద్వారా గరిష్ట AP ఫ్రీక్వెన్సీని గణించండి. ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ APలను మొదట ప్రేరేపించే డీపోలరైజేషన్ పల్స్ యొక్క రెండవ డెరివేటివ్‌ను ఉపయోగించి AP థ్రెషోల్డ్‌ను విశ్లేషిస్తారు.
పెర్ఫోరేటెడ్ ప్యాచ్ కాన్ఫిగరేషన్ మరియు విశ్లేషణ. ప్రామాణిక ప్రోటోకాల్‌లను ఉపయోగించి పెర్ఫోరేటెడ్ ప్యాచ్ రికార్డింగ్‌ను నిర్వహించండి. కింది పదార్థాలు లేని ATP మరియు GTP-రహిత పైపెట్‌ను ఉపయోగించండి: 128 mM గ్లూకోనేట్ K, 10 mM KCl, 10 mM హెపెస్, 0.1 mM EGTA మరియు 2 mM MgCl2, మరియు pH 7.2కి సర్దుబాటు చేయండి (KOH ఉపయోగించి). కణ త్వచం యొక్క అనియంత్రిత పారగమ్యతను నివారించడానికి ఇంట్రాసెల్యులార్ ద్రావణం నుండి ATP మరియు GTP తొలగించబడతాయి. పెర్ఫోరేటెడ్ ప్యాచ్ యొక్క రికార్డును పొందడానికి, ప్యాచ్ పైపెట్‌ను ఆంఫోటెరిసిన్-కలిగిన అంతర్గత ద్రావణంతో (సుమారు 200 నుండి 250 μg/ml; G4888, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) నింపాలి. ఆంఫోటెరిసిన్‌ను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్‌లో (తుది గాఢత: 0.1 నుండి 0.3%; DMSO; D8418, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) కరిగించారు. ఉపయోగించిన DMSO గాఢత అధ్యయనం చేసిన న్యూరాన్‌లపై ఎటువంటి గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపలేదు. పంచింగ్ ప్రక్రియ సమయంలో, ఛానల్ రెసిస్టెన్స్ (Ra) ని నిరంతరం పర్యవేక్షించారు, మరియు Ra మరియు AP యొక్క వ్యాప్తి స్థిరపడిన తర్వాత (20-40 నిమిషాలు) ప్రయోగాన్ని ప్రారంభించారు. 2 నుండి 5 నిమిషాల పాటు వోల్టేజ్ మరియు/లేదా కరెంట్ క్లాంప్‌లో స్పాంటేనియస్ యాక్టివిటీని కొలుస్తారు. డేటా విశ్లేషణను ఇగోర్ ప్రో (వెర్షన్ 7.05.2, వేవ్‌మెట్రిక్స్, USA), ఎక్సెల్ (వెర్షన్ 2010, మైక్రోసాఫ్ట్ కార్పొరేషన్, రెడ్‌మండ్, USA) మరియు గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం (వెర్షన్ 8.1.2, గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ సాఫ్ట్‌వేర్ ఇంక్., లా జోల్లా, CA, యునైటెడ్ స్టేట్స్) ఉపయోగించి నిర్వహించారు. స్పాంటేనియస్ APలను గుర్తించడానికి, ఇగోర్‌ప్రో యొక్క న్యూరోమాటిక్ v3.0c ప్లగ్-ఇన్‌ను ఉపయోగిస్తారు. ప్రతి రికార్డుకు వ్యక్తిగతంగా సర్దుబాటు చేయబడిన ఒక నిర్దిష్ట థ్రెషోల్డ్‌ను ఉపయోగించి APలను స్వయంచాలకంగా గుర్తిస్తుంది. స్పైక్ ఇంటర్వెల్‌ను ఉపయోగించి, గరిష్ట తక్షణ స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు సగటు స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీతో స్పైక్ ఫ్రీక్వెన్సీని నిర్ధారిస్తుంది.
