ప్రస్తుత చిరునామా: OX11 0DE, UK, డైమండ్ బిల్డింగ్, హార్వెల్ సైన్స్ అండ్ ఇన్నోవేషన్ పార్క్, డైట్‌కోట్, ఆక్స్‌ఫర్డ్‌షైర్, UK, డైమండ్ లైట్ సోర్స్ కో., లిమిటెడ్, ఎలక్ట్రానిక్ బయోలాజికల్ ఇమేజింగ్ సెంటర్.
రియాక్షన్ సెంటర్ లైట్-హార్వెస్టింగ్ కాంప్లెక్స్ 1 (RC-LH1) అనేది పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియా యొక్క ప్రధాన కిరణజన్య సంయోగక్రియ భాగం. మేము రోడోప్సుడోమోనాస్ పలస్ట్రిస్ నుండి RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క రెండు క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ నిర్మాణాలను పరిచయం చేసాము. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.65-Å రిజల్యూషన్ నిర్మాణం RC చుట్టూ ఉన్న 14 సబ్యూనిట్ LH1 లూప్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఇది ప్రోటీన్ W ద్వారా అంతరాయం కలిగిస్తుంది, అయితే ప్రోటీన్-W లేని కాంప్లెక్స్ RC చుట్టూ పూర్తిగా RC కూర్పు. క్లోజ్డ్ 16 సబ్యూనిట్ LH1 లూప్. ఈ నిర్మాణాల పోలిక RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లోని క్వినోన్ యొక్క డైనమిక్స్‌లో అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది, RC QB సైట్‌లో క్వినోన్‌ను బైండింగ్ చేసేటప్పుడు గతంలో నిర్ణయించని కన్ఫర్మేషనల్ మార్పులు, అలాగే సహాయక క్వినోన్ బైండింగ్ సైట్‌ల స్థానం, ఇవి వాటిని RCకి పంపడంలో సహాయపడతాయి. W ప్రోటీన్ యొక్క ప్రత్యేక నిర్మాణం LH1 లూప్ మూసివేయడాన్ని నిరోధిస్తుంది, తద్వారా క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని వేగవంతం చేయడానికి ఒక ఛానెల్‌ను సృష్టిస్తుంది.
కిరణజన్య సంయోగక్రియ ద్వారా అందించబడిన శక్తి భూమిపై దాదాపు అన్ని జీవులకు మద్దతు ఇవ్వగలదు మరియు ఇది సౌర బయోటెక్నాలజీకి గొప్ప సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంది. ప్రపంచ కిరణజన్య సంయోగక్రియను ప్రోత్సహిస్తూనే, ఊదా రంగు ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియా కూడా వివిధ శక్తి రీతులు మరియు జీవక్రియ సామర్థ్యాలను ప్రదర్శిస్తుంది. అవి కిరణజన్య సంయోగక్రియను నివారించగలవు మరియు చీకటిలో హెటెరోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియాగా పెరుగుతాయి, నత్రజని మరియు కార్బన్ డయాక్సైడ్‌ను స్థిరీకరించగలవు, హైడ్రోజన్‌ను ఉత్పత్తి చేయగలవు మరియు సుగంధ సమ్మేళనాలను క్షీణింపజేయగలవు (1-3). ఈ ప్రక్రియలకు శక్తిని అందించడానికి, కాంతిని త్వరగా మరియు సమర్ధవంతంగా రసాయన శక్తిగా మార్చాలి. కాంతి-ట్రాపింగ్ యాంటెన్నా కాంప్లెక్స్ కాంతిని గ్రహించి, చిక్కుకున్న శక్తిని ప్రతిచర్య కేంద్రానికి (RC) బదిలీ చేసినప్పుడు ఈ ప్రక్రియ ప్రారంభమవుతుంది, తద్వారా ఛార్జ్ విభజన ప్రారంభమవుతుంది (4 – 7). ఊదా రంగు ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియాలో కిరణజన్య సంయోగక్రియ యొక్క ప్రాథమిక యూనిట్ టైప్ 2 RCతో కూడి ఉంటుంది, కాంతి-హార్వెస్టింగ్ కాంప్లెక్స్ 1 (LH1) చుట్టూ ఉండి, RC-LH1 కోర్ కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరుస్తుంది. LH1 వక్ర αβ హెటెరోడైమర్‌ల శ్రేణి ద్వారా ఏర్పడుతుంది, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి రెండు బాక్టీరియల్ క్లోరోఫిల్ (BChl) a అణువులను మరియు ఒకటి లేదా రెండు కెరోటినాయిడ్‌లను (8-12) బంధిస్తుంది. సరళమైన LH1 యాంటెన్నాలో క్లోజ్డ్ లూప్‌లో RC (9-13) చుట్టూ 16 లేదా 17 αβ హెటెరోడైమర్‌లు ఉంటాయి, కానీ ఇతర కోర్ కాంప్లెక్స్‌లలో, ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ పెప్టైడ్‌లు చుట్టుపక్కల LH1 యొక్క కొనసాగింపుకు అంతరాయం కలిగిస్తాయి, తద్వారా RC మరియు సైటోక్రోమ్ bc1 కాంప్లెక్స్ మధ్య క్వినాల్/క్వినోన్ వ్యాప్తిని ప్రోత్సహిస్తాయి (11, 13-15). పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ మొక్క రోడోప్సుడోమోనాస్ (Rps.) అనేది కిరణజన్య సంయోగక్రియకు మద్దతు ఇచ్చే శక్తి మరియు ఎలక్ట్రాన్ బదిలీని అర్థం చేసుకోగల ఒక నమూనా జీవి. Rps యొక్క మొదటి క్రిస్టల్ నిర్మాణం. పాలస్ట్రిస్ RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క నమూనా RC, దాని చుట్టూ 15 హెటెరోడైమెరిక్ LH1 లూప్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి "ప్రోటీన్ W" (14) అనే తెలియని ప్రోటీన్ ద్వారా అంతరాయం కలిగిస్తాయి. ప్రోటీన్-W తరువాత RPA4402గా గుర్తించబడింది, ఇది మూడు అంచనా వేసిన ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ (TMH) (16)తో కూడిన వర్గీకరించబడని 10.5kDa ప్రోటీన్. RC-L, M (pufL, pufM) మరియు LH1α, β (pufA, pufB) ఉపయూనిట్‌లను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువులకు ఉపయోగించే నామకరణానికి అనుగుణంగా rpa4402 జన్యు ఎన్‌కోడింగ్ ప్రోటీన్ W ని pufW గా పేరు మార్చాలని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము. ఆసక్తికరంగా, ప్రోటీన్-W RC-LH1 లో దాదాపు 10% లో మాత్రమే ఉంటుంది, ఇది Rps. palustris రెండు వేర్వేరు RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుందని వెల్లడిస్తుంది. ఇక్కడ, మేము రెండు కోర్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ క్రయో-EM (cryo-EM) నిర్మాణాలను నివేదిస్తాము, ఒకటి ప్రోటీన్ W మరియు 14 αβ హెటెరోడైమర్‌లతో, మరొకటి ప్రోటీన్ W మరియు క్లోజ్డ్ 16 హెటెరోడైమర్ LH1 లూప్ లేకుండా. మా నిర్మాణం Rps. palustris యొక్క RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క అవగాహనలో ఒక దశ మార్పును సూచిస్తుంది, ఎందుకంటే మేము ప్రతి వేరియంట్ యొక్క సజాతీయ జనాభాను విశ్లేషించాము మరియు ప్రతి పెప్టైడ్ మరియు బౌండ్ పిగ్మెంట్‌లు మరియు సంబంధిత లిపిడ్‌లు మరియు క్వినోన్‌లను స్పష్టంగా కేటాయించడానికి తగినంత రిజల్యూషన్‌ను కలిగి ఉన్నాము. ఈ నిర్మాణాల పోలిక ఇప్పటివరకు మరే ఇతర RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లోనూ కనుగొనబడని మూడు TMH ప్రోటీన్లు-W క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని వేగవంతం చేయడానికి క్వినోన్ ఛానెల్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తాయని చూపిస్తుంది. అనేక సంరక్షించబడిన లిపిడ్ మరియు క్వినోన్ బైండింగ్ సైట్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు క్వినోన్ మరియు RC కలయిక తర్వాత మేము కొత్త ఆకృతీకరణ మార్పును వెల్లడించాము, ఇది ఆక్సిజన్ చేయబడిన ఫోటోట్రోఫిక్ జీవుల ఫోటోసిస్టమ్ II (PSII) RCకి అనుకూలంగా ఉండవచ్చు. మా పరిశోధనలు పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియా యొక్క RC-LH1 కోర్ కాంప్లెక్స్‌లో క్వినోన్/క్వినోలోన్ బైండింగ్ మరియు మార్పిడి యొక్క గతిశాస్త్రంలో కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి.
Rps. palustris లో కనిపించే రెండు కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క వివరణాత్మక అధ్యయనాన్ని సులభతరం చేయడానికి, మేము ప్రతి RC-LH1 ను జీవరసాయన పద్ధతుల ద్వారా వేరు చేస్తాము. ప్రోటీన్ W-లోపం ఉన్న కాంప్లెక్స్ (ఇకపై ΔpufW అని పిలుస్తారు) pufW జన్యువు లేని జాతి నుండి శుద్ధి చేయబడింది (16), మరియు ఒక RC-LH1 కాంప్లెక్స్ మాత్రమే ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది. ప్రోటీన్ W-కలిగిన కాంప్లెక్స్ ఒక జాతి ద్వారా ఉత్పత్తి అవుతుంది. ఈ జాతి యొక్క ప్రోటీన్ W దాని C-టెర్మినస్ వద్ద 10x హిస్ ట్యాగ్‌తో సవరించబడుతుంది, తద్వారా ప్రోటీన్ W-కలిగిన కాంప్లెక్స్‌ను లోహాన్ని స్థిరీకరించడం ద్వారా చాలా తక్కువ ప్రోటీన్ W తో సమర్థవంతంగా కలపవచ్చు. కాంప్లెక్స్ సమర్థవంతంగా వేరు చేయబడుతుంది (16) అఫినిటీ క్రోమాటోగ్రఫీ (IMAC).
చిత్రం 1లో చూపిన విధంగా, రెండు కాంప్లెక్స్‌లు LH1 యాంటెన్నాతో చుట్టుముట్టబడిన మూడు ఉప-యూనిట్ RC (RC-L, RC-M మరియు RC-H)ను కలిగి ఉంటాయి. ప్రోటీన్-W లేని కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.80-A నిర్మాణం 16 αβ హెటెరోడైమర్‌లను చూపిస్తుంది, ఇది RCని పూర్తిగా చుట్టుముట్టిన క్లోజ్డ్ LH1 లూప్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, ఇకపై దీనిని RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌గా సూచిస్తారు. ప్రోటీన్-W-కలిగిన కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.65Å నిర్మాణం ప్రోటీన్-W ద్వారా అంతరాయం కలిగించబడిన 14-హెటెరోడైమర్ LH1ను కలిగి ఉంటుంది, ఇకపై దీనిని RC-LH114-Wగా సూచిస్తారు.
(A మరియు B) సమ్మేళనం యొక్క ఉపరితల ప్రాతినిధ్యం. (C మరియు D) రాడ్‌లలో వ్యక్తీకరించబడిన బంధిత వర్ణద్రవ్యాలు. (E మరియు F) సైటోప్లాస్మిక్ ఉపరితలం నుండి గమనించిన సముదాయాలు కార్టూన్‌లలో సూచించబడిన పెప్టైడ్‌లు మరియు LH1 ఉపయూనిట్‌లను కలిగి ఉంటాయి మరియు ప్రోటీన్-W అంతరం నుండి సవ్యదిశలో లెక్కించబడతాయి [Rba సంఖ్యకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. స్ఫెరాయిడ్స్ కాంప్లెక్స్ (13)]. LH1-α కోసం, ప్రోటీన్ సబ్యూనిట్ యొక్క రంగు పసుపు; LH1-β కోసం, ప్రోటీన్ సబ్యూనిట్ యొక్క రంగు నీలం; ప్రోటీన్-W కోసం, ప్రోటీన్ ఎరుపు; RC-H కోసం, ఇది సియాన్; RC-L కోసం, ఇది నారింజ; RC-M కోసం, మెజెంటా. కోఫాక్టర్‌లను రాడ్‌ల ద్వారా సూచిస్తారు, ఆకుపచ్చ BChl మరియు BPh a అణువులను సూచిస్తుంది, ఊదా రంగు కెరోటినాయిడ్‌లను సూచిస్తుంది మరియు పసుపు UQ10 అణువులను సూచిస్తుంది. (G మరియు H) RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ (G) మరియు RC-LH116 కాంప్లెక్స్ (H) యొక్క సమాన ప్రాంతంలో ప్రోటీన్-W అంతరం యొక్క మాగ్నిఫైడ్ వీక్షణ. కోఫాక్టర్లు స్పేస్ ఫిల్లింగ్ రూపంలో ప్రదర్శించబడతాయి, చెలేటెడ్ క్వినోన్ నీలం రంగులో ప్రదర్శించబడుతుంది. ప్రోటీన్-W గ్యాప్ (G) లో నీలిరంగు డాష్డ్ లైన్ ద్వారా హైలైట్ చేయబడుతుంది మరియు LH116 రింగ్‌పై క్వినోన్/క్వినోలోల్ వ్యాప్తి చెందే చిన్న రంధ్రాలు (H) లో నల్లని డాష్డ్ లైన్ ద్వారా హైలైట్ చేయబడతాయి.
