ప్రస్తుతం†ప్రస్తుత చిరునామా: OX11 0DE, UK, డైమండ్ బిల్డింగ్, హార్వెల్ సైన్స్ అండ్ ఇన్నోవేషన్ పార్క్, డైట్‌కోట్, ఆక్స్‌ఫర్డ్‌షైర్, UK, డైమండ్ లైట్ సోర్స్ కో., లిమిటెడ్., ఎలక్ట్రానిక్ బయోలాజికల్ ఇమేజింగ్ సెంటర్.
రియాక్షన్ సెంటర్ లైట్-హార్వెస్టింగ్ కాంప్లెక్స్ 1 (RC-LH1) అనేది పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బాక్టీరియా యొక్క ప్రధాన కిరణజన్య సంయోగక్రియ భాగం. మేము రోడోప్స్యూడోమోనాస్ పాలుస్ట్రిస్ నుండి RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క రెండు క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ నిర్మాణాలను పరిచయం చేసాము. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.65-Å రిజల్యూషన్ నిర్మాణంలో, RC చుట్టూ 14 సబ్‌యూనిట్ LH1 లూప్‌లు ఉంటాయి, దీనికి ప్రోటీన్ W అడ్డుగా ఉంటుంది. అయితే, ప్రోటీన్-W లేని కాంప్లెక్స్ పూర్తిగా RC కూర్పుతో ఉండి, దాని చుట్టూ RC మూసివేయబడిన 16 సబ్‌యూనిట్ LH1 లూప్‌ను కలిగి ఉంటుంది. ఈ నిర్మాణాల పోలిక, RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో క్వినోన్ యొక్క గతిశీలతపై అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది. ఇందులో RC QB సైట్‌లో క్వినోన్‌ను బంధించేటప్పుడు ఇంతకుముందు నిర్ధారించబడని ఆకృతి మార్పులు, అలాగే క్వినోన్‌ను RCకి పంపడంలో సహాయపడే సహాయక క్వినోన్ బంధన ప్రదేశాల స్థానం కూడా ఉన్నాయి. W ప్రోటీన్ యొక్క విశిష్ట నిర్మాణం LH1 లూప్ మూసివేయబడకుండా నిరోధిస్తుంది, తద్వారా క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని వేగవంతం చేయడానికి ఒక మార్గాన్ని సృష్టిస్తుంది.
కిరణజన్య సంయోగక్రియ ద్వారా లభించే శక్తి భూమిపై ఉన్న దాదాపు అన్ని జీవులను నిలబెట్టగలదు మరియు సౌర జీవసాంకేతికతకు ఇది గొప్ప సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంది. ప్రపంచవ్యాప్త కిరణజన్య సంయోగక్రియను ప్రోత్సహిస్తూ, పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బాక్టీరియా కూడా వివిధ శక్తి రీతులను మరియు జీవక్రియ సామర్థ్యాలను ప్రదర్శిస్తాయి. అవి కిరణజన్య సంయోగక్రియను నివారించి, చీకటిలో హెటెరోట్రోఫిక్ బాక్టీరియాగా పెరగగలవు, నత్రజని మరియు కార్బన్ డయాక్సైడ్‌ను స్థిరీకరించగలవు, హైడ్రోజన్‌ను ఉత్పత్తి చేయగలవు మరియు సుగంధ సమ్మేళనాలను విచ్ఛిన్నం చేయగలవు (1-3). ఈ ప్రక్రియలకు శక్తిని అందించడానికి, కాంతిని త్వరగా మరియు సమర్థవంతంగా రసాయన శక్తిగా మార్చాలి. కాంతి-పట్టుకునే యాంటెన్నా కాంప్లెక్స్ కాంతిని గ్రహించి, బంధించబడిన శక్తిని రియాక్షన్ సెంటర్ (RC)కి బదిలీ చేసినప్పుడు ఈ ప్రక్రియ ప్రారంభమవుతుంది, తద్వారా ఛార్జ్ విభజన మొదలవుతుంది (4 – 7). పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బాక్టీరియాలో కిరణజన్య సంయోగక్రియ యొక్క ప్రాథమిక యూనిట్, టైప్ 2 RCతో కూడి ఉంటుంది, దీని చుట్టూ లైట్-హార్వెస్టింగ్ కాంప్లెక్స్ 1 (LH1) ఉండి, RC-LH1 కోర్ కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరుస్తుంది. LH1 వక్ర αβ హెటెరోడైమర్‌ల శ్రేణి ద్వారా ఏర్పడుతుంది, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి రెండు బాక్టీరియల్ క్లోరోఫిల్ (BChl) a అణువులను మరియు ఒకటి లేదా రెండు కెరోటినాయిడ్‌లను బంధిస్తుంది (8-12). అత్యంత సరళమైన LH1 యాంటెన్నా, RC (9-13) ను ఒక మూసివున్న లూప్‌లో చుట్టుముట్టిన 16 లేదా 17 αβ హెటెరోడైమర్‌లను కలిగి ఉంటుంది, కానీ ఇతర కోర్ కాంప్లెక్స్‌లలో, ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ పెప్టైడ్‌లు చుట్టుపక్కల ఉన్న LH1 యొక్క కొనసాగింపుకు అంతరాయం కలిగిస్తాయి, తద్వారా RC మరియు సైటోక్రోమ్ bc1 కాంప్లెక్స్ (11, 13-15) మధ్య క్వినోల్/క్వినోన్ వ్యాప్తిని ప్రోత్సహిస్తాయి. ఊదా రంగు కాంతిపోషక మొక్క రోడోప్స్యూడోమోనాస్ (Rps.) కిరణజన్య సంయోగక్రియకు మద్దతు ఇచ్చే శక్తి మరియు ఎలక్ట్రాన్ బదిలీని అర్థం చేసుకోగల ఒక నమూనా జీవి. Rps. యొక్క మొదటి క్రిస్టల్ నిర్మాణం. పాలుస్ట్రిస్ RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క నమూనా RC, ఇది 15 హెటెరోడైమెరిక్ LH1 లూప్‌లచే చుట్టుముట్టబడి ఉంటుంది, వీటికి "ప్రోటీన్ W" (14) అనే తెలియని ప్రోటీన్ ద్వారా అంతరాయం కలుగుతుంది. ప్రోటీన్-W తరువాత RPA4402 గా గుర్తించబడింది, ఇది మూడు ఊహించిన ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్‌లను (TMH) కలిగి ఉన్న, లక్షణాలు నిర్ధారించబడని 10.5kDa ప్రోటీన్ (16). RC-L, M (pufL, pufM) మరియు LH1α, β (pufA, pufB) సబ్‌యూనిట్‌లను ఎన్‌కోడ్ చేసే జన్యువుల నామకరణానికి అనుగుణంగా, ప్రోటీన్ Wను ఎన్‌కోడ్ చేసే rpa4402 జన్యువు పేరును pufWగా మార్చాలని మేము ప్రతిపాదిస్తున్నాము. ఆసక్తికరంగా, ప్రోటీన్-W కేవలం 10% RC-LH1లో మాత్రమే ఉంటుంది, ఇది Rps. palustris రెండు విభిన్న RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుందని వెల్లడిస్తుంది. ఇక్కడ, మేము రెండు కోర్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క హై-రిజల్యూషన్ క్రయో-EM (క్రయో-EM) నిర్మాణాలను నివేదిస్తున్నాము; వాటిలో ఒకటి ప్రోటీన్ W మరియు 14 αβ హెటెరోడైమర్‌లతో ఉండగా, మరొకటి ప్రోటీన్ W లేకుండా మరియు మూసి ఉన్న 16 హెటెరోడైమర్ LH1 లూప్‌తో ఉంది. మా నిర్మాణం Rps. palustris యొక్క RC-LH1 కాంప్లెక్స్ గురించిన అవగాహనలో ఒక పెద్ద మార్పును సూచిస్తుంది, ఎందుకంటే మేము ప్రతి వేరియంట్ యొక్క సజాతీయ జనాభాను విశ్లేషించాము మరియు ప్రతి పెప్టైడ్, బంధిత వర్ణకాలు, సంబంధిత లిపిడ్‌లు మరియు క్వినోన్‌లను స్పష్టంగా కేటాయించడానికి తగినంత రిజల్యూషన్‌ను కలిగి ఉన్నాము. ఈ నిర్మాణాల పోలిక, ఇప్పటివరకు ఏ ఇతర RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లోనూ కనుగొనబడని మూడు TMH ప్రోటీన్లు-W, క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని వేగవంతం చేయడానికి ఒక క్వినోన్ ఛానెల్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తాయని చూపిస్తుంది. అనేక సంరక్షించబడిన లిపిడ్ మరియు క్వినోన్ బంధన స్థానాలు గుర్తించబడ్డాయి, మరియు క్వినోన్ మరియు RC కలయిక తర్వాత ఒక కొత్త ఆకృతి మార్పును మేము వెల్లడించాము, ఇది ఆక్సిజనేటెడ్ ఫోటోట్రోఫిక్ జీవుల యొక్క ఫోటోసిస్టమ్ II (PSII) RC కి అనుకూలంగా ఉండవచ్చు. మా పరిశోధనలు పర్పుల్ ఫోటోట్రోఫిక్ బ్యాక్టీరియా యొక్క RC-LH1 కోర్ కాంప్లెక్స్‌లో క్వినోన్/క్వినోలోన్ బంధన మరియు మార్పిడి యొక్క గతిశాస్త్రంపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి.
Rps. palustris లో కనిపించే రెండు కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క వివరణాత్మక అధ్యయనాన్ని సులభతరం చేయడానికి, మేము ప్రతి RC-LH1 ను జీవరసాయన పద్ధతుల ద్వారా వేరు చేస్తాము. ప్రోటీన్ W-లోపం ఉన్న కాంప్లెక్స్ (ఇకపై ΔpufW అని పిలుస్తారు) pufW జన్యువు లేని స్ట్రెయిన్ నుండి శుద్ధి చేయబడింది (16), మరియు ఒకే ఒక RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయవచ్చు. ప్రోటీన్ W-కలిగిన కాంప్లెక్స్ ఒక స్ట్రెయిన్ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది. ఈ స్ట్రెయిన్ యొక్క ప్రోటీన్ W దాని C-టెర్మినస్ వద్ద 10x His ట్యాగ్‌తో సవరించబడింది, తద్వారా ప్రోటీన్ W-కలిగిన కాంప్లెక్స్‌ను లోహాన్ని స్థిరీకరించడం ద్వారా చాలా వరకు ప్రోటీన్ W లోపించిన వాటితో సమర్థవంతంగా కలపవచ్చు. ఈ కాంప్లెక్స్ అఫినిటీ క్రోమాటోగ్రఫీ (IMAC) ద్వారా సమర్థవంతంగా వేరు చేయబడుతుంది (16).
పటం 1లో చూపిన విధంగా, రెండు కాంప్లెక్స్‌లు LH1 యాంటెన్నాతో చుట్టుముట్టబడిన మూడు ఉప-యూనిట్ RC (RC-L, RC-M మరియు RC-H)ని కలిగి ఉంటాయి. ప్రోటీన్-W లేని కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.80-A నిర్మాణం, RCని పూర్తిగా చుట్టుముట్టి ఒక మూసి ఉన్న LH1 లూప్‌ను ఏర్పరిచే 16 αβ హెటెరోడైమర్‌లను చూపుతుంది, దీనిని ఇకపై RC-LH116 కాంప్లెక్స్ అని పిలుస్తారు. ప్రోటీన్-W-కలిగిన కాంప్లెక్స్ యొక్క 2.65Å నిర్మాణం, ప్రోటీన్-W ద్వారా అంతరాయం కలిగిన 14-హెటెరోడైమర్ LH1ని కలిగి ఉంటుంది, దీనిని ఇకపై RC-LH114-W అని పిలుస్తారు.
(A మరియు B) సమ్మేళనం యొక్క ఉపరితల ప్రాతినిధ్యం. (C మరియు D) కడ్డీలలో వ్యక్తపరిచిన బంధిత వర్ణకాలు. (E మరియు F) సైటోప్లాస్మిక్ ఉపరితలం నుండి గమనించిన సంక్లిష్టాలలో పెప్టైడ్‌లు మరియు LH1 ఉపయూనిట్‌లు కార్టూన్‌లలో సూచించబడ్డాయి మరియు ప్రోటీన్-W అంతరం నుండి సవ్యదిశలో సంఖ్యలు ఇవ్వబడ్డాయి [Rba సంఖ్యాక్రమానికి అనుగుణంగా. స్ఫెరోయిడ్స్ సంక్లిష్టం (13)]. LH1-α కొరకు, ప్రోటీన్ ఉపయూనిట్ యొక్క రంగు పసుపు; LH1-β కొరకు, ప్రోటీన్ ఉపయూనిట్ యొక్క రంగు నీలం; ప్రోటీన్-W కొరకు, ప్రోటీన్ ఎరుపు; RC-H కొరకు, అది సియాన్; RC-L కొరకు, అది నారింజ; RC-M కొరకు, మెజెంటా. సహకారకాలు కడ్డీల ద్వారా సూచించబడ్డాయి, ఆకుపచ్చ రంగు BChl మరియు BPh a అణువులను, ఊదా రంగు కెరోటినాయిడ్లను, మరియు పసుపు రంగు UQ10 అణువులను సూచిస్తాయి. (G మరియు H) RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ (G) మరియు RC-LH116 కాంప్లెక్స్ (H) యొక్క సమానమైన ప్రాంతంలోని ప్రోటీన్-W గ్యాప్ యొక్క విస్తరించిన దృశ్యం. కోఫ్యాక్టర్లు స్పేస్ ఫిల్లింగ్ రూపంలో ప్రదర్శించబడ్డాయి, కీలేటెడ్ క్వినోన్ నీలం రంగులో ప్రదర్శించబడింది. (G)లో ప్రోటీన్-W గ్యాప్ నీలం రంగు చుక్కల గీతతో హైలైట్ చేయబడింది, మరియు (H)లో LH116 రింగ్‌పై క్వినోన్/క్వినోలోల్ వ్యాపించే చిన్న రంధ్రాలు నలుపు రంగు చుక్కల గీతతో హైలైట్ చేయబడ్డాయి.