PN ఐసోలేషన్. గతంలో ప్రచురించిన ప్రోటోకాల్‌కు అనుగుణంగా, ఒక నిర్దిష్ట దశలో (58) మౌస్ సెరెబెల్లమ్ నుండి PNలను శుద్ధి చేశారు. క్లుప్తంగా, సెరెబెల్లమ్‌ను ఐస్-కోల్డ్ డిస్సోసియేషన్ మీడియంలో [HBSS Ca2+ మరియు Mg2+ లేకుండా, 20 mM గ్లూకోజ్, పెన్సిలిన్ (50 U/ml) మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml)తో కలిపి] విడదీసి, ముక్కలు చేశారు, ఆపై పాపైన్‌లో [HBSS, 1-సిస్టీన్·HCl (1 mg/ml), పాపైన్ (16 U/ml) మరియు డియోక్సిరిబోన్యూక్లియేస్ I (DNase I; 0.1 mg/ml)తో కలిపి] మీడియంను 30°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు జీర్ణం చేశారు. మొదట ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియను నివారించడానికి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద గుడ్డు శ్లేష్మం (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) మరియు DNase (0.1 mg/ml) కలిగిన HBSS మాధ్యమంలో కణజాలాలను కడగాలి, ఆపై 20 mM గ్లూకోజ్, పెన్సిలిన్ (50 U/ml), స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml) మరియు DNase (0.1 mg/ml) కలిగిన HBSS మాధ్యమంలో మెల్లగా రుబ్బి ఏక కణాలను విడుదల చేయాలి. ఫలితంగా వచ్చిన కణ సస్పెన్షన్‌ను 70μm కణ జల్లెడ ద్వారా వడపోసి, ఆపై సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (1110 rpm, 5 నిమిషాలు, 4°C) ద్వారా కణాలను పెల్లెట్ చేసి, సార్టింగ్ మాధ్యమంలో [HBSS, 20 mM గ్లూకోజ్, 20% ఫీటల్ బోవైన్ సీరం, పెన్సిలిన్ (50 U/ml) మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (0.05 mg/ml) కలిపినది] తిరిగి సస్పెండ్ చేయాలి; ప్రొపిడియం అయోడైడ్‌తో కణాల జీవశక్తిని అంచనా వేసి, కణ సాంద్రతను 1×10⁶ నుండి 2×10⁶ కణాలు/ml కు సర్దుబాటు చేయండి. ఫ్లో సైటోమెట్రీకి ముందు, సస్పెన్షన్‌ను 50 μm సెల్ స్ట్రైనర్ ద్వారా వడపోశారు.
ఫ్లో సైటోమీటర్. FACSAria III యంత్రం (BD బయోసైన్సెస్) మరియు FACSDiva సాఫ్ట్‌వేర్ (BD బయోసైన్సెస్, వెర్షన్ 8.0.1) ఉపయోగించి 4°C వద్ద కణాల వర్గీకరణ జరిగింది. కణ సస్పెన్షన్‌ను 100 μm నాజిల్ ఉపయోగించి 20 psi పీడనం వద్ద సెకనుకు ~2800 ఈవెంట్ల రేటుతో వర్గీకరించారు. సాంప్రదాయ గేటింగ్ ప్రమాణాలు (కణ పరిమాణం, బైమోడల్ వివక్షత, మరియు స్కాటరింగ్ లక్షణాలు) ఇతర కణ రకాల నుండి PN యొక్క సరైన ఐసోలేషన్‌ను నిర్ధారించలేవు కాబట్టి, mitoYFP+ ​​మరియు కంట్రోల్ mitoYFP − ఎలుకలలో YFP తీవ్రత మరియు ఆటోఫ్లోరోసెన్స్ యొక్క ప్రత్యక్ష పోలిక ఆధారంగా గేటింగ్ వ్యూహాన్ని సెట్ చేశారు. నమూనాపై 488 nm లేజర్ లైన్‌ను ప్రసరింపజేయడం ద్వారా YFP ఉత్తేజితం చేయబడింది, మరియు సిగ్నల్ 530/30 nm బ్యాండ్ పాస్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించి గుర్తించబడింది. mitoYFP+ ​​ఎలుకలలో, న్యూరాన్ యొక్క ప్రధాన భాగం మరియు ఆక్సాన్ శకలాలను వేరు చేయడానికి, Rosa26-mitoYFP రిపోర్టర్ జన్యువు యొక్క సాపేక్ష బలాన్ని కూడా ఉపయోగిస్తారు. చనిపోయిన కణాలను మినహాయించడానికి, 7-AADను 561 nm పసుపు లేజర్‌తో ఉత్తేజపరిచి, 675/20 nm బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌తో గుర్తిస్తారు. అదే సమయంలో ఆస్ట్రోసైట్‌లను వేరు చేయడానికి, కణ సస్పెన్షన్‌కు ACSA-2-APCతో రంగు వేసి, ఆ తర్వాత నమూనాపై 640 nm లేజర్ రేఖను ప్రసరింపజేసి, సిగ్నల్‌ను గుర్తించడానికి 660/20 nm బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించారు.
సేకరించిన కణాలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (1110 rpm, 5 నిమిషాలు, 4°C) ద్వారా పెల్లెట్ చేసి, ఉపయోగించే వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేశారు. విధానపరమైన వైవిధ్యాలను తగ్గించడానికి Mfn2cKO ఎలుకలను మరియు వాటి పిల్లలను ఒకే రోజున వర్గీకరించారు. FACS డేటా ప్రదర్శన మరియు విశ్లేషణను ఫ్లోజో సాఫ్ట్‌వేర్ (ఫ్లోజో LLC, ఆష్లాండ్, ఒరెగాన్, USA) ఉపయోగించి నిర్వహించారు.
పైన పేర్కొన్న విధంగా (59), తదుపరి mtDNA పరిమాణీకరణ కోసం క్రమబద్ధీకరించిన న్యూరాన్‌ల నుండి DNAను వేరుచేయడానికి రియల్-టైమ్ PCR ఉపయోగించబడుతుంది. ప్రారంభంలో, వివిధ సంఖ్యలో కణాలపై qPCRను అమలు చేయడం ద్వారా సరళత మరియు థ్రెషోల్డ్ సున్నితత్వం పరీక్షించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, 50 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% ట్వీన్ 20 మరియు ప్రోటీనేస్ K (200 ng/ml) కలిగి ఉన్న లైసిస్ బఫర్‌లో 300 PNలను సేకరించి, 55°C వద్ద 120 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేయండి. ప్రోటీనేస్ K యొక్క పూర్తి నిష్క్రియాశీలతను నిర్ధారించడానికి కణాలను 95°C వద్ద 10 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. mt-Nd1కు ప్రత్యేకమైన టాక్‌మాన్ ప్రోబ్ (థర్మో ఫిషర్) ఉపయోగించి, 7900HT రియల్-టైమ్ PCR సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)లో సెమీ-క్వాంటిటేటివ్ PCR ద్వారా mtDNA కొలవబడింది. సైన్స్, కేటలాగ్ నంబర్ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ AIVI3E8) మరియు 18S (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ Hs99999901_s1) జన్యువులు.