చిత్రం 1 (A మరియు B) LH1αβ హెటెరోడైమర్‌ల ఓపెన్ లేదా క్లోజ్డ్ శ్రేణులతో చుట్టుముట్టబడిన RCని చూపిస్తుంది, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి రెండు BChl మరియు ఒక కెరోటినాయిడ్‌ను బంధిస్తుంది (మూర్తి 1, C మరియు D). మునుపటి అధ్యయనాలు Rps అనేది LH1 కాంప్లెక్స్ అని చూపించాయి. స్పిరులినా జాంథిన్ యొక్క బయోసింథటిక్ మార్గంలో, ఈ జాతులు కెరోటినాయిడ్ల మిశ్రమ జనాభాను కలిగి ఉంటాయి (17). అయితే, స్పైరోపైరోక్సంతిన్ ఆధిపత్య కెరోటినాయిడ్ మరియు దాని సాంద్రత సంతృప్తికరంగా ఉంటుంది. అందువల్ల, మేము అన్ని LH1 బైండింగ్ సైట్‌లలో స్పైరోక్సంతిన్‌ను మోడల్ చేయడానికి ఎంచుకున్నాము. ఆల్ఫా మరియు బీటా పాలీపెప్టైడ్‌లు చిన్న పొర బాహ్య ప్రాంతాలతో ఒకే TMHలు (మూర్తి 1, A, B, E, మరియు F). C-టెర్మినస్ వద్ద 17 అవశేషాల సాంద్రత గమనించబడనప్పటికీ, ఆల్ఫా పాలీపెప్టైడ్ రెండు కాంప్లెక్స్‌లలో Met1 నుండి Ala46 వరకు విభజించబడింది. RC-LH116 లో β పాలీపెప్టైడ్‌ను Gly4 నుండి Tyr52 కు, RC-LH114-W లో Ser5 నుండి Tyr52 కు తగ్గించారు. 3 లేదా 4 N-టెర్మినల్ లేదా 13 C-టెర్మినల్ అవశేషాల సాంద్రత గమనించబడలేదు (మూర్తి S1). వైల్డ్-టైప్ స్ట్రెయిన్ నుండి తయారు చేయబడిన మిశ్రమ RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ విశ్లేషణలో తప్పిపోయిన ప్రాంతం ఈ పెప్టైడ్‌ల యొక్క హెటెరోలాగస్ క్లీవేజ్ ఫలితంగా ఉందని తేలింది (మూర్తి S1 మరియు S2). α-Met1 యొక్క N-టెర్మినల్ ఫార్మిలేషన్ కూడా గమనించబడింది (f). α-పెప్టైడ్ fMet1 నుండి Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 వరకు అవశేషాలను కలిగి ఉందని మరియు β-పెప్టైడ్ Ser2 నుండి Ala53 వరకు అవశేషాలను కలిగి ఉందని విశ్లేషణ చూపించింది, ఇది తక్కువ-ఉష్ణోగ్రత EM సాంద్రత మ్యాప్‌తో మంచి ఒప్పందంలో ఉంది.
α-His29 మరియు β-His36 ల సమన్వయం BChls ను ముఖాముఖిగా చేస్తుంది; ప్రతి αβ హెటెరోడైమర్ దాని పొరుగువారితో సమావేశమై RC చుట్టూ ఓపెన్ లూప్ (RC-LH114-W) లేదా క్లోజ్డ్ లూప్ (RC-LH116) ను ఏర్పరుస్తుంది. ఎక్సిటాన్ కపుల్డ్ పిగ్మెంట్ శ్రేణి (మూర్తి 1, C మరియు D). RC-LH114-W యొక్క 877 nm బ్యాండ్‌తో పోలిస్తే, RC-LH116 యొక్క 880 nm శోషణ ఎరుపు మార్పు 3 nm (మూర్తి 2A). అయితే, వృత్తాకార డైక్రోయిజం స్పెక్ట్రం దాదాపు ఒకే విధంగా ఉంటుంది (మూర్తి 2B), ఇది ఓపెన్ మరియు క్లోజ్డ్ లూప్‌ల మధ్య స్పష్టమైన వ్యత్యాసం ఉన్నప్పటికీ, BChls యొక్క స్థానిక వాతావరణం చాలా పోలి ఉంటుందని సూచిస్తుంది. శోషణ ఎరుపు మార్పు తగ్గిన ఉష్ణ కదలిక మరియు క్లోజ్డ్ లూప్‌పై పెరిగిన స్థిరత్వం (18, 19), క్లోజ్డ్ లూప్ (20, 21) వల్ల కలిగే వర్ణద్రవ్యం కలపడంలో మార్పు లేదా ఈ రెండు ప్రభావాల కలయిక (11) ఫలితంగా ఉండవచ్చు.
(ఎ) అతినీలలోహిత/కనిపించే/సమీప-పరారుణ శోషణ వర్ణపటం, వీటి శిఖరాలు వాటి సంబంధిత వర్ణద్రవ్యాలతో గుర్తించబడతాయి మరియు 775 nm వద్ద BPh శిఖరానికి సాధారణీకరించబడతాయి. (బి) 805 nm వద్ద BChl శోషణకు సాధారణీకరించబడిన వృత్తాకార డైక్రోయిజం స్పెక్ట్రం. (సి మరియు డి) RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ (C) మరియు RC-LH116 కాంప్లెక్స్ (D) యొక్క సమయ-పరిష్కార శోషణ వర్ణపటం నుండి ఎంపిక చేయబడిన ΔA స్పెక్ట్రా. మెరుగైన పోలిక కోసం, అన్ని స్పెక్ట్రాలు 0.2 ps వద్ద −A యొక్క ∆Aకి సాధారణీకరించబడతాయి. (ఇ) UQ2 యొక్క వివిధ సాంద్రతల సమక్షంలో వికిరణం తర్వాత సైటోక్రోమ్ c2 ఆక్సీకరణ రేటు (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S8 చూడండి). (ఎఫ్) తక్కువ, మధ్యస్థ లేదా అధిక తీవ్రత కాంతి కింద పెరిగిన కణాలలో (వరుసగా 10, 30 లేదా 300μMm-2 s-1), శుద్ధి చేయబడిన కాంప్లెక్స్‌లోని ప్రోటీన్ W మరియు RC-L ఉపవిభాగాలు మరియు వేరు చేయబడిన పొర నిష్పత్తి. SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరేసిస్ మరియు ఇమ్యునోఅస్సే ద్వారా ప్రోటీన్ స్థాయిని నిర్ణయించండి (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S9 చూడండి). శుద్ధి చేయబడిన RC-LH114-W కాంప్లెక్స్‌కు సంబంధించి నిష్పత్తిని నిర్ణయించండి. కాంప్లెక్స్ యొక్క RC-L మరియు ప్రోటీన్-W మధ్య స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తి 1:1.
RC-LH114-W (Figure 1, A, C, మరియు E) యొక్క వికృతమైన αβ14 లూప్‌లో 1 స్థానంలో ఉన్న BChlలు, RC-LH116లోని సమానమైన BChlల కంటే 6.8Å ద్వారా RC ప్రాథమిక దాత (P)కి దగ్గరగా ఉంటాయి (Figure. 1, B, D, మరియు F, మరియు Figure S3); అయితే, రెండు కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క తాత్కాలిక శోషణ గతిశాస్త్రం RC-LH114-W మరియు RC-LH116 కోసం, LH1 నుండి RC వరకు ఉత్తేజిత శక్తి బదిలీ సమయ స్థిరాంకాలు 40 ±4 మరియు 44±3 ps అని చూపిస్తుంది (Figure 2). , C మరియు D, Figure S4 మరియు టేబుల్ S2). RC లోపల ఎలక్ట్రానిక్ బదిలీలో కూడా గణనీయమైన తేడా లేదు (Figure S5 మరియు సంబంధిత అనుబంధ వచనం). LH1 మరియు RC-P మధ్య శక్తి బదిలీ సమయం యొక్క దగ్గరి అనురూప్యం రెండు LH1 లూప్‌లలోని చాలా BChl యొక్క సారూప్య దూరం, కోణం మరియు సంభావ్య శక్తి కారణంగా ఉందని మేము అనుమానిస్తున్నాము. కనిష్ట దూరాన్ని చేరుకోవడానికి LH1 శక్తి నమూనాను అన్వేషించడం అనేది సబ్‌ఆప్టిమల్ సైట్‌ల నుండి RCకి ప్రత్యక్ష శక్తి బదిలీ కంటే వేగంగా లేదని అనిపిస్తుంది. RC-LH114-Wలోని ఓపెన్-లూప్ LH1 లూప్ నిర్మాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం తక్కువ ఉష్ణోగ్రత పరిస్థితులలో కూడా అతితక్కువ ఉష్ణ కదలికకు లోనవుతుంది మరియు RC 1 స్థానంలో βBChls యొక్క వర్ణద్రవ్యం దూరం నుండి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పొడవైన αβ14 రింగ్ కన్ఫర్మేషన్ ఉంటుంది.
RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌లో 32 BChls మరియు 16 కెరోటినాయిడ్లు ఉన్నాయి, మరియు దాని మొత్తం అమరిక థర్మోక్రోమాటియం (Tch.) పిడ్పిడమ్ [ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్ (PDB) ID 5Y5S] (9), థియోర్హోడోవిబ్రియో (Trv.) 970 స్ట్రెయిన్ (PDB ID 7C9R) (12) మరియు గ్రీన్ ఆల్గే (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) నుండి పొందిన దానితో సమానంగా ఉంటుంది. అమరిక తర్వాత, αβ హెటెరోడైమర్‌ల స్థానాల్లో చిన్న విచలనాలు మాత్రమే గమనించబడ్డాయి, ముఖ్యంగా 1-5, 15, మరియు 16 (మూర్తి S6). ప్రోటీన్-W ఉనికి LH1 నిర్మాణంపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. దీని మూడు TMHలు చిన్న లూప్‌ల ద్వారా అనుసంధానించబడి ఉంటాయి, కాంప్లెక్స్ యొక్క ల్యూమన్ వైపు N-టెర్మినల్ మరియు సైటోప్లాస్మిక్ వైపు C-టెర్మినల్ (మూర్తి 1A మరియు 3, A నుండి D వరకు). ప్రోటీన్-W ఎక్కువగా హైడ్రోఫోబిక్ (మూర్తి 3B), మరియు TMH2 మరియు TMH3 LH1αβ-14 తో సంకర్షణ చెంది ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ఉపరితలాన్ని ఏర్పరుస్తాయి (మూర్తి 3, B మరియు E నుండి G వరకు). ఇంటర్‌ఫేస్ ప్రధానంగా ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రాంతంలో Phe, Leu మరియు Val అవశేషాలతో కూడి ఉంటుంది. ఈ అవశేషాలు హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు మరియు αβ-14 వర్ణద్రవ్యాలతో పేర్చబడి ఉంటాయి. కొన్ని ధ్రువ అవశేషాలు కూడా పరస్పర చర్యకు దోహదం చేస్తాయి, వీటిలో సంక్లిష్ట కుహరం యొక్క ఉపరితలంపై W-Thr68 మరియు β-Trp42 మధ్య హైడ్రోజన్ బంధం ఉంటుంది (మూర్తి 3, F మరియు G). సైటోప్లాజం యొక్క ఉపరితలంపై, Gln34 αβ-14 కెరోటినాయిడ్ల కీటో సమూహానికి ఆనుకొని ఉంటుంది. అదనంగా, n-డోడెసిల్ β-d-మాల్టోసైడ్ (β-DDM) అణువు పరిష్కరించబడింది మరియు దాని హైడ్రోఫోబిక్ తోక ప్రోటీన్-W మరియు αβ-14 మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్‌కు విస్తరించింది మరియు లిపిడ్ తోక శరీరంలో ఉండవచ్చు. ప్రోటీన్ W మరియు RCH యొక్క C-టెర్మినల్ రిజల్యూషన్ ప్రాంతాలు చాలా దగ్గరగా ఉన్నాయని, కానీ నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యలను ఏర్పరిచే పరిధిలో లేవని కూడా మేము గమనించాము (మూర్తి 1, A మరియు E). అయితే, ఈ రెండు ప్రోటీన్ల యొక్క పరిష్కరించబడని C-టెర్మినల్ అమైనో ఆమ్లాలలో పరస్పర చర్యలు ఉండవచ్చు, ఇది RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క అసెంబ్లీ సమయంలో ప్రోటీన్-W నియామకానికి ఒక యంత్రాంగాన్ని అందించవచ్చు.
(A) కార్టూన్ రూపంలో LH1αβ14 తో ఇంటర్‌ఫేస్‌ను ఎదుర్కొనే ప్రోటీన్-W, ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ పొటెన్షియల్ రేఖాచిత్రం (0.13 కాంటూర్ స్థాయితో పారదర్శక బూడిద రంగు ఉపరితలం) యొక్క ఒక భాగంలో ప్రదర్శించబడే రాడ్-ఆకారపు సైడ్ చైన్ (ఎరుపు) కలిగి ఉంటుంది. (B) హైడ్రోఫోబిక్ రంగు ఉపరితలం ద్వారా సూచించబడే ప్రోటీన్-W. ధ్రువ మరియు చార్జ్డ్ ప్రాంతాలు సియాన్‌లో ప్రదర్శించబడతాయి, హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతాలు తెలుపు రంగులో ప్రదర్శించబడతాయి మరియు బలంగా హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతాలు నారింజ రంగులో ప్రదర్శించబడతాయి. (C మరియు D) కార్టూన్‌లో సూచించబడే ప్రోటీన్-W, దాని ధోరణి (A) (C) లో వలె ఉంటుంది మరియు 180° (D) ద్వారా తిప్పబడుతుంది. క్రమంలోని స్థానం ప్రకారం, వేరు చేయగల అవశేషాలు ఇంద్రధనస్సు రంగు పథకాన్ని అవలంబిస్తాయి, ఇక్కడ N-టెర్మినల్ నీలం మరియు C-టెర్మినల్ ఎరుపు రంగులో ఉంటుంది. (E) (A) లో ఉన్న అదే వీక్షణలో ప్రోటీన్-W, మరియు ప్రోటీన్-W:LH1 యొక్క ఇంటర్‌ఫేస్‌లోని అవశేషాలు జతచేయబడిన గుర్తులతో రాడ్‌ల ద్వారా సూచించబడతాయి. (F) కార్టూన్ ప్రాతినిధ్యంలో (E) మరియు LH1αβ14 లకు సంబంధించి మరియు బార్ ప్రాతినిధ్యంలో ఇంటర్‌ఫేస్ అవశేషాలకు సంబంధించి ప్రోటీన్-W 90° తిప్పబడుతుంది. బీటా పాలీపెప్టైడ్ నుండి ఓవర్‌హాంగింగ్ అవశేషాలు లేబుల్ చేయబడ్డాయి. కోఫాక్టర్ చిత్రం 1 యొక్క రంగుకు సరిపోయే బార్‌గా చూపబడింది, కుళ్ళిపోయిన β-DDM బూడిద రంగులో మరియు ఆక్సిజన్ ఎరుపు రంగులో చూపబడింది. (G) (F) లోని వీక్షణ లేబుల్ చేయబడిన ఆల్ఫా పాలీపెప్టైడ్ యొక్క ప్రముఖ అవశేషాలతో 180° తిప్పబడుతుంది.