పటం 1 (A మరియు B) లో, RC చుట్టూ LH1αβ హెటెరోడైమర్‌ల యొక్క ఓపెన్ లేదా క్లోజ్డ్ శ్రేణులు ఉన్నాయి, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి రెండు BChl మరియు ఒక కెరోటినాయిడ్‌ను బంధిస్తుంది (పటం 1, C మరియు D). మునుపటి అధ్యయనాలు Rps అనేది LH1 కాంప్లెక్స్ అని చూపించాయి. స్పిరులినా క్సాంథిన్ యొక్క బయోసింథటిక్ మార్గంలో, ఈ జాతులు కెరోటినాయిడ్‌ల మిశ్రమ జనాభాను కలిగి ఉంటాయి (17). అయితే, స్పైరోపైరోక్సాంథిన్ అనేది ప్రధాన కెరోటినాయిడ్ మరియు దాని సాంద్రత సంతృప్తికరంగా ఉంది. అందువల్ల, మేము అన్ని LH1 బైండింగ్ సైట్‌లలో స్పైరోక్సాంథిన్‌ను మోడల్ చేయడానికి ఎంచుకున్నాము. ఆల్ఫా మరియు బీటా పాలిపెప్టైడ్‌లు చిన్న పొర బయటి ప్రాంతాలతో కూడిన సింగిల్ TMHలు (పటం 1, A, B, E, మరియు F). C-టెర్మినస్ వద్ద 17 అవశేషాల సాంద్రత గమనించబడనప్పటికీ, రెండు కాంప్లెక్స్‌లలోనూ ఆల్ఫా పాలిపెప్టైడ్ Met1 నుండి Ala46 వరకు విచ్ఛేదనం చేయబడింది. RC-LH116లో β పాలిపెప్టైడ్ Gly4 నుండి Tyr52 వరకు, మరియు RC-LH114-Wలో Ser5 నుండి Tyr52 వరకు క్షీణించింది. 3 లేదా 4 N-టెర్మినల్ లేదా 13 C-టెర్మినల్ అవశేషాల సాంద్రత గమనించబడలేదు (పటం S1). వైల్డ్-టైప్ స్ట్రెయిన్ నుండి తయారు చేయబడిన మిశ్రమ RC-LH1 కాంప్లెక్స్ యొక్క మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ విశ్లేషణలో, లోపించిన ప్రాంతం ఈ పెప్టైడ్‌ల యొక్క హెటెరోలాగస్ క్లీవేజ్ ఫలితంగా ఏర్పడిందని తేలింది (పటం S1 మరియు S2). α-Met1 యొక్క N-టెర్మినల్ ఫార్మైలేషన్ కూడా గమనించబడింది (f). ఈ విశ్లేషణలో α-పెప్టైడ్ fMet1 నుండి Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 అవశేషాలను కలిగి ఉందని, మరియు β-పెప్టైడ్ Ser2 నుండి Ala53 అవశేషాలను కలిగి ఉందని తేలింది, ఇది తక్కువ-ఉష్ణోగ్రత EM సాంద్రత మ్యాప్‌తో బాగా సరిపోలుతుంది.
α-His29 మరియు β-His36 ల సమన్వయం BChls ను ముఖాముఖిగా ఉండేలా చేస్తుంది; ప్రతి αβ హెటెరోడైమర్ దాని పొరుగువాటితో కలిసి RC ఎక్సైటాన్ కపుల్డ్ పిగ్మెంట్ శ్రేణి చుట్టూ ఒక ఓపెన్ లూప్ (RC-LH114-W) లేదా ఒక క్లోజ్డ్ లూప్ (RC-LH116) ను ఏర్పరుస్తుంది (పటం 1, C మరియు D). RC-LH114-W యొక్క 877 nm బ్యాండ్‌తో పోలిస్తే, RC-LH116 యొక్క 880 nm శోషణ రెడ్ షిఫ్ట్ 3 nm (పటం 2A). అయితే, సర్క్యులర్ డైక్రోయిజం స్పెక్ట్రం దాదాపు ఒకే విధంగా ఉంటుంది (పటం 2B), ఇది ఓపెన్ మరియు క్లోజ్డ్ లూప్‌ల మధ్య స్పష్టమైన వ్యత్యాసం ఉన్నప్పటికీ, BChls యొక్క స్థానిక వాతావరణం చాలా సారూప్యంగా ఉందని సూచిస్తుంది. శోషణ రెడ్‌షిఫ్ట్ అనేది తగ్గిన ఉష్ణ చలనం మరియు క్లోజ్డ్ లూప్‌పై పెరిగిన స్థిరత్వం (18, 19), క్లోజ్డ్ లూప్ వల్ల కలిగే పిగ్మెంట్ కప్లింగ్‌లో మార్పు (20, 21), లేదా ఈ రెండు ప్రభావాల కలయిక (11) ఫలితంగా ఉండవచ్చు.
(A) అతినీలలోహిత/దృశ్య/సమీప-పరారుణ శోషణ వర్ణపటం, దీని శిఖరాలు వాటి సంబంధిత వర్ణకాలతో గుర్తించబడ్డాయి మరియు 775 nm వద్ద BPh శిఖరానికి సాధారణీకరించబడ్డాయి. (B) 805 nm వద్ద BChl శోషణకు సాధారణీకరించబడిన వృత్తాకార డైక్రోయిజం వర్ణపటం. (C మరియు D) RC-LH114-W సంక్లిష్టం (C) మరియు RC-LH116 సంక్లిష్టం (D) యొక్క కాల-విశ్లేషిత శోషణ వర్ణపటాల నుండి ఎంపిక చేయబడిన ΔA వర్ణపటాలు. మెరుగైన పోలిక కోసం, అన్ని వర్ణపటాలు 0.2 ps వద్ద −A యొక్క ∆A కు సాధారణీకరించబడ్డాయి. (E) వివిధ గాఢతలలో UQ2 సమక్షంలో వికిరణం తర్వాత సైటోక్రోమ్ c2 ఆక్సీకరణ రేటు (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S8 చూడండి). (F) తక్కువ, మధ్యస్థ లేదా అధిక తీవ్రత కాంతి (వరుసగా 10, 30 లేదా 300μMm-2 s-1) కింద పెరిగిన కణాలలో, శుద్ధి చేయబడిన సంక్లిష్టంలోని ప్రోటీన్ W మరియు RC-L ఉప-యూనిట్లు మరియు వేరు చేయబడిన పొర నిష్పత్తి. SDS-పాలియాక్రిలామైడ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ మరియు ఇమ్యునోఅస్సే ద్వారా ప్రోటీన్ స్థాయిని నిర్ధారించండి (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S9 చూడండి). శుద్ధి చేయబడిన RC-LH114-W కాంప్లెక్స్‌కు సంబంధించి నిష్పత్తిని నిర్ధారించండి. కాంప్లెక్స్‌లోని RC-L మరియు ప్రోటీన్-W ల స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తి 1:1.
RC-LH114-W యొక్క వికృత αβ14 లూప్‌లోని స్థానం 1 వద్ద ఉన్న BChls (పటం 1, A, C, మరియు E), RC-LH116లోని సమానమైన BChls (పటం 1, B, D, మరియు F, మరియు పటం S3) కంటే RC ప్రాథమిక దాత (P)కి 6.8Å దగ్గరగా ఉన్నాయి; అయినప్పటికీ, ఈ రెండు కాంప్లెక్స్‌ల తాత్కాలిక శోషణ గతిశాస్త్రం ప్రకారం, RC-LH114-W మరియు RC-LH116లకు, LH1 నుండి RCకి ఉత్తేజ శక్తి బదిలీ సమయ స్థిరాంకాలు 40 ±4 మరియు 44±3 ps (పటం 2, C మరియు D, పటం S4 మరియు పట్టిక S2) అని తెలుస్తుంది. RC లోపల ఎలక్ట్రానిక్ బదిలీలో కూడా గణనీయమైన తేడా లేదు (పటం S5 మరియు సంబంధిత అనుబంధ పాఠం). LH1 మరియు RC-P మధ్య శక్తి బదిలీ సమయం యొక్క దగ్గరి అనురూపతకు కారణం, రెండు LH1 లూప్‌లలోని చాలా BChl ల మధ్య దూరం, కోణం మరియు పొటెన్షియల్ ఎనర్జీ ఒకేలా ఉండటమేనని మేము అనుమానిస్తున్నాము. కనిష్ట దూరాన్ని చేరుకోవడానికి LH1 శక్తి నమూనాను అన్వేషించడం అనేది, అనుకూలత లేని ప్రదేశాల నుండి RC కి జరిగే ప్రత్యక్ష శక్తి బదిలీ కంటే వేగవంతమైనది కాదని తెలుస్తోంది. నిర్మాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం, RC-LH114-W లోని ఓపెన్-లూప్ LH1 లూప్ కూడా తక్కువ ఉష్ణోగ్రత పరిస్థితులలో అల్పమైన ఉష్ణ చలనానికి లోనవవచ్చు, మరియు RC 1 స్థానంలో ఉన్న βBChl ల పిగ్మెంటేషన్ దూరం నుండి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పొడవైన αβ14 రింగ్ నిర్మాణం ఉంటుంది.
RC-LH116 సంక్లిష్టంలో 32 BChls మరియు 16 కెరోటినాయిడ్లు ఉన్నాయి, మరియు దాని మొత్తం అమరిక థర్మోక్రోమాటియం (Tch.) పిడ్పిడమ్ [ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్ (PDB) ID 5Y5S] (9), థియోరోడోవిబ్రియో (Trv.) 970 స్ట్రెయిన్ (PDB ID 7C9R) (12) మరియు ఆకుపచ్చ శైవలాలు (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) నుండి పొందిన దానితో సమానంగా ఉంటుంది. అలైన్‌మెంట్ తర్వాత, αβ హెటెరోడైమర్‌ల స్థానాలలో, ముఖ్యంగా 1-5, 15, మరియు 16 లలో చిన్న విచలనాలు మాత్రమే గమనించబడ్డాయి (మూర్తి S6). ప్రోటీన్-W ఉనికి LH1 నిర్మాణంపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. దీని మూడు TMHలు చిన్న లూప్‌ల ద్వారా అనుసంధానించబడి ఉంటాయి, N-టెర్మినల్ సంక్లిష్టం యొక్క ల్యూమెన్ వైపు మరియు C-టెర్మినల్ సైటోప్లాస్మిక్ వైపు ఉంటాయి (మూర్తులు 1A మరియు 3, A నుండి D). ప్రోటీన్-W ప్రధానంగా హైడ్రోఫోబిక్ (జలవికర్షణ) లక్షణాన్ని కలిగి ఉంటుంది (పటం 3B), మరియు TMH2, TMH3 లు LH1αβ-14 తో సంకర్షణ చెంది ఒక ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ఉపరితలాన్ని ఏర్పరుస్తాయి (పటం 3, B మరియు E నుండి G). ఈ ఇంటర్‌ఫేస్ ప్రధానంగా ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రాంతంలోని Phe, Leu మరియు Val అవశేషాలతో కూడి ఉంటుంది. ఈ అవశేషాలు హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు మరియు αβ-14 వర్ణద్రవ్యాలతో పేర్చబడి ఉంటాయి. కొన్ని పోలార్ అవశేషాలు కూడా ఈ సంకర్షణకు దోహదం చేస్తాయి, వీటిలో కాంప్లెక్స్ కుహరం యొక్క ఉపరితలంపై W-Thr68 మరియు β-Trp42 మధ్య ఉన్న హైడ్రోజన్ బంధం కూడా ఒకటి (పటం 3, F మరియు G). సైటోప్లాజం ఉపరితలంపై, Gln34 అనేది αβ-14 కెరోటినాయిడ్ల యొక్క కీటో సమూహానికి ఆనుకొని ఉంటుంది. అదనంగా, n-డోడెసిల్ β-d-మాల్టోసైడ్ (β-DDM) అణువును గుర్తించడం జరిగింది, మరియు దాని హైడ్రోఫోబిక్ తోక ప్రోటీన్-W మరియు αβ-14 మధ్య ఉన్న ఇంటర్‌ఫేస్ వరకు విస్తరించి ఉంది, మరియు లిపిడ్ తోక దాని శరీరంలో ఉండవచ్చు. ప్రోటీన్ W మరియు RCH యొక్క C-టెర్మినల్ రిజల్యూషన్ ప్రాంతాలు చాలా దగ్గరగా ఉన్నాయని, కానీ నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యలను ఏర్పరచుకునే పరిధిలో లేవని కూడా మేము గమనించాము (మూర్తి 1, A మరియు E). అయినప్పటికీ, ఈ రెండు ప్రోటీన్ల యొక్క పరిష్కరించబడని C-టెర్మినల్ అమైనో ఆమ్లాలలో పరస్పర చర్యలు ఉండవచ్చు, ఇవి RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క అసెంబ్లీ సమయంలో ప్రోటీన్-W యొక్క నియామకానికి ఒక యంత్రాంగాన్ని అందించవచ్చు.
(A) కార్టూన్ రూపంలో LH1αβ14 తో ఇంటర్‌ఫేస్‌ను ఎదుర్కొనే ప్రోటీన్-W, ఒక కడ్డీ ఆకారపు సైడ్ చైన్ (ఎరుపు) కలిగి ఉంటుంది, ఇది ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ పొటెన్షియల్ రేఖాచిత్రంలోని ఒక భాగంలో (0.13 కాంటూర్ స్థాయి కలిగిన పారదర్శక బూడిద రంగు ఉపరితలం) ప్రదర్శించబడింది. (B) ప్రోటీన్-W ఒక హైడ్రోఫోబిక్ రంగు ఉపరితలం ద్వారా సూచించబడింది. ధ్రువ మరియు ఆవేశిత ప్రాంతాలు సియాన్ రంగులో, హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతాలు తెలుపు రంగులో, మరియు అత్యంత హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతాలు నారింజ రంగులో ప్రదర్శించబడ్డాయి. (C మరియు D) కార్టూన్‌లో సూచించబడిన ప్రోటీన్-W, దాని దిశ (A) (C) లో ఉన్నట్లే ఉంటుంది, మరియు 180° తిప్పబడింది (D). సీక్వెన్స్‌లోని స్థానాన్ని బట్టి, గుర్తించదగిన అవశేషాలు ఇంద్రధనుస్సు రంగుల పథకాన్ని అనుసరిస్తాయి, ఇక్కడ N-టెర్మినల్ నీలం రంగులో మరియు C-టెర్మినల్ ఎరుపు రంగులో ఉంటాయి. (E) (A) లో ఉన్న అదే వీక్షణలో ప్రోటీన్-W, మరియు ప్రోటీన్-W:LH1 ఇంటర్‌ఫేస్ వద్ద ఉన్న అవశేషాలు గుర్తులు జతచేయబడిన కడ్డీల ద్వారా సూచించబడ్డాయి. (F) కార్టూన్ ప్రాతినిధ్యంలో (E) మరియు LH1αβ14 లకు సాపేక్షంగా, మరియు బార్ ప్రాతినిధ్యంలో ఇంటర్‌ఫేస్ అవశేషాలకు సాపేక్షంగా ప్రోటీన్-W 90° తిప్పబడింది. బీటా పాలిపెప్టైడ్ నుండి వేలాడుతున్న అవశేషాలు లేబుల్ చేయబడ్డాయి. సహకారకం (కోఫ్యాక్టర్) చిత్రం 1 యొక్క రంగుకు సరిపోయే బార్‌గా చూపబడింది, విడగొట్టబడిన β-DDM బూడిద రంగులో చూపబడింది, మరియు ఆక్సిజన్ ఎరుపు రంగులో చూపబడింది. (G) (F) లోని దృశ్యం 180° తిప్పబడింది, లేబుల్ చేయబడిన ఆల్ఫా పాలిపెప్టైడ్ యొక్క ప్రముఖ అవశేషాలతో.