ప్రోటియోమ్ నమూనా తయారీ. ద్రావణాన్ని 95°C వద్ద 10 నిమిషాల పాటు వేడి చేసి, లైసిస్ బఫర్‌లో [6 M గ్వానిడిన్ క్లోరైడ్, 10 mM ట్రైస్(2-కార్బాక్సీఇథైల్) ఫాస్ఫిన్ హైడ్రోక్లోరైడ్, 10 mM క్లోరోఅసిటమైడ్ మరియు 100 mM ట్రైస్-HClలో ఘనీభవించిన న్యూరాన్ పెల్లెట్‌లను లైజ్ చేయండి] సోనికేట్ చేయడం ద్వారా, బయోరప్టర్ (డయాజెనోడ్) మీద 10 నిమిషాల పాటు (30 సెకన్ల పల్స్ / 30 సెకన్ల విరామ సమయం) ఉంచారు. నమూనాను 20 mM ట్రైస్-HCl (pH 8.0)లో 1:10 నిష్పత్తిలో పలుచగా చేసి, 300 ng ట్రిప్సిన్ గోల్డ్ (ప్రోమెగా)తో కలిపి, పూర్తి జీర్ణక్రియను సాధించడానికి 37°C వద్ద రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేశారు. రెండవ రోజు, నమూనాను 20,000 g వద్ద 20 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సూపర్‌నాటెంట్‌ను 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌తో పలుచగా చేసి, స్వయంగా తయారు చేసుకున్న స్టేజ్‌టిప్స్‌తో ద్రావణం నుండి లవణాలను తొలగించారు. నమూనాను స్పీడ్‌వ్యాక్ పరికరంలో (ఎప్పెండార్ఫ్ కాన్సెంట్రేటర్ ప్లస్ 5305) 45°C వద్ద ఎండబెట్టారు, ఆ తర్వాత పెప్టైడ్‌ను 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లంలో సస్పెండ్ చేశారు. అన్ని నమూనాలను ఒకే వ్యక్తి ఏకకాలంలో తయారుచేశారు. ఆస్ట్రోసైట్ నమూనాలను విశ్లేషించడానికి, 4 μg డీసాల్టెడ్ పెప్టైడ్‌లను 1:20 పెప్టైడ్ మరియు TMT రియేజెంట్ నిష్పత్తిలో టాండెమ్ మాస్ ట్యాగ్ (TMT10plex, కేటలాగ్ నంబర్ 90110, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్)తో లేబుల్ చేశారు. TMT లేబులింగ్ కోసం, 0.8 mg TMT రియేజెంట్‌ను 70 μl నిర్జల ACNలో తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు, మరియు ఎండబెట్టిన పెప్టైడ్‌ను 9 μl 0.1 M TEAB (ట్రైఇథైలమోనియం బైకార్బోనేట్)లోకి పునఃసంయోజనం చేశారు, దీనికి ACNలోని 7 μl TMT రియేజెంట్‌ను కలిపారు. గాఢత 43.75%గా ఉంది. 60 నిమిషాల ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత, 2 μl 5% హైడ్రాక్సిలమైన్‌తో చర్యను నిలిపివేశారు. లేబుల్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను సేకరించి, ఆరబెట్టి, 200μl 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం (FA)లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, రెండు భాగాలుగా విభజించి, ఆపై స్వయంగా తయారు చేసుకున్న స్టేజ్‌టిప్స్‌ను ఉపయోగించి డీసాల్ట్ చేశారు. అల్టిమేట్ 3000 అల్ట్రా హై పర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రాఫ్ (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph)ను ఉపయోగించి, ఆ రెండు భాగాలలో ఒకదానిని 130Å1.7μm C18 కణాలతో (వాటర్స్, కేటలాగ్ నం. SKU: 186006935) నింపిన 1mm x 150mm అక్విటీ క్రోమాటోగ్రాఫిక్ కాలమ్‌పై ఫ్రాక్షనేట్ చేశారు. థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్). పెప్టైడ్‌లను 30μl/min ప్రవాహ రేటుతో వేరు చేయండి, 1% నుండి 50% బఫర్ B కి 85 నిమిషాల పాటు, 96 నిమిషాల స్టెప్‌వైజ్ గ్రేడియంట్‌తో, 50% నుండి 95% బఫర్ B కి 3 నిమిషాలు, ఆపై 95% బఫర్ B కి 8 నిమిషాలు వేరు చేయండి; బఫర్ A అనేది 5% ACN మరియు 10 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ (ABC), మరియు బఫర్ B అనేది 80% ACN మరియు 10 mM ABC. ప్రతి 3 నిమిషాలకు ఫ్రాక్షన్‌లను సేకరించి, వాటిని రెండు గ్రూపులుగా (1 + 17, 2 + 18, మొదలైనవి) కలిపి, వాక్యూమ్ సెంట్రిఫ్యూజ్‌లో ఆరబెట్టండి.