ప్రోటీన్-W అనేది αβ హెటెరోడైమర్‌ను (చిత్రం 1Fలో 15వది) భర్తీ చేస్తుంది, తద్వారా లూప్ మూసివేతను నిరోధిస్తుంది మరియు మొదటి మూడు αβ హెటెరోడైమర్‌లను వంచుతుంది. ఫిల్మ్ నార్మల్‌కు సంబంధించి మొదటి αβ-1 హెటెరోడైమర్ యొక్క గరిష్ట వంపు కోణం 25° నుండి 29° (చిత్రం 1, A మరియు E) అని గమనించబడింది, ఇది RC A షార్ప్ కాంట్రాస్ట్-LH116లో αβ-1 యొక్క 2° నుండి 8° వంపు ద్వారా ఏర్పడింది (చిత్రం 1, B మరియు F). రెండవ మరియు మూడవ హెటెరోడైమర్‌లు వరుసగా 12° నుండి 22° మరియు 5° నుండి 10° వద్ద వంపుతిరిగి ఉంటాయి. RC యొక్క స్టెరిక్ అడ్డంకి కారణంగా, αβ-1 యొక్క వంపులో రెండవ జత αβ ఉండదు (ఇది చిత్రం 1Fలోని 16వ αβకి అనుగుణంగా ఉంటుంది), తద్వారా LH1 రింగ్‌లో స్పష్టమైన అంతరం ఏర్పడుతుంది (చిత్రం 1, A మరియు E). రెండు αβ హెటెరోడైమర్‌లు లేకపోవడం, నాలుగు BChl మరియు రెండు కెరోటినాయిడ్‌ల నష్టంతో పాటు, ఏ కెరోటినాయిడ్‌లు వక్రీకృత αβ-1 సబ్యూనిట్‌కు బంధించవు, ఫలితంగా 13 కెరోటినాయిడ్‌లు వెజిటేరియన్ మరియు 28 BChls కలిగిన LH114-W రింగ్ ఏర్పడుతుంది. αβ1 నుండి 7 ప్రాంతాలలోని రెండు కాంప్లెక్స్‌ల స్థానిక రిజల్యూషన్ అంచనాలు మిగిలిన LH1 లూప్ కంటే తక్కువగా ఉంటాయి, ఇది RC QB సైట్‌కు ఆనుకొని ఉన్న LH1 సబ్యూనిట్ యొక్క స్వాభావిక ప్లాస్టిసిటీని ప్రతిబింబిస్తుంది (మూర్తి 4).
RC-LH114-W (A మరియు B) మరియు RC-LH116 (C మరియు D) యొక్క చిత్రాలు ఒకే పై వీక్షణ/సైడ్ వ్యూ (A మరియు B) (A మరియు C) మరియు Fig. 1 (B మరియు D) యొక్క కుహరం ఉపరితలం నుండి చూపబడ్డాయి. రంగు కీలు కుడి వైపున చూపబడ్డాయి.
1:14 స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తి కలిగిన ఏకైక ఇతర లక్షణ కోర్ కాంప్లెక్స్ రోడోకాకస్ స్ఫెరాయిడ్స్ (Rba.) RC-LH1-PufX డైమర్ (13). అయితే, ప్రోటీన్ W మరియు PufX స్పష్టమైన హోమోలజీని కలిగి ఉండవు మరియు వాటి సంబంధిత LH1 నిర్మాణాలపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతాయి. PufX అనేది N-టెర్మినల్ సైటోప్లాస్మిక్ డొమైన్‌తో కూడిన ఒకే TMH, ఇది Rps. palustris LH116αβ-16 కు అనుగుణంగా ఉన్న స్థానంలో RC-H సబ్యూనిట్ (13) యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపుతో సంకర్షణ చెందుతుంది. PufX RC-LH1 మరియు సైటోక్రోమ్ bcl కాంప్లెక్స్ మధ్య క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడి కోసం ఒక ఛానెల్‌ను సృష్టిస్తుంది మరియు అన్ని Rba. స్ఫెరాయిడ్స్ కోర్ కాంప్లెక్స్ (13)లో ఉంటుంది. మోనోమర్-మోనోమర్ ఇంటర్‌ఫేస్ Rbaలో ఉన్నప్పటికీ. RC-LH114-W లో ప్రోటీన్ W యొక్క బైండింగ్ స్థానంలో స్ఫెరాయిడ్స్ RC-LH1-PufX డైమర్ ఉంది మరియు PufX మరియు ప్రోటీన్-W ద్వారా ప్రేరేపించబడిన అంతరం సమాన స్థానంలో ఉంది (మూర్తి S7A). RC-LH114-W లోని అంతరం సూడోమోనాస్ రోసియా LH1 యొక్క ఊహాత్మక క్వినోన్ ఛానల్ (8) తో కూడా సమలేఖనం చేయబడింది, ఇది ప్రోటీన్ W లేదా PufX (మూర్తి S7B) తో సంబంధం లేని పెప్టైడ్‌ల ద్వారా ఏర్పడుతుంది. అదనంగా, Blc లోని క్వినోన్ ఛానల్. ఒక γ సబ్యూనిట్ (7) ను మినహాయించడం ద్వారా ఏర్పడిన పచ్చ ఆకుపచ్చ LH1 సారూప్య స్థితిలో ఉంది (మూర్తి S7C). వేర్వేరు ప్రోటీన్ల ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించినప్పటికీ, RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో ఒక సాధారణ స్థానంలో ఈ క్వినోన్/క్వినోలోల్ ఛానెల్‌లు కనిపించడం కన్వర్జెంట్ పరిణామానికి ఉదాహరణగా కనిపిస్తుంది, ఇది ప్రోటీన్ W ద్వారా సృష్టించబడిన అంతరం క్వినోన్ ఛానల్‌గా పనిచేయవచ్చని సూచిస్తుంది.
LH114-W లూప్‌లోని అంతరం RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క అంతర్గత స్థలం మరియు బల్క్ మెమ్బ్రేన్ (మూర్తి 1G) మధ్య నిరంతర పొర ప్రాంతం ఏర్పడటానికి అనుమతిస్తుంది, ప్రోటీన్లలో వలె ప్రోటీన్ రంధ్రము ద్వారా రెండు డొమైన్‌లను అనుసంధానించడానికి బదులుగా. RC-LH116 కాంప్లెక్స్ క్లోజ్డ్ Tch లాగా ఉంటుంది. సూది లాంటి కాంప్లెక్స్ (22) (మూర్తి 1H). పొర ద్వారా క్వినోన్ యొక్క వ్యాప్తి ఇరుకైన ప్రోటీన్ ఛానల్ ద్వారా వ్యాప్తి కంటే వేగంగా ఉంటుంది కాబట్టి, ఓపెన్ LH114-W లూప్ క్లోజ్డ్ LH116 లూప్ కంటే వేగవంతమైన RC టర్నోవర్‌ను అనుమతించగలదు మరియు RCలోకి క్వినోన్ యొక్క వ్యాప్తి మరింత పరిమితం కావచ్చు. ప్రోటీన్ W RC ద్వారా క్వినోన్‌ల మార్పిడిని ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము యుబిక్వినోన్ 2 (UQ2) యొక్క నిర్దిష్ట సాంద్రతపై (చిన్న ఐసోప్రేన్ తోకతో సహజ UQ10 యొక్క అనలాగ్) సైటోక్రోమ్ ఆక్సీకరణ పరీక్షను నిర్వహించాము (మూర్తి 2E). చెలేటెడ్ క్వినోన్ ఉనికి స్పష్టమైన మైఖేలిస్ స్థిరాంకం యొక్క ఖచ్చితమైన నిర్ధారణకు ఆటంకం కలిగిస్తున్నప్పటికీ (RC-LH114-W మరియు RC-LH116 వరుసగా 0.2±0.1μM మరియు 0.5±0.2μM లకు అనుకూలంగా ఉంటాయి), RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) యొక్క గరిష్ట రేటు RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) కంటే 28±5% పెద్దది.
కోర్ కాంప్లెక్స్‌లో దాదాపు 10% ప్రోటీన్-W ఉందని మేము మొదట్లో అంచనా వేసాము (16); ఇక్కడ, తక్కువ-కాంతి, మధ్యస్థ-కాంతి మరియు అధిక-కాంతి పెరుగుదల కణాల ఆక్యుపెన్సీ రేట్లు వరుసగా 15±0.6%, 11±1% మరియు 0.9±0.5 (మూర్తి 2F). మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ యొక్క పరిమాణాత్మక పోలిక, హిస్టిడిన్ ట్యాగ్ జోడించడం వల్ల వైల్డ్-టైప్ స్ట్రెయిన్‌లతో పోలిస్తే ప్రోటీన్-W యొక్క సాపేక్ష సమృద్ధి తగ్గలేదని చూపించింది (P = 0.59), కాబట్టి ఈ స్థాయిలు సవరించిన ప్రోటీన్-W యొక్క కళాఖండం కాదు (మూర్తి S10). అయితే, RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో ప్రోటీన్-W యొక్క ఈ తక్కువ ఆక్యుపెన్సీ కొన్ని RCలను వేగవంతమైన రేటుతో తిప్పడానికి అనుమతించవచ్చు, తద్వారా RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌లో నెమ్మదిగా క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని తగ్గిస్తుంది. ఇటీవలి ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ డేటాతో అధిక కాంతి ఆక్యుపెన్సీ రేటు విరుద్ధంగా ఉందని మేము గమనించాము, ఇది బలమైన కాంతి కింద pufW జన్యు వ్యక్తీకరణ పెరుగుతుందని సూచిస్తుంది (మూర్తి S11) (23). RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో pufW ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు ప్రోటీన్-W విలీనం మధ్య వ్యత్యాసం గందరగోళంగా ఉంది మరియు ప్రోటీన్ యొక్క సంక్లిష్ట నియంత్రణను ప్రతిబింబించవచ్చు.
RC-LH114-W లో, 6 కార్డియోలిపిన్ (CDL), 7 ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్ (POPC), 1 ఫాస్ఫాటిడైల్గ్లిసరాల్ (POPG) మరియు 29 β-DDM అణువులను కేటాయించి, దానిలో నమూనా చేశారు 6 CDLలు, 24 POPCలు, 2 POPGలు మరియు 12 βDDMలు. RC-LH116 (చిత్రం 5, A మరియు B). ఈ రెండు నిర్మాణాలలో, CDL దాదాపు కాంప్లెక్స్ యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపున ఉంటుంది, అయితే POPC, POPG మరియు β-DDM ఎక్కువగా లూమినల్ వైపున ఉంటాయి. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క αβ-1 నుండి αβ-6 ప్రాంతంలో రెండు లిపిడ్ మరియు డిటర్జెంట్ అణువులను వేరుచేయబడ్డాయి (చిత్రం 5A), మరియు ఐదు RC-LH116 యొక్క సమాన ప్రాంతంలో వేరుచేయబడ్డాయి (చిత్రం 5B). కాంప్లెక్స్ యొక్క మరొక వైపున మరిన్ని లిపిడ్‌లు కనుగొనబడ్డాయి, ప్రధానంగా CDL, RC మరియు αβ-7 నుండి αβ-13 మధ్య పేరుకుపోయాయి (మూర్తి 5, A మరియు B). ఇతర నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడిన లిపిడ్‌లు మరియు డిటర్జెంట్లు LH1 రింగ్ వెలుపల ఉన్నాయి మరియు బాగా పరిష్కరించబడిన ఎసిల్ గొలుసులు LH1 ఉపయూనిట్‌ల మధ్య విస్తరించి ఉంటాయి, వీటిని తాత్కాలికంగా RC-LH114-Wలో β-DDMగా నియమించారు మరియు RCలో β-DDMగా నిర్వచించారు β-DDM మరియు POPC-LH116 మిశ్రమం. మా నిర్మాణంలో చెలాటింగ్ లిపిడ్‌లు మరియు డిటర్జెంట్ల సారూప్య స్థానాలు అవి శారీరకంగా సంబంధిత బైండింగ్ సైట్‌లు అని సూచిస్తున్నాయి (మూర్తి S12A). Tchలో సమానమైన అణువుల స్థానాలు కూడా మంచి స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉంటాయి. జెంటిల్ మరియు Trv. స్ట్రెయిన్ 970 RC-LH1s (Figure S12, B నుండి E వరకు) (9, 12) మరియు లిపిడ్ హెడ్ గ్రూప్ యొక్క హైడ్రోజన్-బంధన అవశేషాలు సీక్వెన్స్ అలైన్‌మెంట్‌లో (Figure S13) చాలా మంచి పరిరక్షణను చూపించాయి, ఇది RC (24)కి బంధించే కన్జర్వ్డ్ CDL, ఈ సైట్‌లను RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో భద్రపరచవచ్చని సూచిస్తుంది.
(A మరియు B) RC-LH114-W (A) మరియు RC-LH116 (B) పెప్టైడ్‌లను కార్టూన్‌ల ద్వారా సూచిస్తారు మరియు వర్ణద్రవ్యాలను రాడ్‌ల ద్వారా సూచిస్తారు, చిత్రం 1లోని రంగు పథకాన్ని ఉపయోగిస్తారు. లిపిడ్‌లను ఎరుపు రంగులో మరియు డిటర్జెంట్లు బూడిద రంగులో చూపించబడ్డాయి. RC QA మరియు QB సైట్‌లకు కట్టుబడి ఉన్న UQ పసుపు రంగులో ఉంటుంది, అయితే వివిక్త UQ నీలం రంగులో ఉంటుంది. (C మరియు D) లిపిడ్‌లు విస్మరించబడిన (A) మరియు (B) వలె అదే వీక్షణలు. (E నుండి G) RC-LH116 నుండి Q1(E), Q2(F) మరియు Q3(G) యొక్క విస్తారిత వీక్షణ, ఒకదానికొకటి ప్రభావితం చేసే సైడ్ చెయిన్‌లతో. హైడ్రోజన్ బంధాలను నల్లని గీతల రేఖలుగా చూపించారు.