ప్రోటీన్-W ఒక αβ హెటెరోడైమర్‌ను (పటం 1Fలోని 15వది) భర్తీ చేస్తుంది, తద్వారా లూప్ మూసివేతను నివారించి, మొదటి మూడు αβ హెటెరోడైమర్‌లను వంచుతుంది. ఫిల్మ్ నార్మల్‌కు సంబంధించి మొదటి αβ-1 హెటెరోడైమర్ యొక్క గరిష్ట వంపు కోణం 25° నుండి 29° వరకు ఉన్నట్లు గమనించబడింది (పటం 1, A మరియు E), ఇది RC A షార్ప్ కాంట్రాస్ట్-LH116లోని αβ-1 యొక్క 2° నుండి 8° వంపు ద్వారా ఏర్పడింది (పటం 1, B మరియు F). రెండవ మరియు మూడవ హెటెరోడైమర్‌లు వరుసగా 12° నుండి 22° మరియు 5° నుండి 10° కోణాలలో వంగి ఉన్నాయి. RC యొక్క స్టెరిక్ అవరోధం కారణంగా, αβ-1 యొక్క వంపు రెండవ జత αβ ను (ఇది పటం 1F లోని 16వ αβ కు అనుగుణంగా ఉంటుంది) చేర్చదు, తద్వారా LH1 వలయంలో ఒక స్పష్టమైన ఖాళీ ఏర్పడుతుంది (పటం 1, A మరియు E). రెండు αβ హెటెరోడైమర్‌లు లేకపోవడం, నాలుగు BChl మరియు రెండు కెరోటినాయిడ్‌ల నష్టంతో పాటుగా, ఏ కెరోటినాయిడ్‌లు కూడా మెలితిరిగిన αβ-1 సబ్‌యూనిట్‌కు బంధించబడవు, ఫలితంగా 13 కెరోటినాయిడ్‌లు మరియు 28 BChl లను కలిగి ఉన్న LH114-W వలయం ఏర్పడుతుంది. αβ1 నుండి 7 ప్రాంతాలలో రెండు కాంప్లెక్స్‌ల స్థానిక రిజల్యూషన్ అంచనాలు మిగిలిన LH1 లూప్ కంటే తక్కువగా ఉన్నాయి, ఇది RC QB సైట్‌కు ఆనుకొని ఉన్న LH1 సబ్‌యూనిట్ యొక్క సహజమైన ప్లాస్టిసిటీని ప్రతిబింబిస్తుంది (పటం 4).
RC-LH114-W (A మరియు B) మరియు RC-LH116 (C మరియు D) యొక్క చిత్రాలు, పటం 1లోని అదే పై నుండి/పక్క నుండి చూసే (A మరియు B) (A మరియు C) మరియు కుహరం ఉపరితలం నుండి (B మరియు D) చూపబడ్డాయి. రంగు కీలు కుడి వైపున చూపబడ్డాయి.
1:14 స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తితో ఉన్న ఏకైక ఇతర లక్షణ కోర్ కాంప్లెక్స్ రోడోకోకస్ స్ఫెరోయిడ్స్ (Rba.) RC-LH1-PufX డైమర్ (13). అయితే, ప్రోటీన్ W మరియు PufX లకు స్పష్టమైన హోమోలజీ లేదు, మరియు వాటి సంబంధిత LH1 నిర్మాణాలపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతాయి. PufX అనేది ఒకే TMH, దీనికి N-టెర్మినల్ సైటోప్లాస్మిక్ డొమైన్ ఉంటుంది, ఇది Rps. palustris LH116αβ-16 కు అనుగుణమైన స్థానంలో RC-H సబ్‌యూనిట్ (13) యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపుతో సంకర్షణ చెందుతుంది. PufX, RC-LH1 మరియు సైటోక్రోమ్ bcl కాంప్లెక్స్ మధ్య క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడికి ఒక మార్గాన్ని సృష్టిస్తుంది మరియు ఇది అన్ని Rba. స్ఫెరోయిడ్స్ కోర్ కాంప్లెక్స్‌లలో (13) ఉంటుంది. మోనోమర్-మోనోమర్ ఇంటర్‌ఫేస్ Rba.లో ఉన్నప్పటికీ స్ఫెరోయిడ్స్ RC-LH1-PufX డైమర్, RC-LH114-W లోని ప్రోటీన్ W యొక్క బంధన స్థానంలో ఉంది, మరియు PufX మరియు ప్రోటీన్-W ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ఖాళీ సమానమైన స్థానంలో ఉంది (పటం S7A). RC-LH114-W లోని ఖాళీ, ప్రోటీన్ W లేదా PufX కు సంబంధం లేని పెప్టైడ్‌ల ద్వారా ఏర్పడిన సూడోమోనాస్ రోసియా LH1 యొక్క ఊహాత్మక క్వినోన్ ఛానెల్ (8) తో కూడా సమలేఖనం చేయబడింది (పటం S7B). అదనంగా, ఒక γ సబ్‌యూనిట్‌ను (7) మినహాయించడం ద్వారా ఏర్పడిన Blc. ఎమరాల్డ్ గ్రీన్ LH1 లోని క్వినోన్ ఛానెల్ కూడా ఇలాంటి స్థానంలోనే ఉంది (పటం S7C). వేర్వేరు ప్రోటీన్‌ల ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించినప్పటికీ, RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో ఈ క్వినోన్/క్వినోలోల్ ఛానెల్‌లు ఒకే స్థానంలో కనిపించడం అనేది కన్వర్జెంట్ ఎవల్యూషన్‌కు ఒక ఉదాహరణగా కనిపిస్తుంది, ఇది ప్రోటీన్ W ద్వారా సృష్టించబడిన ఖాళీ క్వినోన్ ఛానెల్‌గా పనిచేయవచ్చని సూచిస్తుంది.
LH114-W లూప్‌లోని అంతరం, ప్రోటీన్‌లలో వలె రెండు డొమైన్‌లను ప్రోటీన్ రంధ్రం ద్వారా కనెక్ట్ చేయడానికి బదులుగా, RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క అంతర్గత ప్రదేశానికి మరియు బల్క్ మెంబ్రేన్‌కు మధ్య నిరంతర పొర ప్రాంతం ఏర్పడటానికి అనుమతిస్తుంది (మూర్తి 1G). RC-LH116 కాంప్లెక్స్ మూసి ఉన్న Tch. సూది లాంటి కాంప్లెక్స్ (22) (మూర్తి 1H) ను పోలి ఉంటుంది. ఇరుకైన ప్రోటీన్ ఛానల్ ద్వారా వ్యాపించడం కంటే పొర ద్వారా క్వినోన్ యొక్క వ్యాపనం వేగంగా ఉంటుంది కాబట్టి, తెరిచి ఉన్న LH114-W లూప్, మూసి ఉన్న LH116 లూప్ కంటే వేగవంతమైన RC టర్నోవర్‌ను అనుమతించగలదు మరియు RC లోకి క్వినోన్ యొక్క వ్యాపనం మరింత పరిమితం కావచ్చు. RC ద్వారా క్వినోన్‌ల మార్పిడిని ప్రోటీన్ W ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము యుబిక్వినోన్ 2 (UQ2) (పొట్టి ఐసోప్రీన్ తోకతో సహజ UQ10 యొక్క అనలాగ్) యొక్క నిర్దిష్ట గాఢతపై సైటోక్రోమ్ ఆక్సీకరణ అస్సేను నిర్వహించాము (మూర్తి 2E). కీలేటెడ్ క్వినోన్ ఉండటం వలన స్పష్టమైన మైఖేలిస్ స్థిరాంకం యొక్క ఖచ్చితమైన నిర్ధారణకు ఆటంకం కలిగినప్పటికీ (RC-LH114-W మరియు RC-LH116 వరుసగా 0.2 ± 0.1 μM మరియు 0.5 ± 0.2 μM లకు అనుకూలంగా ఉంటాయి), RC-LH114-W యొక్క గరిష్ట రేటు (4.6 ± 0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1) కంటే 28 ± 5% ఎక్కువగా ఉంది.
మేము ప్రారంభంలో ప్రోటీన్-W కోర్ కాంప్లెక్స్‌లో సుమారు 10% ఉంటుందని అంచనా వేశాము (16); ఇక్కడ, తక్కువ-కాంతి, మధ్యస్థ-కాంతి మరియు అధిక-కాంతి పెరుగుదల కణాల ఆక్యుపెన్సీ రేట్లు వరుసగా 15±0.6%, 11±1% మరియు 0.9±0.5% (చిత్రం 2F). మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ యొక్క పరిమాణాత్మక పోలికలో, వైల్డ్-టైప్ స్ట్రెయిన్‌లతో పోలిస్తే హిస్టిడిన్ ట్యాగ్‌ను జోడించడం ప్రోటీన్-W యొక్క సాపేక్ష సమృద్ధిని తగ్గించలేదని తేలింది (P = 0.59), కాబట్టి ఈ స్థాయిలు సవరించిన ప్రోటీన్-W యొక్క కృత్రిమ ప్రభావం కాదు (చిత్రం S10). అయితే, RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో ప్రోటీన్-W యొక్క ఈ తక్కువ ఆక్యుపెన్సీ కొన్ని RCలు వేగవంతమైన రేటుతో ఫ్లిప్ అవ్వడానికి అనుమతించవచ్చు, తద్వారా RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌లో నెమ్మదిగా జరిగే క్వినోన్/క్వినోలోన్ మార్పిడిని తగ్గిస్తుంది. అధిక కాంతి ఆక్యుపెన్సీ రేటు ఇటీవలి ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ డేటాతో పొంతన లేదని మేము గమనించాము, ఇది బలమైన కాంతిలో pufW జన్యు వ్యక్తీకరణ పెరుగుతుందని సూచిస్తుంది (మూర్తి S11) (23). pufW ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లోకి ప్రోటీన్-W చేరడం మధ్య వ్యత్యాసం గందరగోళంగా ఉంది మరియు ప్రోటీన్ యొక్క సంక్లిష్ట నియంత్రణను ప్రతిబింబిస్తుంది.
RC-LH114-Wలో, 6 కార్డియోలిపిన్ (CDL), 7 ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్ (POPC), 1 ఫాస్ఫాటిడైల్గ్లిసరాల్ (POPG) మరియు 29 β-DDM అణువులు కేటాయించబడ్డాయి మరియు దానిలో 6 CDLలు, 24 POPCలు, 2 POPGలు మరియు 12 βDDMలు నమూనా చేయబడ్డాయి. RC-LH116 (పటం 5, A మరియు B). ఈ రెండు నిర్మాణాలలో, CDL దాదాపుగా కాంప్లెక్స్ యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపున ఉంది, అయితే POPC, POPG మరియు β-DDM ఎక్కువగా లూమినల్ వైపున ఉన్నాయి. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క αβ-1 నుండి αβ-6 ప్రాంతంలో రెండు లిపిడ్ మరియు డిటర్జెంట్ అణువులు వేరుచేయబడ్డాయి (పటం 5A), మరియు RC-LH116 యొక్క సమానమైన ప్రాంతంలో ఐదు వేరుచేయబడ్డాయి (పటం 5B). కాంప్లెక్స్ యొక్క మరొక వైపున మరిన్ని లిపిడ్లు కనుగొనబడ్డాయి, ప్రధానంగా CDL, RC మరియు αβ-7 నుండి αβ-13 మధ్య పేరుకుపోయింది (పటం 5, A మరియు B). నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడిన ఇతర లిపిడ్లు మరియు డిటర్జెంట్లు LH1 రింగ్ వెలుపల ఉన్నాయి, మరియు చక్కగా పరిష్కరించబడిన ఎసిల్ గొలుసులు LH1 సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య విస్తరించి ఉన్నాయి, RC-LH114-Wలో తాత్కాలికంగా β-DDMగా మరియు RC A mixture of β-DDM and POPC-LH116లో β-DDMగా నిర్వచించబడ్డాయి. మన నిర్మాణంలో కీలేటింగ్ లిపిడ్లు మరియు డిటర్జెంట్ల యొక్క సారూప్య స్థానాలు అవి శారీరకంగా సంబంధిత బంధన ప్రదేశాలు అని సూచిస్తున్నాయి (పటం S12A). Tchలోని సమానమైన అణువుల స్థానాలు కూడా మంచి స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉన్నాయి. జెంటిల్ మరియు Trv. స్ట్రెయిన్ 970 RC-LH1s (మూర్తి S12, B నుండి E) (9, 12) మరియు లిపిడ్ హెడ్ గ్రూప్ యొక్క హైడ్రోజన్-బంధన అవశేషాలు సీక్వెన్స్ అలైన్‌మెంట్‌లో (మూర్తి S13) చాలా మంచి సంరక్షణను చూపించాయి, ఇది RC (24) కు బంధించే సంరక్షించబడిన CDL, ఈ సైట్‌లు RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో సంరక్షించబడవచ్చని సూచిస్తుంది.
(A మరియు B) RC-LH114-W (A) మరియు RC-LH116 (B) పెప్టైడ్‌లను కార్టూన్‌ల ద్వారా, మరియు పిగ్మెంట్‌లను రాడ్‌ల ద్వారా, చిత్రం 1లోని రంగుల పథకాన్ని ఉపయోగించి సూచించడం జరిగింది. లిపిడ్‌లను ఎరుపు రంగులో, మరియు డిటర్జెంట్‌లను బూడిద రంగులో చూపించారు. RC QA మరియు QB సైట్‌లకు బంధించబడిన UQ పసుపు రంగులో ఉండగా, విడిగా ఉన్న UQ నీలం రంగులో ఉంది. (C మరియు D) (A) మరియు (B) లలో ఉన్నటువంటి అవే దృశ్యాలు, లిపిడ్‌లను మినహాయించి. (E నుండి G వరకు) RC-LH116 నుండి Q1(E), Q2(F) మరియు Q3(G) ల యొక్క విస్తరించిన దృశ్యం, ఒకదానిపై ఒకటి ప్రభావం చూపే సైడ్ చైన్‌లతో సహా. హైడ్రోజన్ బంధాలను నలుపు రంగు చుక్కల గీతలుగా చూపించారు.