LC-MS/MS విశ్లేషణ. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ కోసం, పెప్టైడ్‌లను (సంఖ్య r119.aq) 1.9 μm రెప్రోసిల్-ప్యూర్ 120 C18-AQ మీడియం (డా. మైష్, మ్యాట్) అమర్చిన 25 సెం.మీ, 75 μm లోపలి వ్యాసం గల పికోఫ్రిట్ అనలిటికల్ కాలమ్ (కొత్త ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్, పార్ట్ నంబర్ PF7508250) పై వేరు చేశారు. దీనికోసం ఈజీ-nLC 1200 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, జర్మనీ) ను ఉపయోగించారు. కాలమ్‌ను 50°C వద్ద ఉంచారు. బఫర్లు A మరియు B వరుసగా నీటిలో 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం మరియు 80% ACNలో 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం. పెప్టైడ్‌లను 65 నిమిషాల పాటు 6% నుండి 31% బఫర్ B వరకు మరియు 5 నిమిషాల పాటు 31% నుండి 50% బఫర్ B వరకు 200 nl/min స్టెప్‌వైజ్ గ్రేడియంట్‌తో వేరు చేశారు. వెలువడిన పెప్టైడ్‌లను ఆర్బిట్రాప్ ఫ్యూజన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై విశ్లేషించారు. పెప్టైడ్ ప్రికర్సర్ m/z కొలతను 350 నుండి 1500 m/z పరిధిలో 120,000 రిజల్యూషన్‌తో నిర్వహిస్తారు. 27% సాధారణీకరించిన కొలిజన్ శక్తిని ఉపయోగించి, హై ఎనర్జీ C ట్రాప్ డిసోసియేషన్ (HCD) క్లీవేజ్ కోసం 2 నుండి 6 చార్జ్ స్టేట్ ఉన్న అత్యంత బలమైన ప్రికర్సర్‌ను ఎంపిక చేస్తారు. సైకిల్ సమయాన్ని 1 సెకనుకు సెట్ చేశారు. పెప్టైడ్ ఫ్రాగ్మెంట్ యొక్క m/z విలువను అయాన్ ట్రాప్‌లో అతి చిన్న 5×10⁴ AGC టార్గెట్ మరియు 86 ms గరిష్ట ఇంజెక్షన్ సమయాన్ని ఉపయోగించి కొలిచారు. ఫ్రాగ్మెంటేషన్ తర్వాత, ప్రికర్సర్‌ను 45 సెకన్ల పాటు డైనమిక్ ఎక్స్‌క్లూజన్ జాబితాలో ఉంచారు. TMT-లేబుల్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను 50 సెం.మీ, 75 μm అక్లెయిమ్ పెప్‌మ్యాప్ కాలమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కేటలాగ్ నంబర్ 164942) పై వేరుచేయగా, వాటి మైగ్రేషన్ స్పెక్ట్రాలను ఆర్బిట్రాప్ లూమోస్ ట్రైబ్రిడ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై విశ్లేషించారు. ఈ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లో హై-ఫీల్డ్ అసిమెట్రిక్ వేవ్‌ఫార్మ్ అయాన్స్ (FAIMS) పరికరాలు (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) అమర్చబడి ఉన్నాయి మరియు ఇది −50 మరియు −70 V అనే రెండు కాంపెన్సేషన్ వోల్టేజ్‌ల వద్ద పనిచేస్తుంది. TMT రిపోర్ట్ అయాన్ సిగ్నల్ కొలత కోసం, సింక్రొనైజేషన్ ప్రికర్సర్ ఆధారంగా ఎంపిక చేయబడిన MS3ని ఉపయోగించారు. పెప్టైడ్ వేరుచేయడాన్ని EASY-nLC 1200 పై, 90% లీనియర్ గ్రేడియంట్ ఎల్యూషన్‌ను ఉపయోగించి, 6% నుండి 31% వరకు బఫర్ గాఢతతో నిర్వహించారు; బఫర్ A 0.1% FA కాగా, బఫర్ B 0.1% FA మరియు 80% ACNగా ఉంది. ఈ విశ్లేషణాత్మక కాలమ్‌ను 50°C వద్ద ఆపరేట్ చేశారు. FAIMS పరిహార వోల్టేజ్ ప్రకారం అసలు ఫైల్‌ను విభజించడానికి ఫ్రీస్టైల్ (వెర్షన్ 1.6, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ను ఉపయోగించండి.