RC-LH116 లో, ఛార్జ్ విభజన ప్రక్రియలో ఎలక్ట్రాన్ బదిలీలో పాల్గొనే RC QA మరియు QB UQ రెండూ వాటి బైండింగ్ సైట్లలో కుళ్ళిపోతాయి. అయితే, RC-LH114-W లో, QB క్వినోన్ పరిష్కరించబడలేదు మరియు క్రింద వివరంగా చర్చించబడుతుంది. QA మరియు QB క్వినోన్‌లతో పాటు, రెండు చెలేటెడ్ UQ అణువులు (RC మరియు LH1 రింగుల మధ్య ఉన్నాయి) RC-LH114-W నిర్మాణంలో వాటి బాగా పరిష్కరించబడిన హెడ్ గ్రూపుల ప్రకారం (వరుసగా Q1 మరియు Q2లో ఉన్నాయి) కేటాయించబడతాయి. స్థలం). మూర్తి 5C). రెండు ఐసోప్రీన్ యూనిట్లు Q1కి కేటాయించబడ్డాయి మరియు సాంద్రత మ్యాప్ Q2 యొక్క పూర్తి 10 ఐసోప్రీన్ తోకలను పరిష్కరిస్తుంది. RC-LH116 నిర్మాణంలో, మూడు చెలేటెడ్ UQ10 అణువులు (Q1 నుండి Q3, Figure 5D) పరిష్కరించబడ్డాయి మరియు అన్ని అణువులు తోక అంతటా స్పష్టమైన సాంద్రతను కలిగి ఉంటాయి (మూర్తి 5, D నుండి G వరకు). రెండు నిర్మాణాలలో, Q1 మరియు Q2 యొక్క క్వినోన్ హెడ్ గ్రూపుల స్థానాలు అద్భుతమైన స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉంటాయి (మూర్తి S12F), మరియు అవి RCతో మాత్రమే సంకర్షణ చెందుతాయి. Q1 RC-LH114-W (మూర్తి 1G మరియు 5, C, D మరియు E) యొక్క W గ్యాప్ ప్రవేశద్వారం వద్ద ఉంది మరియు Q2 QB బైండింగ్ సైట్ (మూర్తి 5, C, D) మరియు F) సమీపంలో ఉంది. సంరక్షించబడిన L-Trp143 మరియు L-Trp269 అవశేషాలు Q1 మరియు Q2 లకు చాలా దగ్గరగా ఉంటాయి మరియు సంభావ్య π-స్టాకింగ్ పరస్పర చర్యలను అందిస్తాయి (మూర్తి 5, E మరియు F, మరియు చిత్రం S12). Q1 యొక్క దూర ఆక్సిజన్ నుండి L-Gln88, 3.0 Å, బలమైన హైడ్రోజన్ బంధాన్ని అందిస్తుంది (మూర్తి 5E); ఈ అవశేషం అత్యంత సుదూర సంబంధం మినహా అన్ని RCలలో సంరక్షించబడుతుంది (మూర్తి S13). L-Ser91 అనేది చాలా ఇతర RCలలో Thr కు ప్రత్యామ్నాయంగా ఉంటుంది (Figure S13), Q1 యొక్క మిథైల్ ఆక్సిజన్ నుండి 3.8 ఆంగ్‌స్ట్రోమ్‌లు ఉంటుంది మరియు బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలను అందించవచ్చు (Figure 5E). Q3 నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యను కలిగి ఉన్నట్లు కనిపించడం లేదు, కానీ RC-M సబ్యూనిట్ మరియు LH1-α సబ్యూనిట్ 5 నుండి 6 మధ్య హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతంలో ఉంది (Figure 5, D మరియు G). Q1, Q2 మరియు Q3 లేదా సమీపంలోని చెలేటెడ్ క్వినోన్‌లు కూడా Tch. జెంటిల్, Trv. స్ట్రెయిన్ 970 మరియు Blcలో పరిష్కరించబడ్డాయి. ఐరిస్ నిర్మాణం (9, 10, 12) RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లోని సంరక్షించబడిన సహాయక క్వినోన్ బైండింగ్ సైట్‌ను సూచిస్తుంది (Figure S12G). RC-LH116 లోని ఐదు కుళ్ళిపోయిన UQలు అధిక పనితీరు గల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) ద్వారా నిర్ణయించబడిన ప్రతి కాంప్లెక్స్ యొక్క 5.8±0.7 తో మంచి ఒప్పందంలో ఉన్నాయి, అయితే RC-LH114-W లోని మూడు కుళ్ళిపోయిన UQలు 6.2±0.3 (Fig. S14) యొక్క కొలిచిన విలువ కంటే తక్కువగా ఉన్నాయి, నిర్మాణంలో పరిష్కరించబడని UQ అణువులు ఉన్నాయని సూచిస్తుంది.
సూడో-సిమెట్రిక్ L మరియు M పాలీపెప్టైడ్‌లు ఒక్కొక్కటి ఐదు TMHలను కలిగి ఉంటాయి మరియు ఒక BChl డైమర్, రెండు BChl మోనోమర్‌లు, రెండు బాక్టీరియోఫేజ్ (BPh) మోనోమర్‌లు మరియు ఒక నాన్-హీమ్ ఐరన్ మరియు ఒకటి లేదా రెండు UQ10 అణువులను కలిపే హెటెరోడైమర్‌ను ఏర్పరుస్తాయి. టెర్మినల్ కీటోన్ సమూహంపై హైడ్రోజన్ బంధాల ఉనికి మరియు Rpsలో దాని తెలిసిన సంచితం ద్వారా, కెరోటినాయిడ్‌లు M-సబ్యూనిట్‌లో చేర్చబడతాయి, దీనిని సిస్-3,4-డీహైడ్రోర్హోడోపిన్ అని పిలుస్తారు. జాతులు (25). RC-H యొక్క బయటి పొర డొమైన్ ఒకే TMH ద్వారా పొరకు లంగరు వేయబడుతుంది. మొత్తం RC నిర్మాణం సంబంధిత జాతుల (Rba) యొక్క మూడు సబ్యూనిట్ RCని పోలి ఉంటుంది (ఉదాహరణకు RBa). స్ఫెరాయిడ్స్ (PDB ID: 3I4D). BChl మరియు BPh యొక్క మాక్రోసైకిల్స్, కెరోటినాయిడ్ వెన్నెముక మరియు నాన్-హీమ్ ఇనుము ఈ నిర్మాణాల రిజల్యూషన్ పరిధిలో అతివ్యాప్తి చెందుతాయి, QA సైట్ వద్ద UQ10 హెడ్ గ్రూప్ మరియు RC-LH116 వద్ద QB క్వినోన్ (మూర్తి S15) వలె.
వేర్వేరు QB సైట్ ఆక్యుపెన్సీ రేట్లతో రెండు RC నిర్మాణాల లభ్యత QB క్వినోన్ బైండింగ్‌తో పాటు స్థిరమైన ఆకృతీకరణ మార్పులను పరిశీలించడానికి ఒక కొత్త అవకాశాన్ని అందిస్తుంది. RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌లో, QB క్వినోన్ పూర్తిగా కట్టుబడి ఉన్న "సామీప్య" స్థానంలో ఉంది (26), కానీ RC-LH114-W యొక్క విభజనలో QB క్వినోన్ లేదు. RC-LH114-Wలో QB క్వినోన్ లేదు, ఇది ఆశ్చర్యకరం ఎందుకంటే కాంప్లెక్స్ క్రియాశీలంగా ఉంది, నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడిన QB క్వినోన్‌తో RC-LH116 కాంప్లెక్స్ కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది. రెండు LH1 రింగులు ఆరు క్వినోన్‌లను చెలేట్ చేసినప్పటికీ, ఐదు క్లోజ్డ్ RC-LH116 రింగ్‌లో నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడతాయి, అయితే ఓపెన్ RC-LH114-W రింగ్‌లో మూడు మాత్రమే నిర్మాణాత్మకంగా పరిమితం చేయబడ్డాయి. ఈ పెరిగిన నిర్మాణ రుగ్మత RC-LH114-W QB సైట్‌ల వేగవంతమైన భర్తీ, కాంప్లెక్స్‌లో వేగవంతమైన క్వినోన్ కైనటిక్స్ మరియు LH1 లూప్‌ను దాటే సంభావ్యతను ప్రతిబింబిస్తుంది. RC-LH114-W యొక్క RC QB సైట్‌లో UQ లేకపోవడం మరింత సంక్లిష్టమైన మరియు మరింత చురుకైన కాంప్లెక్స్ ఫలితంగా ఉండవచ్చని మేము సూచిస్తున్నాము మరియు RC-LH114-W యొక్క QB సైట్ వెంటనే UQ టర్నోవర్‌లో స్తంభింపజేయబడింది. నిర్దిష్ట దశ (QB సైట్ ప్రవేశ ద్వారం మూసివేయబడింది) ఈ కార్యాచరణ యొక్క ఆకృతిని ప్రతిబింబిస్తుంది.
QB లేకుండా, L-Phe217 యొక్క UQ10 బైండింగ్‌కు అననుకూలమైన స్థానానికి భ్రమణం, ఎందుకంటే ఇది తోక యొక్క మొదటి ఐసోప్రేన్ యూనిట్‌తో ప్రాదేశిక తాకిడికి కారణమవుతుంది (మూర్తి 6A). అదనంగా, స్పష్టమైన ప్రధాన ఆకృతీకరణ మార్పులు స్పష్టంగా ఉన్నాయి, ముఖ్యంగా హెలిక్స్ డి (TMH D మరియు E మధ్య లూప్‌లోని చిన్న హెలిక్స్) ఇక్కడ L-Phe217 QB బైండింగ్ పాకెట్‌కు మార్చబడుతుంది మరియు L-Tyr223 యొక్క భ్రమణం (మూర్తి 6A) M-Asp45 ఫ్రేమ్‌వర్క్‌తో హైడ్రోజన్ బంధాన్ని విచ్ఛిన్నం చేయడానికి మరియు QB బైండింగ్ సైట్ ప్రవేశద్వారం మూసివేయడానికి (మూర్తి 6B). హెలిక్స్ దాని బేస్ వద్ద పివోట్‌లను చేస్తుంది, L-Ser209 యొక్క Cα 0.33Å ద్వారా మార్చబడుతుంది, అయితే L-Val221Cα 3.52Å ద్వారా మార్చబడుతుంది. TMH D మరియు E లలో గమనించదగిన మార్పులు లేవు, ఇవి రెండు నిర్మాణాలలోనూ సూపర్ ఇంపాజిబుల్ (మూర్తి 6A). మనకు తెలిసినంతవరకు, సహజ RCలో QB సైట్‌ను మూసివేసే మొదటి నిర్మాణం ఇది. పూర్తి (QB-బౌండ్) నిర్మాణంతో పోల్చినప్పుడు, క్వినోన్ తగ్గించబడటానికి ముందు, దానిని క్వినోన్‌లోకి ప్రవేశించడానికి ఒక ఆకృతీకరణ మార్పు అవసరమని చూపిస్తుంది. L-Phe217 క్వినోన్ హెడ్ గ్రూప్‌తో π-స్టాకింగ్ ఇంటరాక్షన్‌ను ఏర్పరచడానికి తిరుగుతుంది మరియు హెలిక్స్ బయటికి మారుతుంది, దీని వలన L-Gly222 యొక్క అస్థిపంజరం మరియు L-Tyr223 యొక్క సైడ్ చైన్ స్థిరమైన హైడ్రోజన్ బాండ్ నిర్మాణంతో హైడ్రోజన్ బాండ్ నెట్‌వర్క్‌ను ఏర్పరుస్తాయి (మూర్తి 6, A మరియు C).
(ఎ) హోలోగ్రామ్ (ఎల్ గొలుసు, నారింజ/ఎం గొలుసు, మెజెంటా) మరియు అపో (బూడిద) నిర్మాణం యొక్క అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్టూన్, దీనిలో కీ అవశేషాలు రాడ్ లాంటి ప్రాతినిధ్యం రూపంలో ప్రదర్శించబడతాయి. UQ10 పసుపు పట్టీ ద్వారా సూచించబడుతుంది. చుక్కల రేఖ మొత్తం నిర్మాణంలో ఏర్పడిన హైడ్రోజన్ బంధాలను సూచిస్తుంది. (బి మరియు సి) అపోలిపోప్రొటీన్ మరియు మొత్తం రింగ్ నిర్మాణం యొక్క ఉపరితల ప్రాతినిధ్యం, వరుసగా నీలం రంగులో L-Phe217 మరియు ఎరుపు రంగులో L-Tyr223 యొక్క సైడ్ చైన్ ఆక్సిజన్‌ను హైలైట్ చేస్తుంది. L సబ్యూనిట్ నారింజ రంగులో ఉంటుంది; M మరియు H సబ్యూనిట్‌లు రంగులో ఉండవు. (డి మరియు ఇ) అపోలిపోప్రొటీన్ (డి) మరియు మొత్తం (ఇ) ఆర్‌సి క్యూబి సైట్‌లు [వరుసగా (ఎ) ద్వారా రంగు] మరియు థర్మోఫిలస్ థర్మోఫిలస్ పిఎస్‌ఐఐ (ప్లాస్టిక్ క్వినోన్‌తో ఆకుపచ్చ, నీలం; పిడిబి ఐడి: 3WU2) సమలేఖనం (58).
ఊహించని విధంగా, LH1 లేని QB-లోపం ఉన్న RCల యొక్క అనేక నిర్మాణాలు అందుబాటులో ఉన్నప్పటికీ, ఈ అధ్యయనంలో గమనించిన ఆకృతీకరణ మార్పులు ఇంతకు ముందు నివేదించబడలేదు. వీటిలో Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) మరియు Rba. స్ఫెరాయిడ్స్ (PDB ID: 1OGV) (29) నుండి QB క్షీణత నిర్మాణం ఉన్నాయి, ఇవన్నీ వాటి మొత్తం QB నిర్మాణంతో దాదాపు సమానంగా ఉంటాయి. 3PRC యొక్క దగ్గరి పరిశీలనలో LDAO (లౌరిల్ డైమెథైల్ అమైన్ ఆక్సైడ్) డిటర్జెంట్ అణువులు QB స్థానం ప్రవేశద్వారం వద్ద బంధిస్తాయని తేలింది, ఇది క్లోజ్డ్ కన్ఫర్మేషన్‌లోకి పునర్వ్యవస్థీకరణను నిరోధించవచ్చు. 1EYS లేదా 1OGVలో LDAO ఒకే స్థానంలో కుళ్ళిపోనప్పటికీ, ఈ RCలు ఒకే డిటర్జెంట్‌ని ఉపయోగించి తయారు చేయబడతాయి మరియు అందువల్ల అదే ప్రభావాన్ని ఉత్పత్తి చేయవచ్చు. Rba యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం. సైటోక్రోమ్ c2 (PDB ID: 1L9B) తో సహ-స్ఫటికీకరించబడిన స్ఫెరాయిడ్స్ RC కూడా క్లోజ్డ్ QB సైట్‌ను కలిగి ఉన్నట్లు అనిపిస్తుంది. అయితే, ఈ సందర్భంలో, RC-M పాలీపెప్టైడ్ యొక్క N-టెర్మినల్ ప్రాంతం (Q హెలిక్స్‌లోని టైర్ అవశేషం యొక్క H బంధం ద్వారా QB బైండింగ్ సైట్‌తో సంకర్షణ చెందుతుంది) అసహజ ఆకృతిని స్వీకరిస్తుంది మరియు QB ఆకృతీకరణ మార్పును మరింత అన్వేషించలేదు (30). RC-LH114-W నిర్మాణంలో M పాలీపెప్టైడ్ యొక్క ఈ రకమైన వైకల్యాన్ని మనం చూడలేదనేది భరోసా కలిగించే విషయం, ఇది RC-LH116 RC యొక్క N-టెర్మినల్ ప్రాంతంతో దాదాపు సమానంగా ఉంటుంది. డిటర్జెంట్-ఆధారిత LH1 యాంటెన్నా నిర్మూలన తర్వాత, PDBలోని అపోలిపోప్రొటీన్ RCలు పరిష్కరించబడ్డాయని కూడా గమనించాలి, ఇది RC మరియు చుట్టుపక్కల LH1 రింగ్ యొక్క లోపలి ఉపరితలం మధ్య అంతరంలో అంతర్గత క్వినోన్ పూల్స్ మరియు లిపిడ్‌లను తొలగించింది (31, 32). RC క్రియాత్మకంగా ఉంటుంది ఎందుకంటే ఇది అన్ని కోఫాక్టర్లను నిలుపుకుంటుంది, ఎందుకంటే కుళ్ళిపోయే QB క్వినోన్ తప్ప, ఇది తక్కువ స్థిరంగా ఉంటుంది మరియు తయారీ ప్రక్రియలో తరచుగా కోల్పోతుంది (33). అదనంగా, LH1 మరియు సహజ చక్రీయ లిపిడ్‌లను RC నుండి తొలగించడం వలన ఛార్జ్-వేరు చేయబడిన P+QB-స్థితి యొక్క జీవితకాలం తగ్గించడం వంటి ఫంక్షన్లపై ప్రభావం చూపుతుందని తెలుసు (31, 34, 35). అందువల్ల, RC చుట్టూ ఉన్న స్థానిక LH1 రింగ్ ఉనికి "క్లోజ్డ్" QB సైట్‌ను నిర్వహించవచ్చని, తద్వారా QB దగ్గర స్థానిక వాతావరణాన్ని కాపాడుతుందని మేము ఊహిస్తున్నాము.