RC-LH116లో, ఛార్జ్ విభజన ప్రక్రియలో ఎలక్ట్రాన్ బదిలీలో పాల్గొనే RC QA మరియు QB UQ రెండూ వాటి బంధన స్థానాలలో విచ్ఛిన్నమవుతాయి. అయితే, RC-LH114-Wలో, QB క్వినోన్ విశ్లేషించబడలేదు మరియు దాని గురించి క్రింద వివరంగా చర్చించబడుతుంది. QA మరియు QB క్వినోన్‌లతో పాటు, రెండు కీలేటెడ్ UQ అణువులు (RC మరియు LH1 వలయాల మధ్య ఉన్నవి) వాటి స్పష్టంగా విశ్లేషించబడిన హెడ్ గ్రూపుల (వరుసగా Q1 మరియు Q2లో ఉన్నవి) ప్రకారం RC-LH114-W నిర్మాణంలో కేటాయించబడ్డాయి. (పటం 5C). రెండు ఐసోప్రీన్ యూనిట్లు Q1కి కేటాయించబడ్డాయి, మరియు సాంద్రత పటం Q2 యొక్క పూర్తి 10 ఐసోప్రీన్ తోకలను విశ్లేషిస్తుంది. RC-LH116 నిర్మాణంలో, మూడు కీలేటెడ్ UQ10 అణువులు (Q1 నుండి Q3, పటం 5D) విశ్లేషించబడ్డాయి, మరియు అన్ని అణువులు తోక పొడవునా స్పష్టమైన సాంద్రతను కలిగి ఉన్నాయి (పటం 5, D నుండి G). రెండు నిర్మాణాలలో, Q1 మరియు Q2 యొక్క క్వినోన్ హెడ్ గ్రూపుల స్థానాలు అద్భుతమైన స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉన్నాయి (పటం S12F), మరియు అవి RCతో మాత్రమే సంకర్షణ చెందుతాయి. Q1, RC-LH114-W యొక్క W గ్యాప్ ప్రవేశద్వారం వద్ద ఉంది (పటం 1G మరియు 5, C, D మరియు E), మరియు Q2, QB బంధన ప్రదేశానికి సమీపంలో ఉంది (పటం 5, C, D మరియు F). సంరక్షించబడిన L-Trp143 మరియు L-Trp269 అవశేషాలు Q1 మరియు Q2లకు చాలా దగ్గరగా ఉన్నాయి మరియు సంభావ్య π-స్టాకింగ్ పరస్పర చర్యలను అందిస్తాయి (పటం 5, E మరియు F, మరియు పటం S12). Q1 యొక్క దూరపు ఆక్సిజన్ నుండి 3.0 Å దూరంలో ఉన్న L-Gln88, ఒక బలమైన హైడ్రోజన్ బంధాన్ని అందిస్తుంది (పటం 5E); ఈ అవశేషం అత్యంత దూరపు సంబంధం మినహా అన్ని RCలలో సంరక్షించబడింది (పటం S13). చాలా ఇతర RCలలో L-Ser91 స్థానంలో Thrను సంప్రదాయబద్ధంగా ప్రతిక్షేపించారు (పటం S13), ఇది Q1 యొక్క మిథైల్ ఆక్సిజన్ నుండి 3.8 ఆంగ్‌స్ట్రామ్‌ల దూరంలో ఉంది మరియు బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలను అందించవచ్చు (పటం 5E). Q3కి నిర్దిష్టమైన పరస్పర చర్య ఉన్నట్లు కనిపించదు, కానీ ఇది RC-M సబ్‌యూనిట్ మరియు LH1-α సబ్‌యూనిట్ 5 నుండి 6 మధ్య ఉన్న హైడ్రోఫోబిక్ ప్రాంతంలో ఉంది (పటం 5, D మరియు G). Q1, Q2 మరియు Q3 లేదా సమీపంలోని కీలేటెడ్ క్వినోన్‌లను Tch. Gentle, Trv. Strain 970 మరియు Blcలలో కూడా గుర్తించారు. ఐరిస్ నిర్మాణం (9, 10, 12) RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌లో సంరక్షించబడిన సహాయక క్వినోన్ బంధన స్థలాన్ని సూచిస్తుంది (పటం S12G). RC-LH116లోని ఐదు విచ్ఛిన్నమైన UQలు, హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) ద్వారా నిర్ణయించబడిన ప్రతి కాంప్లెక్స్ యొక్క 5.8±0.7 విలువలతో బాగా సరిపోలుతున్నాయి, అయితే RC-LH114-Wలోని మూడు విచ్ఛిన్నమైన UQలు కొలవబడిన 6.2±0.3 విలువ కంటే తక్కువగా ఉన్నాయి (Fig. S14), ఇది నిర్మాణంలో పరిష్కరించబడని UQ అణువులు ఉన్నాయని సూచిస్తుంది.
సూడో-సమరూప L మరియు M పాలిపెప్టైడ్‌లు ఒక్కొక్కటి ఐదు TMHలను కలిగి ఉంటాయి మరియు ఒక BChl డైమర్, రెండు BChl మోనోమర్‌లు, రెండు బాక్టీరియోఫేజ్ (BPh) మోనోమర్‌లు, మరియు ఒక నాన్-హీమ్ ఐరన్ మరియు ఒకటి లేదా రెండు UQ10 అణువులను కలిపే ఒక హెటెరోడైమర్‌ను ఏర్పరుస్తాయి. టెర్మినల్ కీటోన్ సమూహంపై హైడ్రోజన్ బంధాలు ఉండటం మరియు Rpsలో దాని తెలిసిన సంచయం ద్వారా, కెరోటినాయిడ్లు M-సబ్‌యూనిట్‌లో చేర్చబడతాయి, దీనికి సిస్-3,4-డీహైడ్రోరోడోపిన్ అని పేరు పెట్టారు. జాతులు (25). RC-H యొక్క బాహ్య పొర డొమైన్ ఒకే TMH ద్వారా పొరకు లంగరు వేయబడి ఉంటుంది. మొత్తం RC నిర్మాణం సంబంధిత జాతుల (Rba వంటివి) మూడు సబ్‌యూనిట్ RCని పోలి ఉంటుంది. స్ఫెరోయిడ్స్ (PDB ID: 3I4D). ఈ నిర్మాణాల రిజల్యూషన్ పరిధిలో BChl మరియు BPh యొక్క మాక్రోసైకిల్స్, కెరోటినాయిడ్ బ్యాక్‌బోన్ మరియు నాన్-హీమ్ ఐరన్ అతివ్యాప్తి చెందుతాయి, అలాగే QA సైట్ వద్ద ఉన్న UQ10 హెడ్ గ్రూప్ మరియు RC-LH116 వద్ద ఉన్న QB క్వినోన్ కూడా అతివ్యాప్తి చెందుతాయి (మూర్తి S15).
విభిన్న QB సైట్ ఆక్యుపెన్సీ రేట్లతో రెండు RC నిర్మాణాలు అందుబాటులో ఉండటం, QB క్వినోన్ బైండింగ్‌తో పాటు వచ్చే స్థిరమైన కన్ఫర్మేషనల్ మార్పులను పరిశీలించడానికి ఒక కొత్త అవకాశాన్ని అందిస్తుంది. RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌లో, QB క్వినోన్ పూర్తిగా బంధించబడిన "ప్రాక్సిమల్" స్థానంలో (26) ఉంటుంది, కానీ RC-LH114-W యొక్క విభజనలో QB క్వినోన్ ఉండదు. RC-LH114-Wలో QB క్వినోన్ లేదు, ఇది ఆశ్చర్యకరమైన విషయం ఎందుకంటే ఈ కాంప్లెక్స్, నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడిన QB క్వినోన్‌తో ఉన్న RC-LH116 కాంప్లెక్స్ కంటే ఎక్కువగా చురుకుగా ఉంటుంది. రెండు LH1 రింగులు సుమారు ఆరు క్వినోన్‌లను కీలేట్ చేసినప్పటికీ, మూసి ఉన్న RC-LH116 రింగ్‌లో ఐదు నిర్మాణాత్మకంగా పరిష్కరించబడ్డాయి, అయితే తెరిచి ఉన్న RC-LH114-W రింగ్‌లో కేవలం మూడు మాత్రమే నిర్మాణాత్మకంగా పరిమితం చేయబడ్డాయి. ఈ పెరిగిన నిర్మాణాత్మక క్రమరాహిత్యం RC-LH114-W QB సైట్‌ల వేగవంతమైన ప్రతిస్థాపనను, కాంప్లెక్స్‌లో వేగవంతమైన క్వినోన్ కైనటిక్స్‌ను, మరియు LH1 లూప్‌ను దాటే సంభావ్యత పెరగడాన్ని ప్రతిబింబించవచ్చు. RC-LH114-W యొక్క RC QB సైట్‌లో UQ లేకపోవడం అనేది మరింత సంక్లిష్టమైన మరియు మరింత చురుకైన కాంప్లెక్స్ యొక్క ఫలితం కావచ్చునని, మరియు RC-LH114-W యొక్క QB సైట్ UQ టర్నోవర్‌లో తక్షణమే స్తంభింపజేయబడిన నిర్దిష్ట దశ (QB సైట్‌కు ప్రవేశ ద్వారం మూసివేయబడింది) ఈ చర్య యొక్క ఆకృతిని ప్రతిబింబిస్తుందని మేము సూచిస్తున్నాము.
QB లేకుండా, L-Phe217 యొక్క భ్రమణం UQ10 బంధానికి అనుకూలం కాని స్థానానికి జరుగుతుంది, ఎందుకంటే ఇది తోక యొక్క మొదటి ఐసోప్రీన్ యూనిట్‌తో ప్రాదేశిక ఘర్షణకు కారణమవుతుంది (పటం 6A). అదనంగా, స్పష్టమైన ప్రధాన నిర్మాణాత్మక మార్పులు కనిపిస్తాయి, ముఖ్యంగా హెలిక్స్ de (TMH D మరియు E మధ్య లూప్‌లోని చిన్న హెలిక్స్)లో L-Phe217 QB బైండింగ్ పాకెట్‌కు మారడం మరియు L-Tyr223 యొక్క భ్రమణం (పటం 6A) M-Asp45 ఫ్రేమ్‌వర్క్‌తో ఉన్న హైడ్రోజన్ బంధాన్ని విచ్ఛిన్నం చేసి, QB బైండింగ్ సైట్ యొక్క ప్రవేశద్వారాన్ని మూసివేయడం (పటం 6B). హెలిక్స్ de దాని ఆధారం వద్ద తిరుగుతుంది, L-Ser209 యొక్క Cα 0.33Å మేర మారగా, L-Val221Cα 3.52Å మేర మారింది. TMH D మరియు E లలో గమనించదగిన మార్పులు ఏవీ లేవు, ఇవి రెండు నిర్మాణాలలోనూ ఒకదానిపై ఒకటి అతివ్యాప్తి చెందుతాయి (పటం 6A). మనకు తెలిసినంతవరకు, సహజ RCలో QB సైట్‌ను మూసివేసే మొదటి నిర్మాణం ఇదే. పూర్తి (QB-బౌండ్) నిర్మాణంతో పోల్చి చూస్తే, క్వినోన్ క్షయకరణం చెందకముందు, అది క్వినోన్‌లోకి ప్రవేశించడానికి ఒక అనురూప మార్పు అవసరమని తెలుస్తుంది. L-Phe217 భ్రమణం చెంది క్వినోన్ హెడ్ గ్రూప్‌తో π-స్టాకింగ్ పరస్పర చర్యను ఏర్పరుస్తుంది, మరియు హెలిక్స్ బయటకు కదులుతుంది, ఇది L-Gly222 యొక్క అస్థిపంజరం మరియు L-Tyr223 యొక్క సైడ్ చైన్ ఒక స్థిరమైన హైడ్రోజన్ బంధ నిర్మాణంతో హైడ్రోజన్ బంధ నెట్‌వర్క్‌ను ఏర్పరచడానికి అనుమతిస్తుంది (పటం 6, A మరియు C).
(A) హోలోగ్రామ్ (L చైన్, నారింజ/M చైన్, మెజెంటా) మరియు అపో (బూడిద రంగు) నిర్మాణం యొక్క అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కార్టూన్, దీనిలో కీలక అవశేషాలు రాడ్ లాంటి ప్రాతినిధ్య రూపంలో ప్రదర్శించబడతాయి. UQ10 పసుపు పట్టీతో సూచించబడింది. చుక్కల గీత మొత్తం నిర్మాణంలో ఏర్పడిన హైడ్రోజన్ బంధాలను సూచిస్తుంది. (B మరియు C) అపోలిపోప్రొటీన్ మరియు మొత్తం రింగ్ నిర్మాణం యొక్క ఉపరితల ప్రాతినిధ్యం, వరుసగా L-Phe217 యొక్క సైడ్ చైన్ ఆక్సిజన్‌ను నీలం రంగులో మరియు L-Tyr223ను ఎరుపు రంగులో హైలైట్ చేస్తుంది. L సబ్‌యూనిట్ నారింజ రంగులో ఉంది; M మరియు H సబ్‌యూనిట్‌లకు రంగు వేయబడలేదు. (D మరియు E) అపోలిపోప్రొటీన్ (D) మరియు మొత్తం (E) RC QB సైట్‌లు [వరుసగా (A) ద్వారా రంగు వేయబడ్డాయి] మరియు థర్మోఫిలస్ థర్మోఫిలస్ PSII (ఆకుపచ్చ, ప్లాస్టిక్ క్వినోన్‌తో నీలం; PDB ID: 3WU2) అలైన్ (58).
ఊహించని విధంగా, LH1 లేని QB-లోపం ఉన్న RCల యొక్క అనేక నిర్మాణాలు అందుబాటులో ఉన్నప్పటికీ, ఈ అధ్యయనంలో గమనించిన అనురూప మార్పులు ఇంతకు ముందు నివేదించబడలేదు. వీటిలో Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) మరియు Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) నుండి వచ్చిన QB క్షీణత నిర్మాణం ఉన్నాయి, ఇవన్నీ వాటి మొత్తం QB నిర్మాణం వలె దాదాపుగా ఒకేలా ఉంటాయి. 3PRCని నిశితంగా పరిశీలించగా, LDAO (లారిల్ డైమిథైల్ అమైన్ ఆక్సైడ్) డిటర్జెంట్ అణువులు QB స్థానం యొక్క ప్రవేశద్వారం వద్ద బంధించబడతాయని వెల్లడైంది, ఇది మూసి ఉన్న అనురూపంలోకి పునఃఅమరికను నిరోధించవచ్చు. 1EYS లేదా 1OGVలో LDAO అదే స్థానంలో విచ్ఛిన్నం కానప్పటికీ, ఈ RCలు అదే డిటర్జెంట్‌ను ఉపయోగించి తయారు చేయబడ్డాయి మరియు అందువల్ల అదే ప్రభావాన్ని ఉత్పత్తి చేయవచ్చు. Rba యొక్క స్ఫటిక నిర్మాణం. సైటోక్రోమ్ c2 (PDB ID: 1L9B) తో సహ-స్ఫటికీకరించబడిన స్ఫెరోయిడ్స్ RC కూడా ఒక మూసి ఉన్న QB సైట్‌ను కలిగి ఉన్నట్లు కనిపిస్తుంది. అయితే, ఈ సందర్భంలో, RC-M పాలిపెప్టైడ్ యొక్క N-టెర్మినల్ ప్రాంతం (Q హెలిక్స్‌పై ఉన్న Tyr అవశేషం యొక్క H బంధం ద్వారా QB బైండింగ్ సైట్‌తో సంకర్షణ చెందుతుంది) ఒక అసహజమైన ఆకృతిని తీసుకుంటుంది, మరియు QB ఆకృతి మార్పు మరింతగా అన్వేషించబడలేదు (30). భరోసా ఇచ్చే విషయం ఏమిటంటే, RC-LH116 RC యొక్క N-టెర్మినల్ ప్రాంతానికి దాదాపు సమానంగా ఉండే RC-LH114-W నిర్మాణంలో M పాలిపెప్టైడ్ యొక్క ఈ రకమైన వైకల్యాన్ని మేము చూడలేదు. డిటర్జెంట్-ఆధారిత LH1 యాంటెన్నాను తొలగించిన తర్వాత, PDBలోని అపోలిపోప్రొటీన్ RCలు పరిష్కరించబడ్డాయని కూడా గమనించాలి, ఇది RC మరియు చుట్టుపక్కల ఉన్న LH1 రింగ్ యొక్క లోపలి ఉపరితలం మధ్య ఉన్న అంతరంలో అంతర్గత క్వినోన్ పూల్స్ మరియు లిపిడ్‌లను తొలగించింది (31, 32). విచ్ఛిన్నమయ్యే QB క్వినోన్ మినహా, RC అన్ని సహకారకాలను నిలుపుకుంటుంది కాబట్టి అది క్రియాత్మకంగా ఉంటుంది, ఎందుకంటే ఈ క్వినోన్ తక్కువ స్థిరంగా ఉంటుంది మరియు తయారీ ప్రక్రియలో తరచుగా కోల్పోతుంది (33). అదనంగా, RC నుండి LH1 మరియు సహజ చక్రీయ లిపిడ్‌లను తొలగించడం వలన, ఛార్జ్-వేరు చేయబడిన P+QB-స్థితి యొక్క జీవితకాలం తగ్గడం వంటి విధులపై ప్రభావం చూపుతుందని తెలిసింది (31, 34, 35). అందువల్ల, RC చుట్టూ ఉన్న స్థానిక LH1 వలయం యొక్క ఉనికి "మూసివేయబడిన" QB సైట్‌ను నిర్వహించగలదని, తద్వారా QB సమీపంలోని స్థానిక వాతావరణాన్ని కాపాడుతుందని మేము ఊహిస్తున్నాము.