ప్రోటీన్ గుర్తింపు మరియు పరిమాణ నిర్ధారణ. సమీకృత ఆండ్రోమెడా సెర్చ్ ఇంజిన్‌ను ఉపయోగించి, అసలు డేటాను మాక్స్‌క్వాంట్ వెర్షన్ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ద్వారా విశ్లేషించడం జరిగింది. ఏక్వోరియా విక్టోరియా నుండి పొందిన క్రీ రీకాంబినేస్ మరియు YFP సీక్వెన్స్‌లతో పాటు, పెప్టైడ్ ఫ్రాగ్మెంట్ స్పెక్ట్రాలలో మౌస్ రిఫరెన్స్ ప్రోటియోమ్ (ప్రోటియోమ్ ID UP000000589, మే 2017లో యూనిప్రోట్ నుండి డౌన్‌లోడ్ చేయబడింది) యొక్క ప్రామాణిక సీక్వెన్స్ మరియు ఐసోఫార్మ్ సీక్వెన్స్ కోసం శోధించడం జరిగింది. మెథియోనిన్ ఆక్సీకరణ మరియు ప్రోటీన్ N-టెర్మినల్ ఎసిటైలేషన్‌లను వేరియబుల్ మాడిఫికేషన్స్‌గా; సిస్టీన్ కార్బమోయిల్ మిథైలేషన్‌ను ఫిక్స్‌డ్ మాడిఫికేషన్స్‌గా సెట్ చేయడం జరిగింది. డైజెషన్ పారామీటర్లను “స్పెసిఫిసిటీ” మరియు “ట్రిప్సిన్/P”గా సెట్ చేయడం జరిగింది. ప్రోటీన్ గుర్తింపు కోసం ఉపయోగించిన పెప్టైడ్‌లు మరియు రేజర్ పెప్టైడ్‌ల కనీస సంఖ్య 1; ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల కనీస సంఖ్య 0. పెప్టైడ్ మ్యాప్ మ్యాచింగ్ పరిస్థితులలో, ప్రోటీన్ గుర్తింపు రేటు 0.01గా ఉంది. “సెకండ్ పెప్టైడ్” ఎంపిక ఎనేబుల్ చేయబడింది. వేర్వేరు ఒరిజినల్ ఫైల్స్ మధ్య విజయవంతమైన గుర్తింపులను బదిలీ చేయడానికి “మ్యాచ్ బిట్వీన్ రన్స్” ఎంపికను ఉపయోగించండి. లేబుల్-ఫ్రీ క్వాంటిఫికేషన్ (LFQ) కోసం LFQ కనీస నిష్పత్తి గణన 1ని ఉపయోగించండి (60). ప్రతి సమయ బిందువు వద్ద కనీసం ఒక జన్యురూప సమూహంలో కనీసం రెండు చెల్లుబాటు అయ్యే విలువల కోసం LFQ తీవ్రత ఫిల్టర్ చేయబడుతుంది మరియు 0.3 వెడల్పు మరియు 1.8 డౌన్ ఉన్న సాధారణ పంపిణీ నుండి ఎక్స్‌ట్రాపోలేట్ చేయబడుతుంది. LFQ ఫలితాలను విశ్లేషించడానికి పెర్సియస్ కంప్యూటింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్ (https://maxquant.net/perseus/) మరియు R (https://r-project.org/) ఉపయోగించండి. డిఫరెన్షియల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణ కోసం లిమ్మా సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ నుండి టూ-వే మోడరేట్ t పరీక్షను ఉపయోగించారు (61). ఎక్స్‌ప్లోరేటరీ డేటా విశ్లేషణ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally మరియు pheatmap ఉపయోగించి నిర్వహించబడుతుంది. TMT-ఆధారిత ప్రోటీయోమిక్స్ డేటాను MaxQuant వెర్షన్ 1.6.10.43 ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. సెప్టెంబర్ 2018లో డౌన్‌లోడ్ చేయబడిన UniProt యొక్క హ్యూమన్ ప్రోటియోమిక్స్ డేటాబేస్ నుండి ముడి ప్రోటియోమిక్స్ డేటా కోసం శోధించండి. ఈ విశ్లేషణలో తయారీదారు అందించిన ఐసోటోప్ స్వచ్ఛత సవరణ కారకం కూడా ఉంటుంది. డిఫరెన్షియల్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణ కోసం Rలో limmaను ఉపయోగించండి. అసలైన డేటా, డేటాబేస్ శోధన ఫలితాలు, మరియు డేటా విశ్లేషణ వర్క్‌ఫ్లో మరియు ఫలితాలు అన్నీ PRIDE భాగస్వామి రిపోజిటరీ ద్వారా PXD019690 అనే డేటా సెట్ ఐడెంటిఫైయర్‌తో ప్రోటియోమ్‌ఎక్స్‌ఛేంజ్ అలయన్స్‌లో నిల్వ చేయబడ్డాయి.
ఫంక్షనల్ అనోటేషన్లు విశ్లేషణను సుసంపన్నం చేస్తాయి. 8 వారాల వద్ద డేటా సెట్ యొక్క ఫంక్షనల్ అనోటేషన్ పదాల సమృద్ధిని నిర్ధారించడానికి ఇన్‌జెన్యూయిటీ పాత్‌వే అనాలిసిస్ (QIAGEN) సాధనాన్ని ఉపయోగించారు (మూర్తి 1). క్లుప్తంగా, LC-MS/MS (టాండమ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ) డేటా విశ్లేషణ నుండి పొందిన పరిమాణాత్మక ప్రోటీన్ జాబితాను ఈ క్రింది ఫిల్టర్ ప్రమాణాలతో ఉపయోగిస్తారు: మస్ మస్క్యులస్‌ను జాతిగా మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్‌గా ఎంచుకున్నారు, మరియు సుసంపన్నత కోసం బెంజమిని ద్వారా సర్దుబాటు చేయబడిన P విలువ 0.05 లేదా అంతకంటే తక్కువ ఉన్న వర్గాన్ని ముఖ్యమైనదిగా పరిగణిస్తారు. ఈ గ్రాఫ్ కోసం, సర్దుబాటు చేయబడిన P విలువ ఆధారంగా ప్రతి క్లస్టర్‌లోని మొదటి ఐదు అదనపు వర్గాలను చూపించారు. బెంజమిని, క్రీగర్ మరియు యెకుటియేలి యొక్క రెండు-దశల లీనియర్ బూస్ట్ ప్రోగ్రామ్ (Q = 5%) ఉపయోగించి, మల్టిపుల్ t-టెస్ట్ ద్వారా, ప్రతి వర్గంలో గుర్తించిన ముఖ్యమైన అభ్యర్థులపై టైమ్-కోర్స్ ప్రోటీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణను నిర్వహిస్తారు మరియు ప్రతి అడ్డువరుసను విడిగా విశ్లేషిస్తారు. స్థిరమైన SDని అనుసరించాల్సిన అవసరం లేదు.