అపోలిపోప్రొటీన్ (QB క్వినోన్ లేకుండా) మరియు పూర్తి నిర్మాణం QB సైట్ యొక్క టర్నోవర్ యొక్క రెండు స్నాప్‌షాట్‌లను మాత్రమే సూచిస్తున్నప్పటికీ, వరుస సంఘటనల కంటే, హైడ్రోక్వినోన్ ద్వారా రీబైండింగ్‌ను నిరోధించడానికి బైండింగ్‌ను గేట్ చేయవచ్చని సూచనలు ఉన్నాయి. అపోలిపోప్రొటీన్ యొక్క QB సైట్ దగ్గర క్వినోలోల్ మరియు క్వినోన్ యొక్క పరస్పర చర్య భిన్నంగా ఉండవచ్చు, ఇది RC ద్వారా దాని తిరస్కరణకు దారితీస్తుంది. క్వినోన్‌ల బైండింగ్ మరియు తగ్గింపులో కన్ఫర్మేషనల్ మార్పులు పాత్ర పోషిస్తాయని చాలా కాలంగా ప్రతిపాదించబడింది. డార్క్ అడాప్టేషన్ తర్వాత క్వినోన్‌లను తగ్గించే ఘనీభవించిన RCల సామర్థ్యం బలహీనపడుతుంది (36); X-రే క్రిస్టల్లాగ్రఫీ ఈ నష్టం QB క్వినోన్‌లు క్రియాశీల ప్రాక్సిమల్ స్థానం నుండి 4.5 Å దూరంలో "డిస్టల్" కన్ఫర్మేషన్‌లో చిక్కుకున్నందున సంభవిస్తుందని చూపిస్తుంది (26), 37). ఈ డిస్టాల్ బైండింగ్ కన్ఫర్మేషన్ అపోలిపోప్రొటీన్ మరియు పూర్తి రింగ్ స్ట్రక్చర్ మధ్య ఇంటర్మీడియట్ స్థితి యొక్క స్నాప్‌షాట్ అని మేము సూచిస్తున్నాము, ఇది క్వినోన్‌తో ప్రారంభ పరస్పర చర్య మరియు QB సైట్ తెరవడం తర్వాత జరుగుతుంది.
కొన్ని ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియా మరియు సైనోబాక్టీరియా, ఆల్గే మరియు మొక్కల PSII కాంప్లెక్స్‌లో కనిపించే రకం II RC నిర్మాణాత్మక మరియు క్రియాత్మక పరిరక్షణను కలిగి ఉంటుంది (38). చిత్రం 6 (D మరియు E)లో చూపిన నిర్మాణ అమరిక PSII RCలు మరియు బాక్టీరియల్ RC కాంప్లెక్స్ యొక్క QB సైట్ మధ్య సారూప్యతను నొక్కి చెబుతుంది. క్వినోన్ బైండింగ్ మరియు తగ్గింపు యొక్క దగ్గరి సంబంధం ఉన్న వ్యవస్థలను అధ్యయనం చేయడానికి ఈ పోలిక చాలా కాలంగా ఒక నమూనాగా ఉంది. మునుపటి ప్రచురణలు ఆకృతీకరణ మార్పులు క్వినోన్‌ల PSII తగ్గింపుతో కూడి ఉంటాయని సూచించాయి (39, 40). అందువల్ల, RC యొక్క పరిణామ పరిరక్షణను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, ఇంతకు ముందు గమనించని ఈ బైండింగ్ విధానం ఆక్సిజన్‌తో కూడిన ఫోటోట్రోఫిక్ మొక్కలలోని PSII RC యొక్క QB సైట్‌కు కూడా వర్తించవచ్చు.
Rps ΔpufW (లేబుల్ చేయని pufW తొలగింపు) మరియు PufW-His (C-టెర్మినల్ 10x హిస్-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్రోటీన్-W సహజ pufW లోకస్) జాతుల నుండి వ్యక్తీకరించబడింది. palustris CGA009 మా మునుపటి పని (16)లో వివరించబడింది. ఈ జాతులు మరియు ఐసోజెనిక్ వైల్డ్-టైప్ పేరెంట్‌ను PYE (ప్రతి 5 గ్రా లీటర్ -1) (LBలో -80 °C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది, 50% (w/v) గ్లిసరాల్) ప్రోటీన్, ఈస్ట్ సారం మరియు సక్సినేట్ కలిగి ఉంటుంది) అగర్ [1.5% (w/v)] ప్లేట్‌పై కొద్ది సంఖ్యలో కణాలను స్ట్రీక్ చేయడం ద్వారా ఫ్రీజర్ నుండి తిరిగి పొందారు. ప్లేట్‌ను రాత్రిపూట గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో వాయురహిత పరిస్థితులలో పొదిగించి, ఆపై OSRAM 116-W హాలోజన్ బల్బులు (RS కాంపోనెంట్స్, UK) అందించిన తెల్లని కాంతితో (~50 μmolm-2 s-1) 3 నుండి 5 రోజుల పాటు ఒకే కాలనీ కనిపించే వరకు ప్రకాశింపజేస్తారు. ఒకే కాలనీలో 10 ml M22+ మీడియం (41) ను 0.1% (w/v) కాసమినో ఆమ్లాలతో (ఇకపై M22 అని పిలుస్తారు) కలిపి టీకాలు వేశారు. చీకటిలో 34°C వద్ద తక్కువ ఆక్సిజన్ పరిస్థితులలో 180 rpm వద్ద 48 గంటల పాటు కల్చర్‌ను పెంచారు, ఆపై అదే పరిస్థితులలో 70 ml కల్చర్‌ను 24 గంటల పాటు టీకాలు వేశారు. 30 ml యూనివర్సల్ స్క్రూ-టాప్ పారదర్శక గాజు సీసాలో 30 ml M22 మీడియంను టీకాలు వేయడానికి 1 ml వాల్యూమ్‌తో సెమీ-ఏరోబిక్ కల్చర్‌ను ఉపయోగిస్తారు మరియు స్టెరైల్ అయస్కాంత శక్తి స్టిరింగ్ రాడ్ ద్వారా 48 గంటల పాటు ఆందోళన (~50μmolm-2 s-1)తో రేడియేషన్ చేశారు. తర్వాత అదే పరిస్థితులలో 30 ml కల్చర్‌ను 1 లీటరు కల్చర్‌తో టీకాలు వేశారు, తరువాత 72 గంటల పాటు ~200 μmolm-2 s-1 వద్ద ప్రకాశించే 9 లీటర్ల కల్చర్‌ను టీకాలు వేయడానికి ఉపయోగించారు. కణాలను 7132 RCF వద్ద 30 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించి, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) యొక్క ~10 ml లో తిరిగి అమర్చి, అవసరమైనంత వరకు -20°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
కరిగించిన తర్వాత, తిరిగి అమర్చిన కణాలకు డియోక్సిరిబోన్యూక్లీస్ I (మెర్క్, UK), లైసోజైమ్ (మెర్క్, UK) మరియు రెండు రోచె హోలోఎంజైమ్ ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ మాత్రలు (మెర్క్, UK) యొక్క కొన్ని స్ఫటికాలను జోడించండి. 20,000 psi ఫ్రెంచ్ ప్రెజర్ సెల్ (అమింకో, USA)లో, కణాలు 8 నుండి 12 సార్లు అంతరాయం కలిగింది. 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 18,500 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పగలని కణాలు మరియు కరగని శిధిలాలను తొలగించిన తర్వాత, 43,000°C వద్ద 2 గంటల పాటు 113,000 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పొరను వర్ణద్రవ్యం కలిగిన లైసేట్ నుండి అవక్షేపించారు. కరిగే భిన్నాన్ని విస్మరించి, 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0) యొక్క 100 నుండి 200 mlలో రంగు పొరను తిరిగి అమర్చండి మరియు కనిపించే సజాతీయత లేని వరకు సజాతీయపరచండి. సస్పెండ్ చేయబడిన పొరను 2% (w/v) β-DDM కలిగిన 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (అనాట్రేస్, USA)లో 4°C వద్ద చీకటి ప్రదేశంలో 1 గంట పాటు సున్నితంగా కదిలిస్తూ పొదిగించారు. తరువాత 70°C వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి 4°C వద్ద 150,000 RCFను 1 గంట పాటు కరిగించి అవశేష కరగని పదార్థాలను తొలగించారు.
ΔpufW స్ట్రెయిన్ నుండి ద్రావణీకరణ పొరను 0.03% (w / v) β-DDM కలిగిన మూడు కాలమ్ వాల్యూమ్‌లు (CV) బైండింగ్ బఫర్ [20 mM tris-HCl (pH 8.0)] కలిగిన 50 ml DEAE సెఫరోస్ అయాన్ ఎక్స్ఛేంజ్ కాలమ్‌కు వర్తింపజేయబడింది. రెండు CV బైండింగ్ బఫర్‌లతో కాలమ్‌ను కడగాలి, ఆపై 50 mM NaCl కలిగిన రెండు బైండింగ్ బఫర్‌లతో కాలమ్‌ను కడగాలి. RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌ను 1.75 CV పై 150 నుండి 300 mM NaCl (బైండింగ్ బఫర్‌లో) యొక్క లీనియర్ గ్రేడియంట్‌తో తొలగించారు మరియు మిగిలిన బైండింగ్ కాంప్లెక్స్‌ను 0.5 CV పై 300 mM NaCl కలిగిన బైండింగ్ బఫర్‌తో తొలగించారు. 250 మరియు 1000 nm మధ్య శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించి, శోషణ నిష్పత్తి (A880/A280) 1 కంటే ఎక్కువగా ఉన్న భిన్నాన్ని 880 నుండి 280 nm వద్ద ఉంచండి, బైండింగ్ బఫర్‌లో రెండుసార్లు పలుచన చేయండి మరియు DEAE కాలమ్‌లో మళ్ళీ అదే విధానాన్ని శుద్ధీకరణపై ఉపయోగించండి. 1.7 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 3.0 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులతో భిన్నాలను పలుచన చేయండి, మూడవ రౌండ్ అయాన్ మార్పిడిని నిర్వహించండి మరియు 2.2 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 5.0 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులతో భిన్నాలను నిలుపుకోండి. పాక్షికంగా శుద్ధి చేయబడిన కాంప్లెక్స్‌ను అమికాన్ 100,000 మాలిక్యులర్ వెయిట్ కట్-ఆఫ్ (MWCO) సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్ (మెర్క్, UK)లో ~2 ml వరకు కేంద్రీకరించి, 200 mM NaCl బఫర్ కలిగిన సూపర్‌డెక్స్ 200 16/600 సైజు మినహాయింపు కాలమ్ (GE హెల్త్‌కేర్, US)పై లోడ్ చేసి, ఆపై అదే బఫర్‌లో 1.5 CV వద్ద తొలగించారు. సైజు మినహాయింపు భిన్నం యొక్క శోషణ స్పెక్ట్రాను సేకరించి, 2.4 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులతో మరియు 5.8 నుండి 100 A880 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులతో శోషణ స్పెక్ట్రాను కేంద్రీకరించి, వెంటనే వాటిని క్రయో-TEM గ్రిడ్ తయారీ లేదా నిల్వ కోసం ఉపయోగించండి -80°C వద్ద అవసరమైనంత వరకు ఉంచండి.
PufW-His స్ట్రెయిన్ నుండి ద్రావణీకరణ పొరను IMAC బఫర్ (GE హెల్త్‌కేర్) లోని 20 ml HisPrep FF Ni-NTA సెఫరోస్ కాలమ్ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) 200 mM NaCl మరియు 0.03% (w/w)) కు వర్తింపజేయబడింది. కాలమ్‌ను ఐదు CVల IMAC బఫర్‌తో, ఆపై 10 mM హిస్టిడిన్ కలిగిన ఐదు CVల IMAC బఫర్‌తో కడిగేశారు. కోర్ కాంప్లెక్స్‌ను 100 mM హిస్టిడిన్ కలిగిన ఐదు IMAC బఫర్‌లతో కాలమ్ నుండి తొలగించారు. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్‌ను కలిగి ఉన్న భిన్నాన్ని అమికాన్ 100,000 MWCO ఫిల్టర్ (మెర్క్, UK) అమర్చిన స్టిర్డ్ ట్యాంక్‌లో ~10 ml వరకు కేంద్రీకరించి, బైండింగ్ బఫర్‌తో 20 సార్లు కరిగించి, ఆపై 25 ml కు కలుపుతారు. DEAE సెఫారోస్ కాలమ్‌లో, బఫర్‌కు కట్టుబడి ఉన్న నాలుగు CVలు ముందుగానే ఉపయోగించబడతాయి. నాలుగు CV బైండింగ్ బఫర్‌లతో కాలమ్‌ను కడగాలి, ఆపై 0 నుండి 100 mM NaCl (బైండింగ్ బఫర్‌లో) లీనియర్ గ్రేడియంట్‌పై ఎనిమిది CVలపై కాంప్లెక్స్‌ను ఎల్యూట్ చేయండి మరియు 100 mM బైండింగ్ బఫర్ కలిగిన మిగిలిన నాలుగు CVలను ఎల్యూట్ చేయండి. సోడియం క్లోరైడ్‌పై ఎల్యూట్ చేయబడిన అవశేష కాంప్లెక్స్‌లను 2.4 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తి మరియు 4.6 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తి భిన్నాలతో కలిపి అమికాన్ 100,000 MWCO సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్‌లో ~2 ml కు కేంద్రీకరించారు మరియు ముందుగానే 1.5 CV IMACతో నింపారు. బఫర్ సూపర్‌డెక్స్ 200 16/600 సైజు మినహాయింపు కాలమ్‌ను సమతౌల్యం చేసి, ఆపై 1.5 CV కంటే ఎక్కువ అదే బఫర్‌లో ఎల్యూట్ చేయబడింది. పరిమాణం-మినహాయింపు భిన్నాల శోషణ వర్ణపటాన్ని సేకరించి, శోషణ వర్ణపటాన్ని 2.1 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులతో మరియు 4.6 నుండి 100 A880 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులతో కేంద్రీకరించండి, వీటిని వెంటనే ఘనీభవించిన TEM గ్రిడ్ తయారీకి ఉపయోగిస్తారు లేదా అవసరమైనంత వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేస్తారు.