అపోలిపోప్రొటీన్ (QB క్వినోన్ లేకుండా) మరియు పూర్తి నిర్మాణం అనేవి వరుస సంఘటనలు కాకుండా, QB సైట్ యొక్క టర్నోవర్ యొక్క కేవలం రెండు స్నాప్‌షాట్‌లను మాత్రమే సూచిస్తున్నప్పటికీ, సబ్‌స్ట్రేట్ నిరోధాన్ని నిరోధించడానికి హైడ్రోక్వినోన్ ద్వారా పునఃబంధనాన్ని నివారించడానికి ఈ బంధనాన్ని గేట్ చేయవచ్చని సూచనలు ఉన్నాయి. అపోలిపోప్రొటీన్ యొక్క QB సైట్ సమీపంలో క్వినోలాల్ మరియు క్వినోన్ యొక్క పరస్పర చర్య భిన్నంగా ఉండవచ్చు, ఇది RC ద్వారా దాని తిరస్కరణకు దారితీస్తుంది. క్వినోన్‌ల బంధనం మరియు క్షయకరణంలో నిర్మాణాత్మక మార్పులు పాత్ర పోషిస్తాయని చాలా కాలంగా ప్రతిపాదించబడింది. చీకటికి అలవాటుపడిన తర్వాత క్వినోన్‌లను క్షయీకరించే ఘనీభవించిన RCల సామర్థ్యం దెబ్బతింటుంది (36); క్రియాశీల ప్రాక్సిమల్ స్థానం నుండి సుమారు 4.5 Å దూరంలో ఉన్న "డిస్టల్" కన్ఫర్మేషన్‌లో QB క్వినోన్‌లు చిక్కుకుపోవడం వల్ల ఈ నష్టం జరుగుతుందని ఎక్స్-రే క్రిస్టలోగ్రఫీ చూపిస్తుంది (26), 37). క్వినోన్‌తో ప్రారంభ పరస్పర చర్య మరియు QB సైట్ తెరవడం తర్వాత ఏర్పడే అపోలిపోప్రొటీన్ మరియు పూర్తి రింగ్ నిర్మాణం మధ్య ఉన్న మధ్యంతర స్థితి యొక్క స్నాప్‌షాట్ ఈ డిస్టల్ బంధన కన్ఫర్మేషన్ అని మేము సూచిస్తున్నాము.
కొన్ని ఫోటోట్రోఫిక్ బాక్టీరియా మరియు సయనోబాక్టీరియా, శైవలాలు మరియు మొక్కల యొక్క PSII కాంప్లెక్స్‌లో కనిపించే టైప్ II RC నిర్మాణాత్మక మరియు క్రియాత్మక సంరక్షణను కలిగి ఉంటుంది (38). చిత్రం 6 (D మరియు E)లో చూపిన నిర్మాణాత్మక అమరిక PSII RCలు మరియు బాక్టీరియల్ RC కాంప్లెక్స్ యొక్క QB సైట్ మధ్య సారూప్యతను నొక్కి చెబుతుంది. ఈ పోలిక క్వినోన్ బైండింగ్ మరియు రిడక్షన్ యొక్క దగ్గరి సంబంధం ఉన్న వ్యవస్థలను అధ్యయనం చేయడానికి చాలా కాలంగా ఒక నమూనాగా ఉంది. మునుపటి ప్రచురణలు క్వినోన్‌ల యొక్క PSII రిడక్షన్‌తో పాటు నిర్మాణాత్మక మార్పులు సంభవిస్తాయని సూచించాయి (39, 40). అందువల్ల, RC యొక్క పరిణామ సంరక్షణను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, ఇంతకు ముందు గమనించని ఈ బైండింగ్ మెకానిజం ఆక్సిజనేటెడ్ ఫోటోట్రోఫిక్ మొక్కలలోని PSII RC యొక్క QB సైట్‌కు కూడా వర్తించవచ్చు.
Rps ΔpufW (లేబుల్ చేయని pufW తొలగింపు) మరియు PufW-His (సహజ pufW లోకస్ నుండి వ్యక్తీకరించబడిన C-టెర్మినల్ 10x హిస్-ట్యాగ్డ్ ప్రోటీన్-W) జాతులు. palustris CGA009 మా మునుపటి పనిలో వివరించబడింది (16). ఈ జాతులు మరియు ఐసోజెనిక్ వైల్డ్-టైప్ పేరెంట్‌ను ఫ్రీజర్ నుండి PYE (ఒక్కొక్కటి 5 గ్రా లీటర్ -1) (LBలో -80 °C వద్ద నిల్వ చేయబడింది, 50% (w/v) గ్లిసరాల్, ప్రోటీన్, ఈస్ట్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ మరియు సక్సినేట్ కలిగి ఉంటుంది) అగర్ [1.5% (w/v)] ప్లేట్‌పై కొద్ది సంఖ్యలో కణాలను స్ట్రీక్ చేయడం ద్వారా తిరిగి పొందబడ్డాయి. ప్లేట్‌ను రాత్రిపూట గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద వాయురహిత పరిస్థితులలో చీకటిలో ఇంక్యుబేట్ చేయబడింది, ఆపై ఒకే కాలనీ కనిపించే వరకు 3 నుండి 5 రోజుల పాటు OSRAM 116-W హాలోజన్ బల్బుల (RS కాంపోనెంట్స్, UK) ద్వారా అందించబడిన తెల్లని కాంతితో (~50 μmolm-2 s-1) ప్రకాశింపజేయబడింది. 0.1% (w/v) కాసామినో ఆమ్లాలతో (ఇకపై M22గా సూచించబడుతుంది) అనుబంధంగా ఉన్న 10 ml M22+ మాధ్యమం (41) లోకి ఒకే కాలనీని టీకాగా ఉపయోగించారు. ఈ కల్చర్‌ను 34°C వద్ద చీకటిలో తక్కువ ఆక్సిజన్ పరిస్థితులలో 180 rpm వద్ద కదిలిస్తూ 48 గంటల పాటు పెంచారు, ఆపై 70 ml కల్చర్‌ను అదే పరిస్థితులలో 24 గంటల పాటు టీకాగా వేశారు. 1 ml పరిమాణం గల సెమీ-ఏరోబిక్ కల్చర్‌ను 30 ml యూనివర్సల్ స్క్రూ-టాప్ పారదర్శక గాజు సీసాలోని 30 ml M22 మాధ్యమంలోకి టీకాగా వేసి, స్టెరైల్ మాగ్నెటిక్ ఫోర్స్ స్టిరింగ్ రాడ్ ద్వారా 48 గంటల పాటు కదలికతో (~50μmolm-2 s-1) ప్రకాశింపజేశారు. తరువాత, అదే పరిస్థితులలో 30 ml కల్చర్‌ను సుమారు 1 లీటరు కల్చర్‌తో ఇనాక్యులేట్ చేశారు, ఆ తర్వాత దానిని ~200 μmolm-2 s-1 వద్ద 72 గంటల పాటు ప్రకాశింపజేసిన సుమారు 9 లీటర్ల కల్చర్‌ను ఇనాక్యులేట్ చేయడానికి ఉపయోగించారు. కణాలను 7132 RCF వద్ద 30 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించి, ~10 ml 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0)లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, అవసరమయ్యే వరకు -20°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
కరిగించిన తర్వాత, తిరిగి సస్పెండ్ చేసిన కణాలకు కొన్ని డియాక్సిరైబోన్యూక్లియేస్ I (మెర్క్, UK), లైసోజైమ్ (మెర్క్, UK) స్ఫటికాలు మరియు రెండు రోష్ హోలోఎంజైమ్ ప్రోటీస్ ఇన్హిబిటర్ టాబ్లెట్‌లను (మెర్క్, UK) జోడించండి. 20,000 psi ఫ్రెంచ్ ప్రెజర్ సెల్ (అమింకో, USA)లో, కణాలను 8 నుండి 12 సార్లు విచ్ఛిన్నం చేశారు. 4°C వద్ద 15 నిమిషాల పాటు 18,500 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా విచ్ఛిన్నం కాని కణాలు మరియు కరగని శిధిలాలను తొలగించిన తర్వాత, 43,000°C వద్ద 2 గంటల పాటు 113,000 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా రంగుగల లైసేట్ నుండి పొరను అవక్షేపించారు. కరిగే భాగాన్ని పారవేసి, రంగు పొరను 100 నుండి 200 ml 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0)లో తిరిగి సస్పెండ్ చేసి, కనిపించే సముదాయాలు లేకుండా పోయే వరకు సజాతీయీకరించండి. సస్పెండ్ చేయబడిన పొరను 2% (w/v) β-DDM కలిగిన 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0) (అనాట్రేస్, USA)లో 4°C వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు నెమ్మదిగా కలుపుతూ ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఆ తర్వాత, మిగిలిపోయిన కరగని పదార్థాలను తొలగించడానికి, 4°C వద్ద 1 గంట పాటు 150,000 RCFను కరిగించడానికి 70°C వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.
ΔpufW స్ట్రెయిన్ నుండి వచ్చిన ద్రావణీకరణ పొరను, మూడు కాలమ్ వాల్యూమ్‌ల (CV) బైండింగ్ బఫర్ [0.03% (w/v) β-DDM కలిగిన 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0)] తో 50 ml DEAE సెఫరోస్ అయాన్ ఎక్స్ఛేంజ్ కాలమ్‌కు అప్లై చేశారు. కాలమ్‌ను రెండు CV బైండింగ్ బఫర్‌లతో వాష్ చేసి, ఆ తర్వాత 50 mM NaCl కలిగిన రెండు బైండింగ్ బఫర్‌లతో వాష్ చేశారు. RC-LH116 కాంప్లెక్స్‌ను 1.75 CV వద్ద 150 నుండి 300 mM NaCl (బైండింగ్ బఫర్‌లో) లీనియర్ గ్రేడియంట్‌తో ఎల్యూట్ చేశారు, మరియు మిగిలిన బైండింగ్ కాంప్లెక్స్‌ను 0.5 CV వద్ద 300 mM NaCl కలిగిన బైండింగ్ బఫర్‌తో ఎల్యూట్ చేశారు. 250 మరియు 1000 nm మధ్య శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించండి, 880 నుండి 280 nm వద్ద 1 కంటే ఎక్కువ శోషణ నిష్పత్తి (A880/A280) ఉన్న ఫ్రాక్షన్‌ను ఉంచుకోండి, దానిని బైండింగ్ బఫర్‌లో రెండుసార్లు పలుచన చేయండి మరియు శుద్ధీకరణ సమయంలో DEAE కాలమ్‌పై అదే విధానాన్ని మళ్లీ ఉపయోగించండి. 1.7 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 3.0 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులు ఉన్న ఫ్రాక్షన్‌లను పలుచన చేసి, మూడవ రౌండ్ అయాన్ మార్పిడిని నిర్వహించి, 2.2 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 5.0 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తులు ఉన్న ఫ్రాక్షన్‌లను నిలుపుకోండి. పాక్షికంగా శుద్ధి చేయబడిన కాంప్లెక్స్‌ను అమికాన్ 100,000 మాలిక్యులర్ వెయిట్ కట్-ఆఫ్ (MWCO) సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్ (మెర్క్, UK)లో ~2 mlకి గాఢత చేసి, 200 mM NaCl బఫర్‌ను కలిగి ఉన్న సూపర్‌డెక్స్ 200 16/600 సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ కాలమ్ (GE హెల్త్‌కేర్, US)పై లోడ్ చేసి, ఆపై అదే బఫర్‌లో 1.5 CV వద్ద ఎల్యూట్ చేశారు. సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ ఫ్రాక్షన్ యొక్క అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రాలను సేకరించి, 2.4 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 5.8 నుండి 100 A880 వరకు A880/A805 నిష్పత్తులు ఉన్న అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రాలను గాఢత చేసి, వాటిని వెంటనే క్రయో-TEM గ్రిడ్ తయారీ లేదా నిల్వ కోసం ఉపయోగించండి. అవసరమయ్యే వరకు -80°C వద్ద ఉంచండి.
PufW-His స్ట్రెయిన్ నుండి వచ్చిన ద్రావణీకరణ పొరను IMAC బఫర్ (GE హెల్త్‌కేర్)లో 20 ml HisPrep FF Ni-NTA సెఫరోస్ కాలమ్‌కు (20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0) 200 mM NaCl మరియు 0.03% (w/w) కలిగి ఉన్నది) వర్తింపజేయబడింది. v) β-DDM]. కాలమ్‌ను ఐదు CVల IMAC బఫర్‌తో, ఆపై 10 mM హిస్టిడిన్ కలిగిన ఐదు CVల IMAC బఫర్‌తో కడగబడింది. 100 mM హిస్టిడిన్ కలిగిన ఐదు IMAC బఫర్‌లతో కోర్ కాంప్లెక్స్ కాలమ్ నుండి ఎల్యూట్ చేయబడింది. RC-LH114-W కాంప్లెక్స్‌ను కలిగి ఉన్న ఫ్రాక్షన్‌ను Amicon 100,000 MWCO ఫిల్టర్ (మెర్క్, UK) అమర్చిన స్టిర్డ్ ట్యాంక్‌లో ~10 mlకి గాఢత చేసి, బైండింగ్ బఫర్‌తో 20 రెట్లు పలుచగా చేసి, ఆపై 25 ml DEAE సెఫరోస్ కాలమ్‌కు జోడించబడింది, బఫర్‌కు బంధించబడిన నాలుగు CVలు ముందుగానే ఉపయోగించబడతాయి. కాలమ్‌ను నాలుగు CV బైండింగ్ బఫర్‌లతో కడగండి, ఆ తర్వాత 0 నుండి 100 mM NaCl (బైండింగ్ బఫర్‌లో) యొక్క లీనియర్ గ్రేడియంట్‌పై ఎనిమిది CVలలో కాంప్లెక్స్‌ను ఎల్యూట్ చేయండి, మరియు మిగిలిన నాలుగు CVలలో 100 mM బైండింగ్ బఫర్‌ను ఉంచండి. సోడియం క్లోరైడ్‌పై ఎల్యూట్ అయిన అవశేష కాంప్లెక్స్‌లను, 2.4 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తి మరియు 4.6 కంటే ఎక్కువ A880/A805 నిష్పత్తి ఉన్న ఫ్రాక్షన్‌లతో కలిపి, ఒక అమికాన్ 100,000 MWCO సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్‌లో ~2 mlకి గాఢత చేసి, ముందుగా బఫర్ ఈక్విలిబ్రేట్ చేయబడిన సూపర్‌డెక్స్ 200 16/600 సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ కాలమ్‌లో 1.5 CV IMACతో నింపి, ఆ తర్వాత అదే బఫర్‌లో 1.5 CV వరకు ఎల్యూట్ చేయండి. సైజ్-ఎక్స్‌క్లూజన్ ఫ్రాక్షన్‌ల యొక్క అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రాలను సేకరించి, 2.1 కంటే ఎక్కువ A880/A280 నిష్పత్తులు మరియు 4.6 నుండి 100 A880 వరకు A880/A805 నిష్పత్తులు గల అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రాలను గాఢత చేసి, వాటిని వెంటనే ఫ్రోజెన్ TEM గ్రిడ్ తయారీకి ఉపయోగించాలి లేదా అవసరమయ్యే వరకు -80°C వద్ద నిల్వ చేయాలి.
తక్కువ ఉష్ణోగ్రత TEM గ్రిడ్‌లను తయారు చేయడానికి లైకా EM GP ఇమ్మర్షన్ ఫ్రీజర్‌ను ఉపయోగించారు. ఈ కాంప్లెక్స్‌ను IMAC బఫర్‌లో A880 50 కు పలుచబరిచి, ఆ తర్వాత 5μl ను కొత్తగా గ్లో-డిశ్చార్జ్ చేయబడిన క్వాంటిఫాయిల్ 1.2/1.3 కార్బన్-కోటెడ్ కాపర్ మెష్ (అగర్ సైంటిఫిక్, UK) పైకి లోడ్ చేశారు. గ్రిడ్‌ను 20°C మరియు 60% సాపేక్ష ఆర్ద్రత వద్ద 30 సెకన్ల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆ తర్వాత 3 సెకన్ల పాటు పొడిగా తుడిచి, ఆపై -176°C వద్ద ద్రవ ఇథేన్‌లో చల్లార్చారు.
RC-LH114-W కాంప్లెక్స్ యొక్క డేటాను eBIC (ఎలక్ట్రానిక్ బయోఇమేజింగ్ సెంటర్) (బ్రిటిష్ డైమండ్ లైట్ సోర్స్)లో టైటాన్ క్రియోస్ మైక్రోస్కోప్‌తో రికార్డ్ చేశారు. ఇది 300kV త్వరణ వోల్టేజ్, 130,000× నామమాత్రపు మాగ్నిఫికేషన్ మరియు 20 eV ఎనర్జీ గ్యాప్‌తో పనిచేస్తుంది. డేటాను సేకరించి, కౌంటింగ్ మోడ్‌లో చిత్రాలను రికార్డ్ చేయడానికి K2 పీక్ డిటెక్టర్‌తో కూడిన గటాన్ 968 GIF క్వాంటమ్‌ను ఉపయోగించారు. క్యాలిబ్రేట్ చేయబడిన పిక్సెల్ పరిమాణం 1.048Å, మరియు డోస్ రేట్ 3.83 e-Å-2s-1. మూవీని 11 సెకన్లలో సేకరించి, దానిని 40 భాగాలుగా విభజించారు. మైక్రోస్కోప్‌ను రీఫోకస్ చేయడానికి కార్బన్-కోటెడ్ ప్రాంతాన్ని ఉపయోగించి, ఆపై ప్రతి రంధ్రానికి మూడు మూవీలను సేకరించారు. మొత్తం మీద, -1 మరియు -3μm మధ్య డీఫోకస్ విలువలతో 3130 మూవీలను సేకరించారు.
RC-LH116 కాంప్లెక్స్ కోసం డేటాను ఆస్టర్‌బరీ బయోస్ట్రక్చర్ లాబొరేటరీ (యూనివర్సిటీ ఆఫ్ లీడ్స్, UK)లోని అదే మైక్రోస్కోప్‌ను ఉపయోగించి సేకరించారు. ఈ డేటాను 130 k మాగ్నిఫికేషన్‌తో కౌంటింగ్ మోడ్‌లో సేకరించారు, మరియు పిక్సెల్ సైజును 4.6 e-Å-2s-1 డోస్‌తో 1.065 Åకు క్యాలిబ్రేట్ చేశారు. ఈ మూవీని 12 సెకన్లలో రికార్డ్ చేసి, 48 భాగాలుగా విభజించారు. మొత్తం మీద, -1 మరియు -3μm మధ్య డీఫోకస్ విలువలతో 3359 ఫిల్మ్‌లను సేకరించారు.
మొత్తం డేటా ప్రాసెసింగ్ Relion 3.0 పైప్‌లైన్ (42)లో నిర్వహించబడుతుంది. డోస్ వెయిటింగ్ ద్వారా బీమ్ చలనాన్ని సరిచేయడానికి Motioncorr 2 (43)ని ఉపయోగించండి, ఆపై CTF (కాంట్రాస్ట్ ట్రాన్స్‌ఫర్ ఫంక్షన్) పారామీటర్‌ను నిర్ణయించడానికి CTFFIND 4.1 (44)ని ఉపయోగించండి. ఈ ప్రారంభ ప్రాసెసింగ్ దశల తర్వాత సాధారణ ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్‌లు చిత్రం 2. S16లో చూపబడ్డాయి. 250-పిక్సెల్ ఫ్రేమ్‌లోని 1000 కణాలలో సుమారు 250 పిక్సెల్‌లను మాన్యువల్‌గా ఎంచుకోవడం ద్వారా మరియు రిఫరెన్స్ టూ-డైమెన్షనల్ (2D) వర్గీకరణ లేకుండా ఆటోమేటిక్ సెలక్షన్ టెంప్లేట్ రూపొందించబడింది, తద్వారా నమూనా కాలుష్యాన్ని కలిగి ఉన్న లేదా గుర్తించదగిన లక్షణాలు లేని వర్గీకరణలను తిరస్కరించింది. ఆ తర్వాత, అన్ని మైక్రోఫోటోగ్రాఫ్‌లపై ఆటోమేటిక్ సెలక్షన్ నిర్వహించబడింది, మరియు RC-LH114-W 849,359 కణాలుగా మరియు RC-LH116 కాంప్లెక్స్ 476,547 కణాలుగా ఉన్నాయి. ఎంపిక చేయబడిన అన్ని కణాలు రెండు రౌండ్ల నాన్-రిఫరెన్స్ 2D వర్గీకరణకు గురయ్యాయి, మరియు ప్రతి రన్ తర్వాత, కార్బన్ ప్రాంతం, నమూనా కాలుష్యం, స్పష్టమైన లక్షణాలు లేకపోవడం లేదా బలంగా అతివ్యాప్తి చెందుతున్న కణాలను తిరస్కరించడం జరిగింది. ఫలితంగా, వరుసగా RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క 3D వర్గీకరణ కోసం 772,033 (90.9%) మరియు 359,678 (75.5%) కణాలను ఉపయోగించారు. ప్రారంభ 3D రిఫరెన్స్ మోడల్‌ను స్టోకాస్టిక్ గ్రేడియంట్ డిసెంట్ పద్ధతిని ఉపయోగించి రూపొందించారు. ప్రారంభ మోడల్‌ను రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగించి, ఎంపిక చేయబడిన కణాలను 3Dలో నాలుగు వర్గాలుగా వర్గీకరించారు. ఈ వర్గంలోని మోడల్‌ను రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగించి, అతిపెద్ద వర్గంలోని కణాలపై 3D రిఫైనింగ్ నిర్వహించారు, ఆపై ద్రావణి ప్రాంతాన్ని కవర్ చేయడానికి ప్రారంభ 15Å లో-పాస్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించారు, 6 పిక్సెల్‌ల సాఫ్ట్ ఎడ్జ్‌లను జోడించారు, మరియు టాప్ డిటెక్టర్ యొక్క Gatan K2 పీక్ మాడ్యులేషన్ ట్రాన్స్‌ఫర్ ఫంక్షన్‌ను సరిచేయడానికి పిక్సెల్‌లను పోస్ట్-ప్రాసెస్ చేశారు. RC-LH114-W డేటాసెట్ కోసం, మాస్క్ అంచుల వద్ద ఉన్న బలమైన సాంద్రతను (UCSF చిమెరాలోని కోర్ కాంప్లెక్స్ సాంద్రత నుండి వేరు చేయబడినది) తొలగించడం ద్వారా ఈ ప్రారంభ నమూనా సవరించబడింది. ఫలితంగా వచ్చిన నమూనాలు (RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క రిజల్యూషన్‌లు వరుసగా 3.91 మరియు 4.16 Å) రెండవ రౌండ్ 3D వర్గీకరణకు సూచనగా ఉపయోగించబడ్డాయి. ఉపయోగించిన కణాలు ప్రారంభ 3D తరగతిలో సమూహపరచబడ్డాయి మరియు పరిసరాలతో బలమైన సహసంబంధాన్ని కలిగి ఉండవు. అతివ్యాప్తి లేదా స్పష్టమైన నిర్మాణ లక్షణాల కొరత. రెండవ రౌండ్ 3D వర్గీకరణ తర్వాత, అత్యధిక రిజల్యూషన్ ఉన్న వర్గం ఎంపిక చేయబడింది [RC-LH114-W కోసం, ఒక వర్గంలో 377,703 కణాలు (44.5%), RC-LH116 కోసం, రెండు వర్గాలు ఉన్నాయి, మొత్తం 260,752 కణాలు (54.7%), ఇక్కడ ప్రారంభ భ్రమణం తర్వాత ఒక చిన్న తేడాతో అమర్చినప్పుడు మాత్రమే అవి ఒకేలా ఉంటాయి]. ఎంపిక చేయబడిన కణాలను 400-పిక్సెల్ బాక్స్‌లో తిరిగి సంగ్రహించి, 3D రిఫైనింగ్ ద్వారా శుద్ధి చేస్తారు. ప్రారంభ 15Å లో-పాస్ ఫిల్టర్, 3 పిక్సెల్ మ్యాప్ విస్తరణ మరియు 3 పిక్సెల్ సాఫ్ట్ మాస్క్‌ను ఉపయోగించి సాల్వెంట్ మాస్క్‌ను రూపొందిస్తారు. ప్రతి దశ తర్వాత, ఫలిత టెక్స్చర్‌ను మరింత శుద్ధి చేయడానికి, ప్రతి-కణ CTF రిఫైన్‌మెంట్, ప్రతి-కణ చలన సవరణ మరియు రెండవ రౌండ్ ప్రతి-కణ CTF రిఫైన్‌మెంట్, 3D రిఫైన్‌మెంట్, సాల్వెంట్ మాస్కింగ్ మరియు పోస్ట్-ప్రాసెసింగ్ నిర్వహిస్తారు. 0.143 యొక్క FSC (ఫోరియర్ షెల్ కోరిలేషన్ కోఎఫిషియంట్) కట్-ఆఫ్ విలువను ఉపయోగించి, RC-LH114-W మరియు RC-LH116 యొక్క తుది నమూనాల రిజల్యూషన్‌లు వరుసగా 2.65 మరియు 2.80Åగా ఉన్నాయి. తుది నమూనా యొక్క FSC వక్రరేఖను చిత్రం 2. S17లో చూపించారు.
అన్ని ప్రోటీన్ సీక్వెన్సులు UniProtKB నుండి డౌన్‌లోడ్ చేయబడ్డాయి: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC యొక్క హోమోలజీ మోడల్‌ను నిర్మించడానికి SWISS-MODEL (45) ఉపయోగించబడింది, ఇందులో RC-L, RC-M మరియు RC-H యొక్క ప్రోటీన్ సీక్వెన్సులు ఉన్నాయి మరియు Rba. sphaeroides RC యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం (PDB ID: 5LSE) (46) ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడింది. ఉత్పత్తి చేయబడిన మోడల్‌ను మ్యాప్‌కు (47) సరిపోయేలా చేయడానికి, ప్రోటీన్ నిర్మాణాన్ని మెరుగుపరచడానికి మరియు కోఫ్యాక్టర్ [4×BChl a (మోనోమర్ లైబ్రరీ అవశేష పేరు = BCL), 2×BPh a (BPH), ఒకటి లేదా రెండు రకాల UQ10 (U10), ఒక నాన్-హీమ్ ఐరన్ (Fe) మరియు ఒక 3,4-డైహైడ్రోహెక్సాకార్బోనిల్‌కోలిన్ (QAK)] లను Coot (48) ఉపయోగించి జోడించడానికి UCSF చిమెరాలోని “ఫిట్ మ్యాప్” సాధనాన్ని ఉపయోగించండి. మోనోమర్ లైబ్రరీలో QAK అందుబాటులో లేనందున, PHENIX (49) లోని eLBOW సాధనాన్ని ఉపయోగించి దీనిని పారామితీకరించారు.
తరువాత, LH1 సబ్‌యూనిట్ నిర్మించబడింది. ప్రారంభంలో, మ్యాప్ మరియు LH1-α మరియు LH1-β ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లను ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించి LH1 సీక్వెన్స్‌లోని భాగాన్ని స్వయంచాలకంగా నిర్మించడానికి PHENIX (49)లోని ఆటోమేటిక్ కన్‌స్ట్రక్షన్ టూల్ ఉపయోగించబడింది. అత్యంత పూర్తి LH1 సబ్‌యూనిట్‌ను ఎంచుకుని, దానిని ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ చేసి, Cootలోకి లోడ్ చేయండి, దానిలో లోపించిన సీక్వెన్స్‌ను మాన్యువల్‌గా జోడించండి, మరియు రెండు BClలు (BCL) మరియు స్పిరిల్లోక్సాంథిన్ (CRT) [సంబంధిత Rps జాతుల (17) ప్రకారం] జోడించే ముందు మొత్తం నిర్మాణాన్ని మాన్యువల్‌గా రిఫైన్ చేయండి. పూర్తి LH1 సబ్‌యూనిట్‌ను కాపీ చేసి, UCSF చిమెరా “డాకింగ్ మ్యాప్ టూల్”ని ఉపయోగించి LH1 సాంద్రత యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న నాన్-మోడల్ ప్రాంతంలో డాక్ చేసి, ఆపై దానిని Cootలో రిఫైన్ చేయండి; అన్ని LH1 సబ్‌యూనిట్‌లు మోడల్ అయ్యే వరకు ఈ ప్రక్రియను పునరావృతం చేయండి. RC-LH114-W నిర్మాణం కోసం, Coot లో కేటాయించని సాంద్రతను సంగ్రహించడం ద్వారా, USCF చిమెరా మ్యాప్‌లోని మిగిలిన ప్రోటీన్-యేతర భాగాల నుండి ప్రోటీన్‌ను విభజించి, ప్రారంభ నమూనాను స్థాపించడానికి ఆటోబిల్డ్ సాధనాన్ని ఉపయోగిస్తారు, మరియు మిగిలిన ఉపయూనిట్లు (ప్రోటీన్-W) మోడలింగ్ చేయబడతాయి. PHENIX (49) లో. Coot (48) లో ఫలిత నమూనాకు ఏవైనా తప్పిపోయిన సీక్వెన్స్‌లను జోడించి, ఆపై మొత్తం ఉపయూనిట్‌ను మాన్యువల్‌గా మెరుగుపరచండి. మిగిలిన కేటాయించని సాంద్రత లిపిడ్లు (CDL = CDL, POPC = 6PL మరియు POPG = PGT యొక్క PDB మోనోమర్ లైబ్రరీ ID), β-DDM డిటర్జెంట్ (LMT) మరియు UQ10 అణువుల (U10) కలయికకు సరిపోతుంది. మోడల్ గణాంకాలు మరియు ఫిట్ యొక్క దృశ్య నాణ్యతను మరింత మెరుగుపరచలేనంత వరకు పూర్తి ప్రారంభ నమూనాను పరిపూర్ణం చేయడానికి PHENIX ఆప్టిమైజేషన్ (49) మరియు Coot (48) లో మాన్యువల్ ఆప్టిమైజేషన్‌ను ఉపయోగించండి. చివరగా, స్థానిక మ్యాప్‌ను పదును పెట్టడానికి LocScale (50) ని ఉపయోగించండి, ఆపై కేటాయించని సాంద్రతను మోడలింగ్ చేయడం మరియు స్వయంచాలక మరియు మాన్యువల్ ఆప్టిమైజేషన్ యొక్క అనేక ఇతర చక్రాలను నిర్వహించండి.