ఈ అధ్యయనం యొక్క ఫలితాలను ప్రచురించిన డేటాబేస్‌లతో పోల్చడానికి మరియు చిత్రం 1లో వెన్ రేఖాచిత్రాన్ని రూపొందించడానికి, మేము పరిమాణాత్మక ప్రోటీన్ జాబితాను మైటోకార్టా 2.0 ఉల్లేఖనాలతో (24) కలిపాము. రేఖాచిత్రాన్ని రూపొందించడానికి ఆన్‌లైన్ సాధనం డ్రా వెన్ డయాగ్రామ్ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ను ఉపయోగించండి.
ప్రోటీయోమిక్స్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించిన గణాంక పద్ధతులపై వివరణాత్మక సమాచారం కోసం, దయచేసి మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్ యొక్క సంబంధిత విభాగాన్ని చూడండి. మిగతా అన్ని ప్రయోగాలకు సంబంధించిన వివరణాత్మక సమాచారం సంబంధిత లెజెండ్‌లో లభిస్తుంది. ప్రత్యేకంగా పేర్కొనకపోతే, మొత్తం డేటా సగటు ± SEM గా వ్యక్తీకరించబడింది మరియు అన్ని గణాంక విశ్లేషణలు గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం 8.1.2 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి.
ఈ వ్యాసానికి సంబంధించిన అనుబంధ సమాచారం కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ని చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్-నాన్-కమర్షియల్ లైసెన్స్ నిబంధనల క్రింద పంపిణీ చేయబడిన ఒక ఓపెన్ యాక్సెస్ వ్యాసం. ఈ లైసెన్స్ ప్రకారం, తుది ఉపయోగం వాణిజ్య లాభం కోసం కానంత వరకు మరియు అసలు రచన సరైనదనే ప్రాతిపదిక ఉన్నంత వరకు, దీనిని ఏ మాధ్యమంలోనైనా ఉపయోగించడానికి, పంపిణీ చేయడానికి మరియు పునరుత్పత్తి చేయడానికి అనుమతి ఉంది. రిఫరెన్స్.
గమనిక: మీరు ఈ పేజీకి సిఫార్సు చేసే వ్యక్తికి, మీరు ఆ ఇమెయిల్‌ను వారు చూడాలని కోరుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలియజేయడం కోసమే మేము మిమ్మల్ని మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను ఇవ్వమని అడుగుతున్నాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సేకరించము.
మీరు సందర్శకులా కాదా అని పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నివారించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
E. మోటోరి, I. అటనాసోవ్, SMV కొచన్, K. ఫోల్జ్-డోనాహ్యూ, V. శక్తివేలు, P. గియావాలిస్కో, N. టోని, J. పుయల్, N.-G ద్వారా. లార్సన్
పనితీరు సరిగా లేని న్యూరాన్‌ల ప్రోటీయోమిక్స్ విశ్లేషణలో, న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను ఎదుర్కోవడానికి జీవక్రియ కార్యక్రమాలు సక్రియం చేయబడతాయని వెల్లడైంది.
E. మోటోరి, I. అటనాసోవ్, SMV కొచన్, K. ఫోల్జ్-డోనాహ్యూ, V. శక్తివేలు, P. గియావాలిస్కో, N. టోని, J. పుయల్, N.-G ద్వారా. లార్సన్
పనితీరు సరిగా లేని న్యూరాన్‌ల ప్రోటీయోమిక్స్ విశ్లేషణలో, న్యూరోడిజెనరేషన్‌ను ఎదుర్కోవడానికి జీవక్రియ కార్యక్రమాలు సక్రియం చేయబడతాయని వెల్లడైంది.
©2020 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.