తక్కువ ఉష్ణోగ్రత TEM గ్రిడ్‌లను తయారు చేయడానికి లైకా EM GP ఇమ్మర్షన్ ఫ్రీజర్‌ను ఉపయోగించారు. ఈ కాంప్లెక్స్‌ను IMAC బఫర్‌లో 50 యొక్క A880కి కరిగించారు, ఆపై 5μlని కొత్తగా గ్లో-డిశ్చార్జ్ చేయబడిన QUANTIFOIL 1.2/1.3 కార్బన్-కోటెడ్ కాపర్ మెష్ (అగర్ సైంటిఫిక్, UK)పై లోడ్ చేశారు. గ్రిడ్‌ను 20°C మరియు 60% సాపేక్ష ఆర్ద్రత వద్ద 30 సెకన్ల పాటు పొదిగించి, ఆపై 3 సెకన్ల పాటు ఆరబెట్టి, ఆపై -176°C వద్ద ద్రవ ఈథేన్‌లో చల్లబరిచారు.
RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క డేటాను eBIC (ఎలక్ట్రానిక్ బయోఇమేజింగ్ సెంటర్) (బ్రిటిష్ డైమండ్ లైట్ సోర్స్)లో టైటాన్ క్రియోస్ మైక్రోస్కోప్‌తో రికార్డ్ చేశారు, ఇది 300kV యాక్సిలరేటింగ్ వోల్టేజ్ వద్ద పనిచేస్తుంది, నామమాత్రపు మాగ్నిఫికేషన్ 130,000× మరియు శక్తి- 20 eV గ్యాప్‌ని ఎంచుకోండి. డేటాను సేకరించడానికి లెక్కింపు మోడ్‌లో చిత్రాలను రికార్డ్ చేయడానికి K2 పీక్ డిటెక్టర్‌తో కూడిన గటాన్ 968 GIF క్వాంటం ఉపయోగించబడింది. క్రమాంకనం చేయబడిన పిక్సెల్ పరిమాణం 1.048Å, మరియు మోతాదు రేటు 3.83 e-Å-2s-1. 11 సెకన్లలో సినిమాను సేకరించి 40 భాగాలుగా విభజించారు. మైక్రోస్కోప్‌ను తిరిగి ఫోకస్ చేయడానికి కార్బన్-కోటెడ్ ప్రాంతాన్ని ఉపయోగించండి, ఆపై ప్రతి రంధ్రంలో మూడు సినిమాలను సేకరించండి. మొత్తంగా, 3130 సినిమాలు సేకరించబడ్డాయి, డీఫోకస్ విలువలు -1 మరియు -3μm మధ్య ఉన్నాయి.
RC-LH116 కాంప్లెక్స్ కోసం డేటాను ఆస్టర్‌బరీ బయోస్ట్రక్చర్ లాబొరేటరీ (యూనివర్శిటీ ఆఫ్ లీడ్స్, UK)లో అదే మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి సేకరించారు. 130 k మాగ్నిఫికేషన్‌తో కౌంటింగ్ మోడ్‌లో డేటాను సేకరించారు మరియు పిక్సెల్ పరిమాణాన్ని 4.6 e-Å-2s-1 మోతాదుతో 1.065 Åకి క్రమాంకనం చేశారు. ఈ సినిమాను 12 సెకన్లలో రికార్డ్ చేసి 48 భాగాలుగా విభజించారు. మొత్తంగా, 3359 ఫిల్మ్‌లను సేకరించారు, -1 మరియు -3μm మధ్య డిఫోకస్ విలువలతో.
అన్ని డేటా ప్రాసెసింగ్ Relion 3.0 పైప్‌లైన్ (42)లో నిర్వహించబడుతుంది. డోస్ వెయిటింగ్ ద్వారా బీమ్ మోషన్‌ను సరిచేయడానికి Motioncorr 2 (43)ని ఉపయోగించండి, ఆపై CTF (కాంట్రాస్ట్ ట్రాన్స్‌ఫర్ ఫంక్షన్) పరామితిని నిర్ణయించడానికి CTFFIND 4.1 (44)ని ఉపయోగించండి. ఈ ప్రారంభ ప్రాసెసింగ్ దశల తర్వాత సాధారణ ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్‌లు చిత్రం 2లో చూపబడ్డాయి. S16. 250-పిక్సెల్ ఫ్రేమ్‌లో 1000 కణాలలో దాదాపు 250 పిక్సెల్‌లను మాన్యువల్‌గా ఎంచుకోవడం ద్వారా మరియు రిఫరెన్స్ టూ-డైమెన్షనల్ (2D) వర్గీకరణ లేకుండా ఆటోమేటిక్ సెలక్షన్ టెంప్లేట్ ఉత్పత్తి అవుతుంది, తద్వారా నమూనా కాలుష్యాన్ని కలిసే లేదా గుర్తించదగిన లక్షణాలు లేని వర్గీకరణలను తిరస్కరిస్తుంది. అప్పుడు, అన్ని మైక్రోఫోటోగ్రాఫ్‌లపై ఆటోమేటిక్ సెలక్షన్ నిర్వహించబడింది మరియు RC-LH114-W 849,359 కణాలు, మరియు RC-LH116 కాంప్లెక్స్ 476,547 కణాలు. ఎంచుకున్న అన్ని కణాలు రెండు రౌండ్ల నాన్-రిఫరెన్స్ 2D వర్గీకరణకు గురయ్యాయి మరియు ప్రతి రన్ తర్వాత, కార్బన్ ప్రాంతాన్ని కలిసే కణాలు, నమూనా కాలుష్యం, స్పష్టమైన లక్షణాలు లేకపోవడం లేదా బలంగా అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కణాలు తిరస్కరించబడతాయి, ఫలితంగా 772,033 (90.9%) మరియు 359,678 (75.5%) ) కణాలు వరుసగా RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క 3D వర్గీకరణ కోసం ఉపయోగించబడతాయి. ప్రారంభ 3D రిఫరెన్స్ మోడల్ స్టోకాస్టిక్ గ్రేడియంట్ డీసెంట్ పద్ధతిని ఉపయోగించి రూపొందించబడింది. ప్రారంభ మోడల్‌ను రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగించి, ఎంచుకున్న కణాలను 3Dలో నాలుగు వర్గాలుగా వర్గీకరిస్తారు. ఈ వర్గంలోని మోడల్‌ను రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగించి, అతిపెద్ద వర్గంలోని కణాలపై 3D రిఫైనింగ్ చేయండి, ఆపై ద్రావణి ప్రాంతాన్ని కవర్ చేయడానికి ప్రారంభ 15Å తక్కువ-పాస్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించండి, 6 పిక్సెల్‌ల మృదువైన అంచులను జోడించండి మరియు టాప్ డిటెక్టర్ యొక్క గటాన్ K2 పీక్ మాడ్యులేషన్ బదిలీ ఫంక్షన్‌ను సరిచేయడానికి పిక్సెల్‌లను పోస్ట్-ప్రాసెస్ చేయండి. RC-LH114-W డేటాసెట్ కోసం, ఈ ప్రారంభ నమూనా మాస్క్ అంచుల వద్ద ఉన్న బలమైన సాంద్రతను తొలగించడం ద్వారా సవరించబడింది (UCSF చిమెరాలోని కోర్ కాంప్లెక్స్ సాంద్రత నుండి డిస్‌కనెక్ట్ చేయబడింది). ఫలిత నమూనాలు (RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క రిజల్యూషన్‌లు వరుసగా 3.91 మరియు 4.16 Å) 3D వర్గీకరణ యొక్క రెండవ రౌండ్‌కు సూచనగా ఉపయోగించబడతాయి. ఉపయోగించిన కణాలు ప్రారంభ 3D తరగతిలో వర్గీకరించబడ్డాయి మరియు పొరుగు ప్రాంతంతో బలమైన సహసంబంధాన్ని కలిగి ఉండవు. స్పష్టమైన నిర్మాణ లక్షణాలు అతివ్యాప్తి చెందడం లేదా లేకపోవడం. 3D వర్గీకరణ యొక్క రెండవ రౌండ్ తర్వాత, అత్యధిక రిజల్యూషన్ ఉన్న వర్గం ఎంపిక చేయబడింది [RC-LH114-W కోసం, ఒక వర్గం 377,703 కణాలు (44.5%), RC-LH116 కోసం, రెండు వర్గాలు ఉన్నాయి, మొత్తం 260,752 కణాలు (54.7%) , ఇక్కడ అవి చిన్న తేడాతో ప్రారంభ భ్రమణ తర్వాత సమలేఖనం చేయబడినప్పుడు మాత్రమే ఒకేలా ఉంటాయి]. ఎంచుకున్న కణాలను 400-పిక్సెల్ బాక్స్‌లో తిరిగి సంగ్రహించి, 3D రిఫైనింగ్ ద్వారా శుద్ధి చేస్తారు. ప్రారంభ 15Å లో-పాస్ ఫిల్టర్, 3 పిక్సెల్ మ్యాప్ విస్తరణ మరియు 3 పిక్సెల్ సాఫ్ట్ మాస్క్ ఉపయోగించి ద్రావణి మాస్క్ ఉత్పత్తి అవుతుంది. ప్రతి దశ తర్వాత పర్-పార్టికల్ CTF రిఫైన్‌మెంట్, పర్-పార్టికల్ మోషన్ కరెక్షన్ మరియు పర్-పార్టికల్ CTF రిఫైన్‌మెంట్ యొక్క రెండవ రౌండ్, 3D రిఫైన్‌మెంట్, ద్రావణి మాస్కింగ్ మరియు పోస్ట్-ప్రాసెసింగ్ ఉపయోగించి ఫలిత ఆకృతిని మరింత శుద్ధి చేస్తారు. 0.143 యొక్క FSC (ఫోరియర్ షెల్ కోరిలేషన్ కోఎఫీషియంట్) కట్-ఆఫ్ విలువను ఉపయోగించి, RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క తుది నమూనాల రిజల్యూషన్‌లు వరుసగా 2.65 మరియు 2.80Å. తుది నమూనా యొక్క FSC వక్రత చిత్రం 2. S17లో చూపబడింది.
అన్ని ప్రోటీన్ సీక్వెన్సులు UniProtKB నుండి డౌన్‌లోడ్ చేయబడ్డాయి: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); ప్రోటీన్-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC యొక్క హోమోలజీ మోడల్‌ను నిర్మించడానికి ఉపయోగించబడింది, ఇందులో RC-L, RC-M మరియు RC-H యొక్క ప్రోటీన్ సీక్వెన్సులు మరియు Rba యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం ఉన్నాయి. స్ఫెరాయిడ్స్ RCని టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించారు (PDB ID: 5LSE) (46). ఉత్పత్తి చేయబడిన మోడల్‌ను మ్యాప్‌కు అమర్చడానికి (47), ప్రోటీన్ నిర్మాణాన్ని మెరుగుపరచడానికి మరియు కోఫాక్టర్ [4×BChl a (మోనోమర్ లైబ్రరీ అవశేషం పేరు = BCL), 2×BPh a (BPH), ఒకటి లేదా రెండు రకాల UQ10 (U10), ఒక నాన్-హీమ్ ఇనుము (Fe) మరియు ఒక 3,4-డైహైడ్రోహెక్సాకార్బోనిల్కోలిన్ (QAK)] జోడించడానికి కూట్ (48)ని ఉపయోగించడానికి UCSF చిమెరాలోని “ఫిట్ మ్యాప్” సాధనాన్ని ఉపయోగించండి. మోనోమర్ లైబ్రరీలో QAK అందుబాటులో లేనందున, ఇది PHENIX (49)లోని eLBOW సాధనాన్ని ఉపయోగించి పారామిటరైజ్ చేయబడింది.
తరువాత, LH1 సబ్యూనిట్ నిర్మించబడింది. ప్రారంభంలో, PHENIX (49) లోని ఆటోమేటిక్ కన్స్ట్రక్షన్ టూల్ మ్యాప్ మరియు LH1-α మరియు LH1-β ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లను ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించి LH1 సీక్వెన్స్‌లోని భాగాన్ని స్వయంచాలకంగా నిర్మించడానికి ఉపయోగించబడింది. అత్యంత పూర్తి LH1 సబ్యూనిట్‌ను ఎంచుకుని, దానిని సంగ్రహించి కూట్‌లోకి లోడ్ చేయండి, దానిలో తప్పిపోయిన సీక్వెన్స్‌ను మాన్యువల్‌గా జోడించండి మరియు రెండు BCls a (BCL) మరియు స్పిరిల్లోక్సంతిన్ (CRT) జోడించే ముందు మొత్తం నిర్మాణాన్ని మాన్యువల్‌గా శుద్ధి చేయండి [సంబంధిత Rps ప్రకారం LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క సాంద్రత మరియు తెలిసిన కెరోటినాయిడ్ కంటెంట్. జాతులు (17)]. పూర్తి LH1 సబ్యూనిట్‌ను కాపీ చేసి, LH1 సాంద్రత యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న నాన్-మోడల్ ప్రాంతంలో డాక్ చేయడానికి UCSF చిమెరా “డాకింగ్ మ్యాప్ టూల్”ని ఉపయోగించండి, ఆపై దానిని కూట్‌లో శుద్ధి చేయండి; అన్ని LH1 సబ్యూనిట్‌లు మోడల్ చేయబడే వరకు ప్రక్రియను పునరావృతం చేయండి. RC-LH114-W నిర్మాణం కోసం, కూట్‌లో కేటాయించని సాంద్రతను సంగ్రహించడం ద్వారా, USCF చిమెరా మ్యాప్‌లోని మిగిలిన నాన్-ప్రోటీన్ భాగాల నుండి ప్రోటీన్ విభజించబడుతుంది మరియు ప్రారంభ నమూనాను మరియు మిగిలిన సబ్‌యూనిట్‌లను (ప్రోటీన్-W) మోడలింగ్‌ను స్థాపించడానికి ఆటోబిల్డ్ సాధనం ఉపయోగించబడుతుంది. PHENIX (49)లో. కూట్ (48)లో ఫలిత మోడల్‌కు ఏవైనా తప్పిపోయిన సీక్వెన్స్‌లను జోడించండి, ఆపై మొత్తం సబ్‌యూనిట్‌ను మాన్యువల్‌గా శుద్ధి చేయండి. మిగిలిన కేటాయించని సాంద్రత లిపిడ్‌ల కలయికకు సరిపోతుంది (CDL = CDL, POPC = 6PL మరియు POPG = PGT యొక్క PDB మోనోమర్ లైబ్రరీ ID), β-DDM డిటర్జెంట్ (LMT) మరియు UQ10 అణువులు (U10). మోడల్ గణాంకాలు మరియు ఫిట్ యొక్క దృశ్యమాన నాణ్యతను మరింత మెరుగుపరచలేని వరకు పూర్తి ప్రారంభ మోడల్‌ను పరిపూర్ణం చేయడానికి కూట్ (48)లో PHENIX ఆప్టిమైజేషన్ (49) మరియు మాన్యువల్ ఆప్టిమైజేషన్‌ను ఉపయోగించండి. చివరగా, స్థానిక మ్యాప్‌ను పదును పెట్టడానికి LocScale (50)ని ఉపయోగించండి, ఆపై కేటాయించని సాంద్రత మరియు ఆటోమేటిక్ మరియు మాన్యువల్ ఆప్టిమైజేషన్‌ను మోడలింగ్ చేసే అనేక ఇతర చక్రాలను నిర్వహించండి.