వాటి సంబంధిత సాంద్రతలలో డాక్ చేయబడిన సంబంధిత పెప్టైడ్‌లు, కోఫ్యాక్టర్‌లు మరియు ఇతర లిపిడ్‌లు మరియు క్వినోన్‌లు చిత్రాలు 1 మరియు 2లో చూపబడ్డాయి. S18 నుండి S23 వరకు. తుది నమూనా యొక్క గణాంక సమాచారం పట్టిక S1లో చూపబడింది.
ప్రత్యేకంగా పేర్కొనకపోతే, UV/Vis/NIR శోషణ వర్ణపటాలను 250 nm నుండి 1000 nm వరకు 1 nm విరామాలలో మరియు 0.1s ఏకీకరణ సమయంలో క్యారీ60 స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ (అజిలెంట్, USA) పై సేకరించారు.
నమూనాను 2 మిమీ మార్గం గల క్వార్ట్జ్ క్యూవెట్‌లో A880 కు 1 నిష్పత్తిలో పలుచగా చేసి, 400 మరియు 1000 nm మధ్య శోషణ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించండి. సర్క్యులర్ డైక్రోయిక్ స్పెక్ట్రాలను జాస్కో 810 స్పెక్ట్రోపోలారిమీటర్ (జాస్కో, జపాన్) పై 400 nm మరియు 950 nm మధ్య 1 nm విరామాలలో, 20 nm min-1 స్కాన్ రేటుతో సేకరించారు.
మోలార్ ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫిషియంట్‌ను కోర్ కాంప్లెక్స్‌ను సుమారుగా 50 A880 కు పలుచన చేయడం ద్వారా నిర్ణయిస్తారు. 10μl పరిమాణాన్ని 990μl బైండింగ్ బఫర్ లేదా మెథనాల్‌లో పలుచన చేసి, BChl క్షీణతను తగ్గించడానికి వెంటనే అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రమ్‌ను సేకరించండి. ప్రతి మెథనాల్ నమూనా యొక్క BChl కంటెంట్‌ను 771 nm వద్ద 54.8 mM-1 cm-1 ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫిషియంట్ ద్వారా లెక్కించారు, మరియు ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫిషియంట్‌ను నిర్ణయించారు (51). కోర్ కాంప్లెక్స్ గాఢతను నిర్ణయించడానికి, కొలిచిన BChl గాఢతను 32 (RC-LH114-W) లేదా 36 (RC-LH116) తో భాగించండి, దీనిని బఫర్‌లో సేకరించిన అదే నమూనా యొక్క అబ్సార్ప్షన్ స్పెక్ట్రమ్ ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫిషియంట్‌ను నిర్ణయించడానికి సమాంతరంగా ఉపయోగిస్తారు. ప్రతి నమూనాకు మూడు పునరావృత కొలతలు తీసుకున్నారు, మరియు BChl Qy గరిష్ట సగటు అబ్సార్బెన్స్‌ను లెక్కింపు కోసం ఉపయోగించారు. 878 nm వద్ద కొలిచిన RC-LH114-W యొక్క విలుప్త గుణకం 3280±140 mM-1 cm-1 కాగా, 880 nm వద్ద కొలిచిన RC-LH116 యొక్క విలుప్త గుణకం 3800±30 mM-1 cm-1.
(52) లోని పద్ధతి ప్రకారం UQ10 పరిమాణీకరించబడింది. క్లుప్తంగా, అజిలెంట్ 1200 HPLC సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి రివర్స్ ఫేజ్ HPLC (RP-HPLC) నిర్వహించబడింది. సుమారు 0.02 nmol RC-LH116 లేదా RC-LH114-W ను 0.02% (w/v) ఫెర్రిక్ క్లోరైడ్ కలిగిన 50:50 మిథనాల్:క్లోరోఫామ్ యొక్క 50μl లో కరిగించి, ముందుగా సమతుల్యం చేయబడిన బెక్మాన్ కౌల్టర్ అల్ట్రాస్ఫియర్ ODS 4.6 mm ను ×25 cm కాలమ్‌పైకి ఇంజెక్ట్ చేయండి. HPLC ద్రావణిలో (80:20 మిథనాల్:2-ప్రొపనాల్) 40°C వద్ద నిమిషానికి 1 ml చొప్పున కరిగించండి. 1 గంట పాటు 275 nm (UQ10), 450 nm (కెరోటినాయిడ్స్) మరియు 780 nm (BChl) వద్ద శోషణను పర్యవేక్షించడానికి HPLC ద్రావణిలో ఐసోక్రాటిక్ ఎల్యూషన్ చేయండి. 25.5 నిమిషాల వద్ద 275 nm క్రోమాటోగ్రామ్‌లోని శిఖరాన్ని ఇంటిగ్రేట్ చేయగా, అందులో గుర్తించదగిన ఇతర సమ్మేళనాలు ఏవీ లేవు. 0 నుండి 5.8 nmol వరకు స్వచ్ఛమైన స్టాండర్డ్స్‌ను ఇంజెక్ట్ చేయడం ద్వారా లెక్కించిన క్యాలిబ్రేషన్ కర్వ్‌ను (పటం S14) సూచనగా తీసుకుని, వెలికితీసిన UQ10 యొక్క మోలార్ పరిమాణాన్ని లెక్కించడానికి ఇంటిగ్రేటెడ్ ఏరియాను ఉపయోగించారు. ప్రతి నమూనాను మూడుసార్లు విశ్లేషించారు, మరియు నివేదించబడిన దోషం సగటు యొక్క ప్రామాణిక విచలనం (SD)కి అనుగుణంగా ఉంటుంది.
0.1 గరిష్ట Qy శోషణ కలిగిన RC-LH1 కాంప్లెక్స్‌ను కలిగి ఉన్న ఒక ద్రావణాన్ని, 30 μM రిడ్యూస్డ్ హార్స్ హార్ట్ సైటోక్రోమ్ c2 (మెర్క్, UK) మరియు 0 నుండి 50 μM MUQ2 (మెర్క్, UK) తో తయారుచేయబడింది. ప్రతి UQ2 గాఢత వద్ద మూడు 1-ml నమూనాలను తయారుచేసి, కొలతకు ముందు చీకటికి పూర్తిగా అలవాటుపడటాన్ని నిర్ధారించడానికి 4°C వద్ద చీకటిలో రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేయబడ్డాయి. ఈ ద్రావణాన్ని 300 nm ఫ్లేమ్/500 లైన్ గ్రేటింగ్, 1.24 mm ఇన్లెట్, 0.12 mm మధ్య మరియు 0.6 mm అవుట్‌లెట్ స్లిట్‌లతో కూడిన OLIS RSM1000 మాడ్యులర్ స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌లోకి లోడ్ చేయబడింది. ఎక్సైటేషన్ కాంతిని మినహాయించడానికి, శాంపిల్ ఫోటోట్యూబ్ మరియు రిఫరెన్స్ ఫోటోమల్టిప్లయర్ ట్యూబ్ ప్రవేశద్వారం వద్ద 600 nm లాంగ్ పాస్ ఫిల్టర్ ఉంచబడింది. 0.15 సెకన్ల ఇంటిగ్రేషన్ సమయంతో 550 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్ పర్యవేక్షించబడింది. ఉత్తేజిత కాంతి 880 nm M880F2 LED (లైట్ ఎమిటింగ్ డయోడ్) (థోర్‌ల్యాబ్స్ లిమిటెడ్, UK) నుండి, DC2200 కంట్రోలర్ (థోర్‌ల్యాబ్స్ లిమిటెడ్, UK) ద్వారా ఫైబర్ ఆప్టిక్ కేబుల్ ద్వారా 90% తీవ్రతతో ప్రసరిస్తుంది మరియు కాంతి మూలానికి 90° కోణంలో ప్రసరిస్తుంది. నమూనా ద్వారా మొదట శోషించబడని ఏదైనా కాంతిని తిరిగి పంపడానికి కొలత పుంజం అద్దానికి ఎదురుగా ఉంటుంది. 50 సెకన్ల ప్రకాశానికి 10 సెకన్ల ముందు శోషణను పర్యవేక్షించండి. ఆ తర్వాత, క్వినోలాల్ సైటోక్రోమ్ c23 + ను ఎంత మేరకు స్వయంగా తగ్గిస్తుందో అంచనా వేయడానికి, చీకటిలో 60 సెకన్ల పాటు శోషణను మరింతగా పర్యవేక్షించారు (ముడి డేటా కోసం చిత్రం S8 చూడండి).
UQ2 గాఢతను బట్టి 0.5 నుండి 10 సెకన్ల పరిధిలో ఒక సరళ ప్రారంభ రేటును అమర్చి, ప్రతి UQ2 గాఢత వద్ద మూడు నమూనాల రేట్లను సగటు చేయడం ద్వారా డేటాను ప్రాసెస్ చేశారు. సంబంధిత ఎక్స్‌టింక్షన్ కోఎఫిషియంట్ ద్వారా లెక్కించబడిన RC-LH1 గాఢతను, రేటును ఉత్ప్రేరక సామర్థ్యంగా మార్చడానికి ఉపయోగించారు, దానిని ఆరిజిన్ ప్రో 2019 (ఆరిజిన్‌ల్యాబ్, USA)లో ప్లాట్ చేసి, స్పష్టమైన Km మరియు Kcat విలువలను నిర్ధారించడానికి మైఖేలిస్-మెంటెన్ మోడల్‌కు అమర్చారు.
తాత్కాలిక శోషణ కొలతల కోసం, RC-LH1 నమూనాను 50 mM సోడియం ఆస్కార్బేట్ (మెర్క్, USA) మరియు 0.4 mM టెర్బుటిన్ (మెర్క్, USA) కలిగిన IMAC బఫర్‌లో ~2μM కు పలుచన చేశారు. కొలత ప్రక్రియ అంతటా ప్రధాన RC దాత క్షయకరణ స్థితిలో (అంటే, ఫోటోఆక్సీకరణ చెందకుండా) ఉండేలా చూసుకోవడానికి, ఆస్కార్బిక్ ఆమ్లాన్ని త్యాగపూరిత ఎలక్ట్రాన్ దాతగా మరియు టెర్ట్-బుటాక్లోఫెన్‌ను QB నిరోధకంగా ఉపయోగిస్తారు. ఉద్దీపన పల్స్‌ల మధ్య లేజర్ మార్గంలోని నమూనాకు చీకటికి అలవాటుపడటానికి తగినంత సమయం ఉండేలా చూసుకోవడానికి, సుమారు 3 ml నమూనాను 2 mm ఆప్టికల్ మార్గ పొడవు గల ఒక ప్రత్యేకంగా తయారుచేసిన తిరిగే సెల్‌కు (సుమారు 0.1 మీ వ్యాసం, 350 RPM) కలుపుతారు. Ti: సఫైర్ లేజర్ వ్యవస్థను (స్పెక్ట్రా ఫిజిక్స్, USA) విస్తరించడానికి ~100-fs లేజర్ పల్స్‌లను ఉపయోగించి, 1 kHz పునరావృత రేటుతో (NIR కోసం 20 nJ లేదా Vis కోసం 100 nJ) 880 nm వద్ద నమూనాను ఉత్తేజపరచండి. డేటాను సేకరించే ముందు, నమూనాను సుమారు 30 నిమిషాల పాటు ఉత్తేజ కాంతికి బహిర్గతం చేయండి. ఈ బహిర్గతం QA నిష్క్రియం కావడానికి కారణమవుతుంది (బహుశా QA ఒకటి లేదా రెండుసార్లు తగ్గుతుంది). కానీ దయచేసి గమనించండి, ఈ ప్రక్రియ పునరుద్ధరించదగినది, ఎందుకంటే సుదీర్ఘ చీకటి అనుసరణ కాలం తర్వాత, RC నెమ్మదిగా QA క్రియాశీలతను తిరిగి పొందుతుంది. -10 నుండి 7000 ps ఆలస్య సమయంతో తాత్కాలిక స్పెక్ట్రాలను కొలవడానికి హీలియోస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌ను (అల్ట్రాఫాస్ట్ సిస్టమ్స్, USA) ఉపయోగించారు. డేటా సెట్‌లను అన్‌గ్రూప్ చేయడానికి, ఆపై విలీనం చేసి ప్రామాణీకరించడానికి సర్ఫేస్ ఎక్స్‌ప్లోరర్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను (అల్ట్రాఫాస్ట్ సిస్టమ్స్, USA) ఉపయోగించండి. క్షయానికి సంబంధించిన అవకలన వర్ణపటాలను పొందడానికి సంయుక్త డేటా సెట్‌ను ఉపయోగించడానికి కార్పెట్‌వ్యూ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీని (లైట్ కన్వర్షన్ లిమిటెడ్, లిథువేనియా) ఉపయోగించండి, లేదా ఆరిజిన్ (ఆరిజిన్‌ల్యాబ్, USA)లో ఏక-తరంగదైర్ఘ్య వర్ణపట పరిణామానికి సరిపోయేలా చేయడానికి పరికర ప్రతిస్పందనతో బహుళ ఘాతాంకాలను కన్వాల్వ్ చేసే ఫంక్షన్‌ను ఉపయోగించండి.
పైన పేర్కొన్న విధంగా (53), RC మరియు పరిధీయ LH2 యాంటెన్నా రెండూ లేని LH1 కాంప్లెక్స్‌ను కలిగి ఉన్న కిరణజన్య సంయోగక్రియ ఫిల్మ్ తయారు చేయబడింది. పొరను 20 mM ట్రిస్ (pH 8.0)లో పలుచన చేసి, ఆపై 2 mm ఆప్టికల్ మార్గంతో క్వార్ట్జ్ క్యూవెట్‌లోకి లోడ్ చేయబడింది. -10 నుండి 7000 ps ఆలస్య సమయంతో 540 nm వద్ద నమూనాను ఉత్తేజపరచడానికి 30nJ లేజర్ పల్స్ ఉపయోగించబడింది. Rps. pal నమూనా కోసం వివరించిన విధంగా డేటా సెట్‌ను ప్రాసెస్ చేయండి.