సంబంధిత సాంద్రతలలో డాక్ చేయబడిన సంబంధిత పెప్టైడ్‌లు, కోఫాక్టర్లు మరియు ఇతర లిపిడ్‌లు మరియు క్వినోన్‌లు గణాంకాలు 1 మరియు 2లో చూపబడ్డాయి. S18 నుండి S23 వరకు. తుది నమూనా యొక్క గణాంక సమాచారం టేబుల్ S1లో చూపబడింది.
ప్రత్యేకంగా పేర్కొనకపోతే, UV/Vis/NIR శోషణ స్పెక్ట్రాను Cary60 స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (ఎజిలెంట్, USA) పై 250 nm నుండి 1000 nm వరకు 1 nm విరామాలలో మరియు 0.1s ఇంటిగ్రేషన్ సమయంలో సేకరించారు.
1 యొక్క A880 కు 2 mm మార్గంతో క్వార్ట్జ్ క్యూవెట్‌లో నమూనాను కరిగించి, 400 మరియు 1000 nm మధ్య శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించండి. వృత్తాకార డైక్రోయిక్ స్పెక్ట్రాను జాస్కో 810 స్పెక్ట్రోపోలారిమీటర్ (జాస్కో, జపాన్) పై 400 nm మరియు 950 nm మధ్య 1 nm విరామాలలో 20 nm min-1 స్కాన్ రేటుతో సేకరించారు.
కోర్ కాంప్లెక్స్‌ను సుమారు 50 A880కి కరిగించడం ద్వారా మోలార్ ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫీషియంట్ నిర్ణయించబడుతుంది. 10μl వాల్యూమ్‌ను 990μl బైండింగ్ బఫర్ లేదా మిథనాల్‌లో కరిగించి, BChl క్షీణతను తగ్గించడానికి వెంటనే శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించండి. ప్రతి మిథనాల్ నమూనా యొక్క BChl కంటెంట్‌ను 54.8 mM-1 cm-1 యొక్క 771 nm వద్ద ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫీషియంట్ ద్వారా లెక్కించారు మరియు ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫీషియంట్ నిర్ణయించబడింది (51). కోర్ కాంప్లెక్స్ ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి కొలిచిన BChl ఏకాగ్రతను 32 (RC-LH114-W) లేదా 36 (RC-LH116) ద్వారా విభజించండి, తరువాత బఫర్ ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫీషియంట్‌లో సేకరించిన అదే నమూనా యొక్క శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను నిర్ణయించడానికి దీనిని ఉపయోగిస్తారు. సమాంతరంగా. ప్రతి నమూనాకు మూడు పునరావృత కొలతలు తీసుకోబడ్డాయి మరియు BChl Qy గరిష్ట సగటు శోషణను గణన కోసం ఉపయోగించారు. 878 nm వద్ద కొలిచిన RC-LH114-W యొక్క విలుప్త గుణకం 3280±140 mM-1 cm-1, అయితే 880 nm వద్ద కొలిచిన RC-LH116 యొక్క విలుప్త గుణకం 3800±30 mM-1 cm-1.
(52) లోని పద్ధతి ప్రకారం UQ10 ను లెక్కించారు. సంక్షిప్తంగా, రివర్స్ ఫేజ్ HPLC (RP-HPLC) ను ఎజిలెంట్ 1200 HPLC వ్యవస్థను ఉపయోగించి నిర్వహించారు. 0.02% (w/v) ఫెర్రిక్ క్లోరైడ్ కలిగిన 50μl 50:50 మిథనాల్:క్లోరోఫామ్‌లో సుమారు 0.02 nmol RC-LH116 లేదా RC-LH114-W ను కరిగించి, 40°C వద్ద 1 ml-1 min-1 లో HPLC ద్రావకం (80:20 మిథనాల్:2-ప్రొపనాల్) లో ×25 సెం.మీ. కాలమ్‌పై కరిగించండి. 275 nm (UQ10), 450 nm (కెరోటినాయిడ్లు) మరియు 780 nm (BChl) వద్ద శోషణను పర్యవేక్షించడానికి HPLC ద్రావకంలో ఐసోక్రాటిక్ ఎలుషన్‌ను 1 గంట పాటు నిర్వహించండి. 25.5 నిమిషాలలో 275 nm క్రోమాటోగ్రామ్‌లో గరిష్ట స్థాయిని ఇంటిగ్రేట్ చేశారు, ఇందులో గుర్తించదగిన ఇతర సమ్మేళనాలు ఏవీ లేవు. 0 నుండి 5.8 nmol వరకు స్వచ్ఛమైన ప్రమాణాల ఇంజెక్షన్ నుండి లెక్కించిన అమరిక వక్రరేఖకు సంబంధించి సేకరించిన UQ10 యొక్క మోలార్ మొత్తాన్ని లెక్కించడానికి ఇంటిగ్రేటెడ్ ప్రాంతం ఉపయోగించబడుతుంది (మూర్తి S14). ప్రతి నమూనాను మూడు ప్రతిరూపాలలో విశ్లేషించారు మరియు నివేదించబడిన లోపం సగటు యొక్క SDకి అనుగుణంగా ఉంటుంది.
0.1 గరిష్ట Qy శోషణ కలిగిన RC-LH1 కాంప్లెక్స్ కలిగిన ద్రావణాన్ని 30 μM తగ్గిన హార్స్ హార్ట్ సైటోక్రోమ్ c2 (మెర్క్, UK) మరియు 0 నుండి 50 μMUQ2 (మెర్క్, UK) తో తయారు చేశారు. ప్రతి UQ2 గాఢత వద్ద మూడు 1-ml నమూనాలను తయారు చేసి, కొలతకు ముందు చీకటికి పూర్తిగా అనుగుణంగా ఉండేలా 4°C వద్ద రాత్రిపూట చీకటిలో పొదిగించారు. ద్రావణాన్ని 300 nm ఫ్లేమ్/500 లైన్ గ్రేటింగ్, 1.24 mm ఇన్లెట్, 0.12 mm మిడిల్ మరియు 0.6 mm అవుట్‌లెట్ స్లిట్‌లతో అమర్చిన OLIS RSM1000 మాడ్యులర్ స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌లోకి లోడ్ చేశారు. ఉత్తేజిత కాంతిని మినహాయించడానికి నమూనా ఫోటోట్యూబ్ మరియు రిఫరెన్స్ ఫోటోమల్టిప్లియర్ ట్యూబ్ ప్రవేశద్వారం వద్ద 600 nm పొడవైన పాస్ ఫిల్టర్ ఉంచబడింది. 0.15 సెకన్ల ఇంటిగ్రేషన్ సమయంతో 550 nm వద్ద శోషణను పర్యవేక్షించారు. ఉత్తేజిత కాంతి 880 nm M880F2 LED (లైట్ ఎమిటింగ్ డయోడ్) (థోర్లాబ్స్ లిమిటెడ్, UK) నుండి ఫైబర్ ఆప్టిక్ కేబుల్ ద్వారా 90% తీవ్రతతో DC2200 కంట్రోలర్ (థోర్లాబ్స్ లిమిటెడ్, UK) ద్వారా విడుదలవుతుంది మరియు 90° కోణంలో కాంతి మూలానికి విడుదల చేయబడుతుంది. నమూనా ద్వారా ప్రారంభంలో గ్రహించబడని ఏదైనా కాంతిని తిరిగి ఇవ్వడానికి కొలిచే పుంజం అద్దానికి వ్యతిరేకంగా ఉంటుంది. 50 సెకన్ల ప్రకాశానికి 10 సెకన్ల ముందు శోషణను పర్యవేక్షించండి. తరువాత క్వినోలోల్ సైటోక్రోమ్ c23 + ను ఎంతవరకు ఆకస్మికంగా తగ్గిస్తుందో అంచనా వేయడానికి చీకటిలో 60 సెకన్ల పాటు శోషణను మరింత పర్యవేక్షించారు (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S8 చూడండి).
0.5 నుండి 10 సెకన్లలోపు (UQ2 గాఢతను బట్టి) లీనియర్ ప్రారంభ రేటును అమర్చడం ద్వారా మరియు ప్రతి UQ2 గాఢత వద్ద మూడు నమూనాల రేట్లను సగటున లెక్కించడం ద్వారా డేటా ప్రాసెస్ చేయబడింది. సంబంధిత విలుప్త గుణకం ద్వారా లెక్కించబడిన RC-LH1 గాఢత రేటును ఉత్ప్రేరక సామర్థ్యంగా మార్చడానికి ఉపయోగించబడింది, ఆరిజిన్ ప్రో 2019 (ఆరిజిన్‌ల్యాబ్, USA)లో ప్లాట్ చేయబడింది మరియు స్పష్టమైన Km మరియు Kcat విలువలను నిర్ణయించడానికి మైఖేలిస్-మెంటెన్ మోడల్‌కు అమర్చబడింది.
తాత్కాలిక శోషణ కొలతల కోసం, RC-LH1 నమూనాను 50 mM సోడియం ఆస్కార్బేట్ (మెర్క్, USA) మరియు 0.4 mM టెర్బుటిన్ (మెర్క్, USA) కలిగిన IMAC బఫర్‌లో ~2μM కు కరిగించారు. ఆస్కార్బిక్ ఆమ్లాన్ని త్యాగ ఎలక్ట్రాన్ దాతగా ఉపయోగిస్తారు మరియు టెర్ట్-బ్యూటాక్లోఫెన్‌ను QB నిరోధకంగా ఉపయోగిస్తారు, ఇది ప్రధాన RC దాత కొలత ప్రక్రియ అంతటా తగ్గుతూ ఉండేలా చూసుకుంటుంది (అంటే, ఫోటోఆక్సిడైజ్ చేయబడదు). లేజర్ మార్గంలోని నమూనా ఉత్తేజిత పప్పుల మధ్య చీకటి అనుసరణకు తగినంత సమయం ఉందని నిర్ధారించుకోవడానికి 2 mm ఆప్టికల్ పాత్ పొడవుతో కస్టమ్ రొటేటింగ్ సెల్‌కు (సుమారు 0.1 మీ వ్యాసం, 350 RPM) సుమారు 3 ml నమూనా జోడించబడుతుంది. 1 kHz (NIR కోసం 20 nJ లేదా Vis కోసం 100 nJ) పునరావృత రేటుతో 880 nm వద్ద నమూనాను ఉత్తేజపరిచేందుకు Ti: Sapphire లేజర్ సిస్టమ్ (స్పెక్ట్రా ఫిజిక్స్, USA)ను విస్తరించడానికి ~100-fs లేజర్ పప్పులను ఉపయోగించండి. డేటాను సేకరించే ముందు, నమూనాను దాదాపు 30 నిమిషాల పాటు ఉత్తేజిత కాంతికి బహిర్గతం చేయండి. ఎక్స్‌పోజర్ QA ని నిష్క్రియం చేయడానికి కారణమవుతుంది (బహుశా QA ని ఒకటి లేదా రెండుసార్లు తగ్గిస్తుంది). కానీ ఈ ప్రక్రియ రివర్సిబుల్ అని దయచేసి గమనించండి ఎందుకంటే చాలా కాలం చీకటి అనుసరణ తర్వాత, RC నెమ్మదిగా QA కార్యాచరణకు తిరిగి వస్తుంది. -10 నుండి 7000 ps ఆలస్యం సమయంతో తాత్కాలిక స్పెక్ట్రాను కొలవడానికి హీలియోస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (అల్ట్రాఫాస్ట్ సిస్టమ్స్, USA) ఉపయోగించబడింది. డేటా సెట్‌లను అన్‌గ్రూప్ చేయడానికి, ఆపై విలీనం చేయడానికి మరియు ప్రామాణీకరించడానికి సర్ఫేస్ ఎక్స్‌ప్లోరర్ సాఫ్ట్‌వేర్ (అల్ట్రాఫాస్ట్ సిస్టమ్స్, USA) ఉపయోగించండి. క్షయానికి సంబంధించిన అవకలన స్పెక్ట్రాను పొందడానికి మిశ్రమ డేటా సెట్‌ను ఉపయోగించడానికి కార్పెట్‌వ్యూ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (లైట్ కన్వర్షన్ లిమిటెడ్, లిథువేనియా)ని ఉపయోగించండి లేదా ఆరిజిన్ (ఆరిజిన్‌ల్యాబ్, USA)లో సింగిల్-వేవ్‌లెంగ్త్ స్పెక్ట్రల్ పరిణామానికి సరిపోయేలా పరికర ప్రతిస్పందనతో బహుళ ఘాతాంకాలను కలుపుకునే ఫంక్షన్‌ను ఉపయోగించండి.