పొరను 4°C వద్ద 2 గంటల పాటు 150,000 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పెల్లెట్ చేయబడింది, ఆపై దాని 880 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0) మరియు 200 mM NaClలో తిరిగి సస్పెండ్ చేయబడింది. 4°C వద్ద చీకటిలో 1 గంట పాటు 2% (w/v) β-DDMలో నెమ్మదిగా కదిలించడం ద్వారా పొరను కరిగించండి. నమూనాను 100 mM ట్రైఇథైల్అమ్మోనియం కార్బోనేట్ (pH 8.0) (TEAB; మెర్క్, UK)లో 2.5 mg ml-1 (బయో-రాడ్ విశ్లేషణ) ప్రోటీన్ గాఢతకు పలుచన చేయబడింది. 1% (w/v) సోడియం లారేట్ (మెర్క్, UK) కలిగిన మొత్తం 50 μl TEABలోకి 50 μg ప్రోటీన్‌ను పలుచన చేయడంతో ప్రారంభించి, గతంలో ప్రచురించిన పద్ధతి (54) నుండి తదుపరి ప్రాసెసింగ్ నిర్వహించబడింది. 60 సెకన్ల పాటు సోనికేషన్ చేసిన తర్వాత, దానిని 37°C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు 5 mM ట్రైస్(2-కార్బాక్సీఇథైల్)ఫాస్ఫైన్ (మెర్క్, UK)తో క్షయీకరించారు. S-ఆల్కైలేషన్ కోసం, నమూనాను 10 mM మిథైల్ S-మిథైల్‌థయోమిథేన్‌సల్ఫోనేట్ (మెర్క్, UK)తో ఇంక్యుబేట్ చేసి, దానిని 200 mM ఐసోప్రొపనాల్ స్టాక్ ద్రావణం నుండి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు కలిపారు. 2 μg ట్రిప్సిన్/ఎండోప్రొటీనేస్ లైస్-సి మిశ్రమాన్ని (ప్రొమెగా UK) కలిపి, 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా ప్రొటీయోలైటిక్ డైజెషన్ నిర్వహించబడింది. 50 μl ఇథైల్ అసిటేట్ మరియు 10 μl 10% (v/v) LC గ్రేడ్ ట్రైఫ్లోరోఅసిటిక్ యాసిడ్ (TFA; థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) కలిపి, 60 సెకన్ల పాటు వోర్టెక్సింగ్ చేయడం ద్వారా లారేట్ సర్ఫ్యాక్టెంట్‌ను సంగ్రహించారు. 15,700 RCF వద్ద 5 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయడం ద్వారా దశల విభజనను ప్రోత్సహించారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, పెప్టైడ్‌ను కలిగి ఉన్న దిగువ దశను జాగ్రత్తగా ఆస్పిరేట్ చేయడానికి మరియు డీసాల్ట్ చేయడానికి C18 స్పిన్ కాలమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) ఉపయోగించబడింది. వాక్యూమ్ సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ఆరబెట్టిన తర్వాత, నమూనాను 0.5% TFA మరియు 3% అసిటోనైట్రిల్‌లో కరిగించి, ముందుగా వివరించిన సిస్టమ్ పారామితులను ఉపయోగించి మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో జతచేయబడిన నానోఫ్లో RP క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా 500 ngని విశ్లేషించారు.
Rps. palustris ప్రోటియోమ్ డేటాబేస్ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)లో శోధించడానికి, ప్రోటీన్ గుర్తింపు మరియు పరిమాణీకరణ కోసం MaxQuant v.1.5.3.30 (56)ని ఉపయోగించండి. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ప్రోటియోమిక్స్ డేటా, PRIDE భాగస్వామి రిపోజిటరీ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ద్వారా ప్రోటియోమ్‌ఎక్స్‌ఛేంజ్ అలయన్స్‌లో PXD020402 అనే డేటాసెట్ ఐడెంటిఫైయర్ కింద నిక్షిప్తం చేయబడింది.
ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనైజేషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీతో కూడిన RPLC ద్వారా విశ్లేషణ కోసం, వైల్డ్-టైప్ Rps నుండి RC-LH1 కాంప్లెక్స్ తయారు చేయబడింది. గతంలో ప్రచురించిన పద్ధతిని (16) ఉపయోగించి, పాలుస్ట్రిస్ కణాలలో ఉత్పత్తి చేయబడిన ప్రోటీన్ గాఢత 20 mM హెపెస్ (pH 7.8), 100 mM NaCl మరియు 0.03% (w/v) β- (బయో-రాడ్ విశ్లేషణ) DDM లో 2 mg ml-1 గా ఉంది. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, అవక్షేపణ పద్ధతి ద్వారా 10 μg ప్రోటీన్‌ను సంగ్రహించడానికి 2D ప్యూరిఫికేషన్ కిట్ (GE హెల్త్‌కేర్, USA) ను ఉపయోగించండి, మరియు అవక్షేపాన్ని 20 μl 60% (v/v) ఫార్మిక్ ఆమ్లం (FA), 20% (v/v) అసిటోనైట్రైల్ మరియు 20% (v/v) నీటిలో కరిగించండి. ఐదు మైక్రోలీటర్లను మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (మాక్సిస్ UHR-TOF, బ్రూకర్) తో కూడిన RPLC (డయోనెక్స్ RSLC) ద్వారా విశ్లేషించారు. 60°C మరియు 100μlmin -1 వద్ద వేరుచేయడం కోసం MabPac 1.2×100 mm కాలమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) ను ఉపయోగించండి. దీనికోసం 85% (v/v) సాల్వెంట్ A [0.1% (v/v) FA మరియు 0.02% (V/v) TFA జల ద్రావణం] నుండి 85% (v/v) సాల్వెంట్ B [90% (v/v) ఎసిటోనైట్రైల్‌లో 0.1% (v/v) FA మరియు 0.02% (v/v) TFA] వరకు గ్రేడియంట్‌ను వాడండి. 60 నిమిషాల కంటే ఎక్కువ సేపు ప్రామాణిక ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనైజేషన్ సోర్స్ మరియు డిఫాల్ట్ పారామీటర్లను ఉపయోగించినప్పుడు, మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ 100 నుండి 2750 m/z (మాస్-టు-ఛార్జ్ నిష్పత్తి) ను పొందుతుంది. ExPASy బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ రిసోర్స్ పోర్టల్ FindPept టూల్ (https://web.expasy.org/findpept/) సహాయంతో, మాస్ స్పెక్ట్రమ్‌ను కాంప్లెక్స్ యొక్క సబ్‌యూనిట్‌లకు మ్యాప్ చేయండి.
కణాలను 100 ml NF-తక్కువ (10μMm-2 s-1), మధ్యస్థ (30μMm-2 s-1) లేదా అధిక (300μMm-2 s-1) కాంతి కింద 72 గంటల పాటు పెంచారు. 100 ml స్క్రూ-టాప్ బాటిల్‌లో (23) M22 మీడియం (అమ్మోనియం సల్ఫేట్‌ను తొలగించి, సోడియం సక్సినేట్‌కు బదులుగా సోడియం అసిటేట్‌ను కలిపిన M22 మీడియం) వాడారు. ఐదు 30-సెకన్ల చక్రాలలో, కణాలను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి 1:1 ఘనపరిమాణ నిష్పత్తిలో 0.1 మైక్రాన్ గాజు పూసలను వేసి, 5 నిమిషాల పాటు మంచు మీద చల్లబరిచారు. బెంచ్‌టాప్ మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్‌లో 10 నిమిషాల పాటు 16,000 RCF వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయడం ద్వారా కరగని పదార్థం, విచ్ఛిన్నం కాని కణాలు మరియు గాజు పూసలను తొలగించారు. 20 mM ట్రిస్-HCl (pH 8.0)లో 40/15% (w/w) సుక్రోజ్ గ్రేడియంట్‌తో 100,000 RCF ఉపయోగించి Ti 70.1 రోటర్‌లో పొరను 10 గంటల పాటు వేరు చేశారు.
మా మునుపటి పనిలో వివరించినట్లుగా, PufW (16) పై హిస్ ట్యాగ్ యొక్క ఇమ్యునోడిటెక్షన్. క్లుప్తంగా, శుద్ధి చేయబడిన కోర్ కాంప్లెక్స్ (11.8 nM) లేదా అదే గాఢతలో RC (ఆక్సీకరణను తీసివేసి, తగ్గించబడిన వ్యత్యాస స్పెక్ట్రమ్‌ను మరియు స్టెయిన్డ్ జెల్‌పై లోడ్‌ను సరిపోల్చడం ద్వారా నిర్ణయించబడింది) కలిగిన పొరను రెండుసార్లు పలుచన చేసిన 2x SDS లోడింగ్ బఫర్ (మెర్క్, UK) లో ఉంచారు. ప్రోటీన్‌లను రెప్లికా 12% బిస్-ట్రిస్ నూపేజ్ జెల్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) పై వేరు చేశారు. RC-L సబ్‌యూనిట్‌ను లోడ్ చేయడానికి మరియు దృశ్యమానం చేయడానికి ఒక జెల్‌ను కూమసీ బ్రిలియంట్ బ్లూ (బయో-రాడ్, UK) తో స్టెయిన్ చేశారు. రెండవ జెల్‌పై ఉన్న ప్రోటీన్‌ను ఇమ్యునోఅస్సే కోసం మెథనాల్-యాక్టివేటెడ్ పాలివినైలిడెన్ ఫ్లోరైడ్ (PVDF) పొర (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) కు బదిలీ చేశారు. PVDF పొరను 50 mM ట్రిస్-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) ట్వీన్-20 మరియు 5% (w/v) స్కిమ్డ్ మిల్క్ పౌడర్‌లో బ్లాక్ చేసి, ఆపై యాంటీ-హిస్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీతో (యాంటీబాడీ బఫర్ [50 mM ట్రిస్-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl మరియు 0.05% (v/v) ట్వీన్-20]ను 1:1000 A190-114A, బెథైల్ లాబొరేటరీస్, USAలో పలుచగా చేసి) 4 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 5 నిమిషాల చొప్పున 3 సార్లు కడిగిన తర్వాత, మెంబ్రేన్‌ను హార్స్‌రాడిష్ పెరాక్సిడేస్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, UK) యాంటీ-మౌస్ సెకండరీ యాంటీబాడీతో (యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 1:10,000 నిష్పత్తిలో పలుచబడింది) కలిపారు. WESTAR ETA C 2.0 కెమిల్యూమినిసెన్స్ సబ్‌స్ట్రేట్ (సైయానాజెన్, ఇటలీ) మరియు అమెర్‌షామ్ ఇమేజర్ 600 (GE హెల్త్‌కేర్, UK) ఉపయోగించి డిటెక్షన్ కోసం ఇంక్యుబేట్ చేశారు (యాంటీబాడీ బఫర్‌లో 3 సార్లు కడిగిన తర్వాత 5 నిమిషాలు).
ప్రతి స్టెయిన్డ్ జెల్ లేదా ఇమ్యునోఅస్సే లేన్ యొక్క తీవ్రత పంపిణీని గీయడం ద్వారా, శిఖరం క్రింద ఉన్న ప్రాంతాన్ని ఏకీకృతం చేయడం ద్వారా మరియు RC-L (స్టెయిన్డ్ జెల్) మరియు ప్రోటీన్-W (ఇమ్యునోఅస్సే) యొక్క తీవ్రత నిష్పత్తిని లెక్కించడం ద్వారా, ImageJ (57)లో చిత్రాన్ని ప్రాసెస్ చేయండి. స్వచ్ఛమైన RC-LH114-W నమూనాలో RC-L మరియు ప్రోటీన్-W నిష్పత్తి 1:1 అని ఊహించి మరియు తదనుగుణంగా మొత్తం డేటా సెట్‌ను సాధారణీకరించడం ద్వారా ఈ నిష్పత్తులు మోలార్ నిష్పత్తులుగా మార్చబడ్డాయి.
ఈ వ్యాసానికి సంబంధించిన అనుబంధ సమాచారం కోసం, దయచేసి http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ని చూడండి.
ఇది క్రియేటివ్ కామన్స్ అట్రిబ్యూషన్ లైసెన్స్ నిబంధనల ప్రకారం పంపిణీ చేయబడిన ఒక ఓపెన్ యాక్సెస్ వ్యాసం. అసలు రచనను సరిగ్గా ఉదహరించాలనే షరతుకు లోబడి, ఈ వ్యాసాన్ని ఏ మాధ్యమంలోనైనా అనియంత్రితంగా ఉపయోగించడానికి, పంపిణీ చేయడానికి మరియు పునరుత్పత్తి చేయడానికి అనుమతి ఉంది.
గమనిక: మీరు ఈ పేజీకి సిఫార్సు చేసే వ్యక్తికి, మీరు ఆ ఇమెయిల్‌ను వారు చూడాలని కోరుకుంటున్నారని మరియు అది స్పామ్ కాదని తెలియజేయడం కోసమే మేము మిమ్మల్ని మీ ఇమెయిల్ చిరునామాను ఇవ్వమని అడుగుతున్నాము. మేము ఏ ఇమెయిల్ చిరునామాలను సేకరించము.
మీరు సందర్శకులా కాదా అని పరీక్షించడానికి మరియు ఆటోమేటిక్ స్పామ్ సమర్పణను నివారించడానికి ఈ ప్రశ్న ఉపయోగించబడుతుంది.
డేవిడ్ జె.కె. స్వెయిన్స్‌బరీ, పార్క్ కియాన్, ఫిలిప్ జె. జాక్సన్, కైట్లిన్ ఎం. ఫారీస్, డారియస్ ఎం. నీడ్జ్విడ్జ్కి, ఎలిజబెత్ సి. మార్టిన్, డేవిడ్ ఎ. ఫార్మర్, లోర్నా ఎ. మలోన్, రెబెక్కా ఎఫ్. థాంప్సన్, నీల్ ఎ. రాన్సన్, డేనియల్ పి. కానిఫ్, మార్క్ జె. డిక్‌మన్, డ్యూయీ హోల్టెన్, క్రిస్టీన్ కిర్మాయర్, ఆండ్రూ హిచ్‌కాక్, సి. నీల్ హంటర్
చర్య కేంద్రంలోని లైట్ ట్రాప్ 1 కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణం క్వినోన్ డైనమిక్స్ గురించి కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది.
డేవిడ్ జె.కె. స్వెయిన్స్‌బరీ, పార్క్ కియాన్, ఫిలిప్ జె. జాక్సన్, కైట్లిన్ ఎం. ఫారీస్, డారియస్ ఎం. నీడ్జ్విడ్జ్కి, ఎలిజబెత్ సి. మార్టిన్, డేవిడ్ ఎ. ఫార్మర్, లోర్నా ఎ. మలోన్, రెబెక్కా ఎఫ్. థాంప్సన్, నీల్ ఎ. రాన్సన్, డేనియల్ పి. కానిఫ్, మార్క్ జె. డిక్‌మన్, డ్యూయీ హోల్టెన్, క్రిస్టీన్ కిర్మాయర్, ఆండ్రూ హిచ్‌కాక్, సి. నీల్ హంటర్
చర్య కేంద్రంలోని లైట్ ట్రాప్ 1 కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణం క్వినోన్ డైనమిక్స్ గురించి కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది.
©2021 అమెరికన్ అసోసియేషన్ ఫర్ ది అడ్వాన్స్‌మెంట్ ఆఫ్ సైన్స్. అన్ని హక్కులు ప్రత్యేకించబడ్డాయి. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef మరియు COUNTERకి భాగస్వామి. సైన్స్ అడ్వాన్సెస్ ISSN 2375-2548.