పైన చెప్పినట్లుగా (53), RC మరియు పరిధీయ LH2 యాంటెన్నా రెండూ లేని LH1 కాంప్లెక్స్‌ను కలిగి ఉన్న కిరణజన్య సంయోగక్రియ ఫిల్మ్ తయారు చేయబడింది. పొరను 20 mM ట్రిస్ (pH 8.0) లో కరిగించి, ఆపై 2 mm ఆప్టికల్ మార్గంతో క్వార్ట్జ్ క్యూవెట్‌లోకి లోడ్ చేశారు. -10 నుండి 7000 ps ఆలస్యం సమయంతో 540 nm వద్ద నమూనాను ఉత్తేజపరిచేందుకు 30nJ లేజర్ పల్స్ ఉపయోగించబడింది. Rps. pal నమూనా కోసం వివరించిన విధంగా డేటా సెట్‌ను ప్రాసెస్ చేయండి.
4°C వద్ద 150,000 RCF వద్ద 2 గంటల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పొరను గుచ్చారు, ఆపై 880 nm వద్ద దాని శోషణను 20 mM tris-HCl (pH 8.0) మరియు 200 mM NaClలలో తిరిగి అమర్చారు. 4°C వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు 2% (w/v) β-DDMలో నెమ్మదిగా కదిలించడం ద్వారా పొరను కరిగించండి. నమూనాను 100 mM ట్రైఇథైలామోనియం కార్బోనేట్ (pH 8.0) (TEAB; మెర్క్, UK)లో 2.5 mg ml-1 ప్రోటీన్ సాంద్రతకు కరిగించారు (బయో-రాడ్ విశ్లేషణ). గతంలో ప్రచురించిన పద్ధతి (54) నుండి మరింత ప్రాసెసింగ్ జరిగింది, 50 μg ప్రోటీన్‌ను 1% (w/v) సోడియం లారేట్ (మెర్క్, UK) కలిగిన మొత్తం 50 μl TEABలోకి పలుచన చేయడంతో ప్రారంభమైంది. 60 సెకన్ల పాటు సోనికేషన్ తర్వాత, దానిని 37°C వద్ద 5 mM ట్రిస్(2-కార్బాక్సిథైల్)ఫాస్ఫైన్ (మెర్క్, UK)తో 30 నిమిషాలు తగ్గించారు. S-ఆల్కైలేషన్ కోసం, నమూనాను 10 mM మిథైల్ S-మిథైల్థియోమెథనేసల్ఫోనేట్ (మెర్క్, UK)తో పొదిగించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 200 mM ఐసోప్రొపనాల్ స్టాక్ ద్రావణం నుండి 10 నిమిషాలు జోడించండి. 2 μg ట్రిప్సిన్/ఎండోప్రొటీనేస్ లైస్-సి మిశ్రమాన్ని (ప్రోమెగా UK) జోడించడం ద్వారా ప్రోటీయోలైటిక్ జీర్ణక్రియ జరిగింది మరియు 37°C వద్ద 3 గంటలు పొదిగించారు. 50 μl ఇథైల్ అసిటేట్ మరియు 10 μl 10% (v/v) LC గ్రేడ్ ట్రైఫ్లోరోఅసిటిక్ యాసిడ్ (TFA; థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) జోడించడం ద్వారా మరియు 60 సెకన్ల పాటు వోర్టెక్సింగ్ చేయడం ద్వారా లారేట్ సర్ఫ్యాక్టెంట్‌ను సంగ్రహించారు. దశ విభజనను 15,700 RCF వద్ద 5 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ప్రోత్సహించారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, పెప్టైడ్‌ను కలిగి ఉన్న దిగువ దశను జాగ్రత్తగా పీల్చుకోవడానికి మరియు డీసాల్ట్ చేయడానికి C18 స్పిన్ కాలమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) ఉపయోగించబడింది. వాక్యూమ్ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ఎండబెట్టిన తర్వాత, నమూనాను 0.5% TFA మరియు 3% అసిటోనిట్రైల్‌లో కరిగించారు మరియు గతంలో వివరించిన సిస్టమ్ పారామితులను ఉపయోగించి మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కలిపి నానోఫ్లో RP క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా 500 ng విశ్లేషించబడింది.
Rps. palustris ప్రోటీమ్ డేటాబేస్ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) కోసం శోధించడానికి ప్రోటీన్ గుర్తింపు మరియు పరిమాణీకరణ కోసం MaxQuant v.1.5.3.30 (56)ని ఉపయోగించండి. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ప్రోటీమిక్స్ డేటా PRIDE భాగస్వామి రిపోజిటరీ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ద్వారా ప్రోటీమ్ ఎక్స్‌ఛేంజ్ అలయన్స్‌లో డేటాసెట్ ఐడెంటిఫైయర్ PXD020402 కింద జమ చేయబడింది.
ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కలిపి RPLC ద్వారా విశ్లేషణ కోసం, RC-LH1 కాంప్లెక్స్ వైల్డ్-టైప్ Rps నుండి తయారు చేయబడింది. గతంలో ప్రచురించిన పద్ధతిని ఉపయోగించి (16), పలుస్ట్రిస్ కణాలలో ఉత్పత్తి చేయబడిన ప్రోటీన్ సాంద్రత 20 mM హెపెస్‌లో 2 mg ml-1 (pH 7.8), 100 mM NaCl మరియు 0.03% (w/v) β- (బయో-రాడ్ విశ్లేషణ) ) DDM. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, అవక్షేపణ పద్ధతి ద్వారా 10 μg ప్రోటీన్‌ను సంగ్రహించడానికి 2D ప్యూరిఫికేషన్ కిట్ (GE హెల్త్‌కేర్, USA)ని ఉపయోగించండి మరియు అవక్షేపణను 20 μl 60% (v/v) ఫార్మిక్ ఆమ్లం (FA), 20% (v/v) అసిటోనిట్రైల్ మరియు 20% (v/v) నీటిలో కరిగించండి. ఐదు మైక్రోలీటర్‌లను RPLC (డయోనెక్స్ RSLC) ద్వారా మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (మాక్సిస్ UHR-TOF, బ్రూకర్)తో కలిపి విశ్లేషించారు. 60°C మరియు 100μlmin -1 వద్ద వేరు చేయడానికి MabPac 1.2×100 mm కాలమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) ఉపయోగించండి, 85% (v / v) ద్రావణి A [0.1% (v / v) FA మరియు 0.02% (V/v) TFA జల ద్రావణం] నుండి 85% (v/v) ద్రావణి B [0.1%(v/v) FA మరియు 0.02%(v/v) 90%(v/v) అసిటోనిట్రైల్ TFA] వరకు ప్రవణతతో. ప్రామాణిక ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ మూలం మరియు 60 నిమిషాల కంటే ఎక్కువ కాలం డిఫాల్ట్ పారామితులను ఉపయోగించి, మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ 100 నుండి 2750 m/z (మాస్-టు-ఛార్జ్ నిష్పత్తి) పొందుతుంది. ExPASy బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ రిసోర్స్ పోర్టల్ FindPept సాధనం (https://web.expasy.org/findpept/) సహాయంతో, మాస్ స్పెక్ట్రమ్‌ను కాంప్లెక్స్ యొక్క ఉపయూనిట్‌లకు మ్యాప్ చేయండి.
కణాలను 100 ml NF-తక్కువ (10μMm-2 s-1), మధ్యస్థ (30μMm-2 s-1) లేదా అధిక (300μMm-2 s-1) కాంతి కింద 72 గంటల పాటు పెంచారు. 100 ml స్క్రూ-టాప్ బాటిల్‌లో M22 మీడియం (M22 మీడియం, దీనిలో అమ్మోనియం సల్ఫేట్ తొలగించబడింది మరియు సోడియం సక్సినేట్ సోడియం అసిటేట్‌తో భర్తీ చేయబడింది) (23). ఐదు 30-సెకన్ల చక్రాలలో, కణాలను లైస్ చేయడానికి 1:1 వాల్యూమ్ నిష్పత్తిలో 0.1 మైక్రాన్ గాజు పూసలను పూసలుగా చేసి 5 నిమిషాలు మంచు మీద చల్లబరిచారు. కరగని పదార్థం, పగలని కణాలు మరియు గాజు పూసలను బెంచ్‌టాప్ మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్‌లో 10 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా 16,000 RCF వద్ద తొలగించారు. ఈ పొరను 10 గంటల పాటు 40/15% (w/w) సుక్రోజ్ ప్రవణతతో 20 mM tris-HCl (pH 8.0)లో 100,000 RCFతో Ti 70.1 రోటర్‌లో వేరు చేశారు.
మా మునుపటి పనిలో వివరించినట్లుగా, PufW (16) పై హిస్ ట్యాగ్ యొక్క ఇమ్యునోడెటెక్షన్. సంక్షిప్తంగా, శుద్ధి చేయబడిన కోర్ కాంప్లెక్స్ (11.8 nM) లేదా 2x SDS లోడింగ్ బఫర్ (మెర్క్, UK)లో RC యొక్క అదే సాంద్రతను కలిగి ఉన్న పొర (తగ్గిన వ్యత్యాస స్పెక్ట్రమ్‌ను తీసివేసి, స్టెయిన్డ్ జెల్‌పై లోడ్‌ను సరిపోల్చడం ద్వారా ఆక్సీకరణం ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది) రెండుసార్లు కరిగించబడింది. ప్రోటీన్‌లను 12% బిస్-ట్రిస్ నుపేజ్ జెల్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) ప్రతిరూపంపై వేరు చేశారు. RC-L సబ్యూనిట్‌ను లోడ్ చేయడానికి మరియు దృశ్యమానం చేయడానికి కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ (బయో-రాడ్, UK)తో ఒక జెల్‌ను స్టెయిన్ చేశారు. రెండవ జెల్‌లోని ప్రోటీన్‌ను ఇమ్యునోఅస్సే కోసం మిథనాల్-యాక్టివేటెడ్ పాలీవినైలిడిన్ ఫ్లోరైడ్ (PVDF) పొర (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK)కి బదిలీ చేశారు. PVDF పొరను 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 మరియు 5% (w / v) స్కిమ్డ్ మిల్క్ పౌడర్‌లో బ్లాక్ చేసి, ఆపై యాంటీ-హిస్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీతో (డైల్యూట్ ది యాంటీబాడీ బఫర్ [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl మరియు 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, బెథైల్ లాబొరేటరీస్, USAలో) 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 5 నిమిషాలు 3 సార్లు కడిగిన తర్వాత, పొరను హార్స్రాడిష్ పెరాక్సిడేస్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, UK) యాంటీ-మౌస్ సెకండరీ యాంటీబాడీ (యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 1:10,000 కరిగించబడింది)తో కలిపారు. WESTAR ETA C 2.0 కెమిలుమినిసెన్స్ సబ్‌స్ట్రేట్ (సైనాజెన్, ఇటలీ) మరియు అమెర్‌షామ్ ఇమేజర్ 600 (GE హెల్త్‌కేర్, UK) ఉపయోగించి గుర్తింపును అనుమతించడానికి (యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 3 వాష్‌ల తర్వాత 5 నిమిషాలు) ఇంక్యుబేట్ చేయండి.
ఇమేజ్‌జే (57)లో ప్రతి స్టెయిన్డ్ జెల్ లేదా ఇమ్యునోఅస్సే లేన్ యొక్క తీవ్రత పంపిణీని గీయడం ద్వారా, శిఖరం కింద ఉన్న ప్రాంతాన్ని ఏకీకృతం చేయడం ద్వారా మరియు RC-L (స్టెయిన్డ్ జెల్) మరియు ప్రోటీన్-W (ఇమ్యునోఅస్సే) యొక్క తీవ్రత నిష్పత్తిని లెక్కించడం ద్వారా చిత్రాన్ని ప్రాసెస్ చేయండి. స్వచ్ఛమైన RC-LH114-W నమూనాలో RC-L మరియు ప్రోటీన్-W నిష్పత్తి 1:1 అని భావించి, మొత్తం డేటా సెట్‌ను తదనుగుణంగా సాధారణీకరించడం ద్వారా ఈ నిష్పత్తులను మోలార్ నిష్పత్తులుగా మార్చారు.
ఈ వ్యాసం కోసం అనుబంధ సామగ్రి కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్ లైసెన్స్ నిబంధనల ప్రకారం పంపిణీ చేయబడిన ఓపెన్ యాక్సెస్ వ్యాసం. అసలు రచనను సరిగ్గా ఉదహరించినట్లయితే ఈ వ్యాసం ఏ మాధ్యమంలోనైనా అపరిమిత ఉపయోగం, పంపిణీ మరియు పునరుత్పత్తిని అనుమతిస్తుంది.
గమనిక: మీరు పేజీకి సిఫార్సు చేసిన వ్యక్తికి మీరు ఇమెయిల్ చూడాలనుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలుసుకోవడానికి మాత్రమే మేము మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను అందించమని అడుగుతాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సంగ్రహించము.
మీరు సందర్శకులో ఉన్నారో లేదో పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నిరోధించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
డేవిడ్ జెకె స్వైన్స్‌బరీ, పార్క్ క్వియాన్, ఫిలిప్ జె. జాక్సన్, కైట్లిన్ ఎం. ఫారీస్, డారియస్జ్ ఎం. నీడ్జ్‌వీడ్జ్‌కి, ఎలిజబెత్ సి. మార్టిన్, డేవిడ్ ఎ. ఫార్మర్, లోర్నా ఎ. మలోన్, రెబెక్కా ఎఫ్. థాంప్సన్, నీల్ ఎ. రాన్సన్, డేనియల్ పి. కన్నిఫ్, మార్క్ జె. డిక్‌మన్, డ్యూయీ హోల్టెన్, క్రిస్టీన్ కిర్మైయర్, ఆండ్రూ హిచ్‌కాక్, సి. నీల్ హంటర్
ప్రతిచర్య కేంద్రంలోని లైట్ ట్రాప్ 1 కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణం క్వినోన్ డైనమిక్స్‌లో కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది.
డేవిడ్ జెకె స్వైన్స్‌బరీ, పార్క్ క్వియాన్, ఫిలిప్ జె. జాక్సన్, కైట్లిన్ ఎం. ఫారీస్, డారియస్జ్ ఎం. నీడ్జ్‌వీడ్జ్‌కి, ఎలిజబెత్ సి. మార్టిన్, డేవిడ్ ఎ. ఫార్మర్, లోర్నా ఎ. మలోన్, రెబెక్కా ఎఫ్. థాంప్సన్, నీల్ ఎ. రాన్సన్, డేనియల్ పి. కన్నిఫ్, మార్క్ జె. డిక్‌మన్, డ్యూయీ హోల్టెన్, క్రిస్టీన్ కిర్మైయర్, ఆండ్రూ హిచ్‌కాక్, సి. నీల్ హంటర్
ప్రతిచర్య కేంద్రంలోని లైట్ ట్రాప్ 1 కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణం క్వినోన్ డైనమిక్స్‌లో కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది.
©2021 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.